食物过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及用于体外定量测定人血清中的针对食物过敏 原特异性IgE抗体的含量的食物过敏原特异性IgE抗体（定量）检测试剂盒及其制备和检 测方法。
【背景技术】
[0002] 食物过敏原是指食物中能够引起机体免疫系统异常反应的成分。食物过敏原一般 为相对分子量10000~70000的蛋白质或糖蛋白，可分为主要过敏原与次要过敏原，大多数 过敏患者对主要过敏原敏感，其是过敏疾病的一种，可能成为某些严重过敏疾病的诱因，对 食物过敏原检测与我们日常生活密切相关。
[0003] 食物过敏原是诱发过敏性哮喘、过敏性腹泻等过敏性疾病的重要变应原。近年研 宄证实食物过敏原与过敏性疾病关系密切，根据美国、新西兰和澳大利亚等许多国家的调 查相继证实了食物过敏原是许多国家重要的过敏原之一。目前全球已有几百项研宄证实了 食物过敏原与腹泻等过敏性疾病之间的密切关系。
[0004] 食物过敏的诊断主要依赖免疫学检测。目前临床上有许多体内和体外的免疫学检 测方法，包括变应原皮肤试验、血清食物过敏原特异性IgE测定等。食物过敏患者的血清特 异性抗体水平增高。可通过ELISA或RAST方法检测食物过敏原特异性抗体。有临床意义 的指标包括特异性IgE、IgG和IgA抗体。检测特异性抗体水平可以帮助确诊食物过敏原及 其过敏程度，同时可作为临床疗效评价的指标。
[0005] 目前临床多采用的ELISA方法，由于其局限性，检测灵敏度和准确性远不如化学 发光的方法，而且ELISA的非均相反应所带来的本底高特异性不好。
[0006] 过敏性疾病是指由变态反应机制引起的疾病。变态反应又称超敏反应，是免疫机 体再次接触相同变应原时发生的反应过渡剧烈而引起生理功能紊乱和（或）组织损伤的病 理性免疫反应。变态反应性疾病（又称过敏性疾病）包括特应性皮炎、食物过敏、变应性 鼻炎和过敏性哮喘等，其发病率日益增高，且病情逐趋复杂化。WHO已将变态反应性疾病列 为21世纪重点研宄和防治的疾病。近年，随着免疫组化、分子生物学技术和临床新技术，如 纤维支气管镜的开展，已对该病达成共识，即其属于过敏性炎症，在炎症区有大量炎症细胞 (包括嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞等）浸润。该病的发病主要涉及过敏 原、抗体、细胞、受体和介质5个环节。当过敏原激发后，在15-20分钟所发生的速发相反应 主要与肥大细胞有关，而在激发后4-24小时所发生的迟发相反应则被认为有嗜酸粒细胞 和嗜碱粒细胞参与。这两个时相的反应均依赖于T淋巴细胞，特别是辅助T细胞（TH)中的 一个亚型TH2。过敏原是引起过敏性炎症的原因，因此若能发现致敏变应原种类，则对防治 过敏性疾病有重要意义。
【发明内容】
[0007] 为了解决以上问题，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、操作简单的食物过敏原 特异性IgE抗体定量检测试剂盒、制备及检测方法。
[0008] -种食物过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒，含有如下组分：磁分离试剂、过敏原 试剂、酶反应物、校准品、质控品、浓缩清洗液以及底物液；所述磁分离试剂含有包被有抗人 IgE抗体的磁微粒，所述过敏原试剂含有生物素标记的特异性过敏原。
[0009] 其中，所述底物液包括A液和B液，A液为硼砂、硼酸、鲁米诺和对碘苯酚的混合液， B液为硼砂、硼酸、过氧化脲和Proclin-300的混合液。
[0010] 本发明还提供了食物过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法，包括
[0011] 如下步骤：
[0012] 步骤一、磁分离试剂的制备
[0013] 一、磁微粒缓冲液配制
[0014] (1)、称取 13.44g/L磷酸氢二钾，6.81g/LNaCl，0.5g/Lfcij35于 1L容器中；（2)、 量取0. 5-lmlProclin-300于1L容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；（3)、 调节PH值到7. 9-8. 2之间；（4)、称取2gBSA至上述1L容器中；（5)、最后定容至1000ml， 0. 22um微孔滤器过滤；做好标记于2-8°C冷库贮存；
[0015] 二、磁分离试剂的制备
[0016] (1)、将1.Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ulDMSO中，取2mg抗人IgE抗体溶 于PH9. 0-9. 5的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中至总体积为lml; (2)、确定辛二酸二琥珀酰 亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述抗人IgE抗体溶液中， 置室温90min; (3)、然后将抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，放入到高速冷冻离心 机中在3000g下浓缩30min至体积为0. 5ml; (4)、取0. 8ml磁珠加入5ml反应杯中，放入专 用试管架，经磁铁充分吸附约5分钟后移取掉上清；（5)、每次加入2mlPH9. 5的0. 05mol/ L的磷酸盐缓冲液，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述 磁珠中，混匀后室温反应过夜；(6)、加入0. 3mllmol/L的磷酸盐溶液37°C15分钟；（7)、每 次加入1. 5mlPH7. 2的0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架， 去上清，重复操作3次；(8)、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0. 05%的 IgE磁分离试剂；磁珠保存液配方为0. 1%BSA，0. 05%fcij35,0. 02%NaN3,4°C保存；（9)、 将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；
[0017] 步骤二、过敏原试剂的制备
[0018] -、过敏原稀释液的配置
[0019] (1)、称取 13.44g/L磷酸氢二钾，6.81g/LNaCl，0.5ml/Lfcij35 于 1L容器中； (2) 、量取0. 5-lmlProclin-300于1L容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌； (3) 、称取0.5~lg硫酸镁于1L容器中；（4)调节PH值到7. 95-8. 05之间；（5)、称取2gBSA 至上述1L容器中；（6)称去0. 5~lg明胶于上述1L容器（6)、最后定容至1000ml，0. 22um 微孔滤器过滤；做好标记于2-8°C冷库贮存；
[0020] 二、生物素偶联的过敏原的配置
[0021] 将生物素标记的食物过敏原按照0. 1-1.Oug/ml的浓度，使用过敏原稀释液进行 稀释；
[0022] 步骤三、酶反应物的制备
[0023] 一、酶反应物稀释液配置
[0024](1)、称取13. 44g/L磷酸氢二钾于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分 搅拌使试剂完全溶解；(2)称取0.5~lg硫酸镁于1L容器中（3)、调PH，控制在7. 0-7.2; (4)、称取2gBSA至上述烧瓶中；（5)、称取0. 5~lg明胶于1L容器中；（6)、最后烧杯定容 至1000ml，用0.22um微孔滤器过滤即得；
[0025] 二、酶反应物的配置
[0026] 按照1:2000-1:5000的稀释体积比例，使用酶反应物稀释液对辣根过氧化物酶标 记的链霉亲和素进行稀释，混合均匀即得酶反应物；
[0027] 步骤四、校准品、质控品的制备
[0028] -、校准品、质控品稀释液的配置
[0029] (1)、称取称取13. 44g/L磷酸氢二钾于1L的容器中，定容至1L;(2)、调节pH值至 7. 0-7. 2 ; (3)用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即为校准品稀释液，2-8°C储存 备用；
[0030] 二、校准品、质控品的配置
[0031]校准品的浓度为0、0. 35、0. 7、3. 5、17. 5、100KU/L，质控品的浓度分别为0. 35、 17. 5KU/L，使用校准品、质控品稀释液按照以上浓度进行稀释，校准品、质控品所含物质为 纯化的人IgE抗体；
[0032] 步骤五、浓缩清洗液的配制
[0033] (1)、称取KC1 4g、NaCl40g、蔗糖 10g于 1L容器中；（2)、称取 0? 225gTween-20 于100ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；（3)、量取Proclin-300 0. 225ml至上述1L容器中；（4)、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至 完全溶解；（5)、调PH至7. 35-7. 45之间；（6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0. 22um微 孔滤器过滤即得；
[0034] 步骤六、底物液的制备
[0035] -、底物A液的配置
[0036] (1)、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺l.Og和对碘苯酚0?lmg于1L烧杯 中；（2)、用量筒量取400ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调节PH值至 7. 95-8. 05之间；（3)、用0. 22um微孔滤器过滤，收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即 得；
[0037] 二、底物B液的配置
[0038](1)、称取硼砂 5. 721g、硼酸 2. 474g、过氧化脲 0?lg和Proclin-300 250ul于 1L 烧杯中；（2)、用量筒量取400ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH值至 7. 95-8. 05之间；（3)、用0. 22um微孔滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即 得。。
[0039] 本发明还提供了食物过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的使用方法，包括如下步 骤：
[0040](1)、加入50 y 1磁分离试剂至化学发光反应管底；
[0041](2)、加入50y1标准品、质控品、待检血清至化学发光反应管底；
[0042](3)、用多功能均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟；
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