应时间。 配制不同浓度的DA溶液（0，0. 2，0. 5，1，2，3，4，5mg/mL)，测定反应4小时后的吸光度。由图 2(b)可知，随浓度增大，基底的吸光度增大，PDA接入量增大。鉴于DA浓度过高，导致基底 偏黑，透明度较差，故选取2mg/mL多巴胺溶液反应4小时进行以下实验。
[0037]将多巴胺溶于25mLtris-Hcl缓冲液中（10mM，pH8. 5)，配制成2mg/mL的DA溶 液。将盖玻片置于DA溶液中，反应4小时后，用蒸馏水清洗并干燥后使用拉曼光谱仪、场发 射扫描电子显微镜对制备的基底表面进行表征。PDA膜的SEM图见图2 (c)，从图上可见DA 经过自聚合形成PDA膜后表面均匀平滑。拉曼光谱中在1564CHT1和1417cm4处存在两个宽 峰，分别是PDA中苯环的伸缩振动和变形振动，证实了PDA膜的形成（图2d)。
[0038] 实施例2:-步法"和"两步法"测PCT抗体的接枝率
[0039] 根据实施例1，选取2mg/mLDA溶液反应4小时并清洗干燥后，一组不加戊二醛直 接加入PCT抗体溶液（0.l，5，10,20,30,40,50yg/mL)反应过夜（一步法）；另一组加入 200yL1 %戊二醛反应4小时后再加入PCT抗体溶液反应过夜（两步法）。取出反应上清 液并清洗孔板，使用Bradford法分别测量孔板的吸光度，代入标准曲线计算PCT抗体的接 枝率，结果见图3。从图可以看出，使用"一步法"得到PCT抗体的接枝率约在30~45%之 间，使用"两步法"得到PCT抗体的接枝率约在35~50%;结合图3c可知使用"两步法"获 得的PCT抗体的接枝率略微高于"一步法"，但两者相差不大。本实验证明PCT抗体可以直 接或间接与PDA反应，生成PDA/抗体生物检测界面，从而进一步应用于抗原的检测，在生 物医学检测中具有良好的应用前景。
[0040] 实施例3 :"一步法"和"两步法"测AFP抗体的接枝率
[0041] 方法如实施例2,选取2mg/mLDA溶液反应4小时并清洗干燥后，一组不加戊二醛 直接加入AFP抗体溶液2ml(0. 1，5,10, 20, 30,40, 50yg/mL)反应过夜；另一组加入200yL 1 %戊二醛反应4小时后再加入AFP抗体溶液反应过夜。实施例2相同方法计算PCT抗体的 接枝率，结果见图4。从图可以看出，使用"一步法"得到AFP抗体的接枝率约在30~40% 之间，使用"两步法"得到AFP抗体的接枝率约在37~45% ;
[0042] 实施例4 :"一步法"制备的PDA-抗体检测界面检测待测样品中PCT抗原和AFP抗 原含量。
[0043] 于不透光8磁条中使用"一步法"制备PDA-抗体检测界面，向孔板中加入Tris溶 液l〇〇yL反应15分钟，封闭醛基；加入lOOyLP0B封闭液（1XPBS，0. 5%BSA，0. 1%吐 温）于37°C下摇床封闭5min，封闭5次，之后用HRP系清洗液清洗3次，分别加入不同浓度 的PCT抗原标准溶液（AFP标准溶液）25yL(0,0? 1，0? 5,4, 20, 50,100ng/mL)和 25yL配制 样品（2,10, 75ng/mL)，5yLPCT-HRP液（AFP-HRP液），反应 30min，用HRP系清洗液清洗 3 次，加鲁米诺A/B液25yL，2分钟后于化学发光仪中测定发光值。
[0044] 不同浓度的PCT和AFP抗原标准溶液的发光值和浓度的关系如图5。从图可以看 出，随着浓度的增大，发光值也变大。发光值和浓度之间存在着良好的线性关系。使用"一 步法"测得PCT的线性方程为y= 198. 33X+6077. 4，相关系数R2= 0. 9923 ;测得AFP的线 性方程为y= 262. 48X+9817. 4,相关系数R2= 0. 9746。将PCT，AFP配制样品的测定值与 计算值比较，发现相差值均不大（表1)，具有良好的重现性和较高的准确率，表明将PDA应 用于抗原的检测具有一定的可行性。
[0045]表1
[0046]
【主权项】
1. 一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法，其特征在于：过程如下： (1) 制备检测界面：通过多巴胺（DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺（PDA) 胶层，将能与待测抗原特异性结合的抗体（一抗）接枝到聚多巴胺（PDA)胶层表面； (2) 接入抗原：将待测样品中能与上述抗体特异性结合的抗原与抗体结合； ⑶形成"夹心":加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体（二抗）； (4)加入上述酶的发光底物，通过光学方法测定底物浓度，从而得到样品中抗原的含 量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基底包括孔板、玻璃、纤维、石英和塑 料。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中聚多巴胺直接与抗体溶液反 应过夜制备抗体检测界面，或，使用戊二醛作为交联剂，聚多巴胺先与多官能团化合物反 应，再与抗体溶液反应过夜制备抗体检测界面。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多官能团化合物包括多聚甲醛、乙二 醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、环氧氯丙烷、环己烷甲醛和环戊烷羧酸。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述光学方法包括化学发光法、分光光度 法如紫外光谱法和荧光光谱法。
6. 权利要求1-5所述的方法用于生物医学检测，其特征在于：所述抗原包括血液、尿 液、唾液、汗液、体液标本中降钙素原（PCT)、甲胎蛋白（AFP)、甲状腺球蛋白TG、人绒毛膜促 性腺激素hCG、胰岛素、甲状旁腺激素（PTH)、骨钙素、癌胚抗原、铁蛋白、糖类抗原、前列腺 特异抗原PSA、鳞状细胞癌抗原SCCA、组织多态性抗原TPA、促黄体生成激素、雌二醇、睾酮、 垂体泌乳素、肌钙蛋白T、衣原体、弓形虫、ABO血型抗原、ABH抗原、人游离前列腺特异性抗 原（fPSA)、人总前列腺特异抗原（tPSA)、过氧化物酶金葡菌A蛋白、狂犬病毒抗原RV-Ag、人 淋巴细胞抗原、人组织多肽抗原（TPA)、人痢疾内阿米巴抗原、单纯疱瘆病毒抗原、人糖连抗 原724和人新型隐球菌抗原。
7. 权利要求1-5所述的方法用于食品检测，其特征在于：所述抗原包括黄曲霉、庆大霉 素、卡那霉素、新霉素、沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌、李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄 球菌、幽门螺杆菌、伏马毒素、赭曲毒素、河豚毒素、CP4EPS蛋白、免疫球蛋白、氨苄西林钠、 脱氧雪腐镰刀菌烯酮和展青霉素黄曲霉毒素。
8. 权利要求1-5所述的方法用于环境监测，其特征在于：所述抗原包括垃圾焚烧飞灰 中的二噁英，土壤中的苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，土壤中的除草剂毒莠定、莠去津、西 玛津、扑草净甘草磷和丁草胺，水环境中的甲氰菊酯，环境中的甲胺磷、氟虫腈、除虫脲、甲 基对硫磷和毒死蜱。
【专利摘要】本发明涉及利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法。该方法首先通过多巴胺(DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺(PDA)，之后利用聚多巴胺的化学反应性进一步与抗体发生反应，将抗体修饰在PDA表面，进而通过双抗夹心法检测样品中抗原的含量，为医学、食品、环境检测等提供依据。该方法较为新颖，且重现性较好，准确率较高，在生物医药、疾病诊断、食品检测、环境监测等方面具有良好的应用前景。
【IPC分类】G01N33-02, G01N33-544, G01N33-18, G01N33-24
【公开号】CN104820093
【申请号】CN201410851466
【发明人】王丰, 杨艳, 余波, 赵晓梅, 王琳, 王威正, 王佩兰
【申请人】上海师范大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2014年12月31日