屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种或数种过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒、制备和检测方法，包括磁分离试剂的制备、过敏原试剂的制备、酶反应物的制备、校准品和质控品的制备、浓缩清洗液的制备、底物A液和底物B液的制备六个步骤。本发明过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒所采用的检测方法，通过过敏原特异性IgE抗体捕获过敏原的方法来实现的，同时采用化学发光免疫技术和磁分离技术相结合的方法，大大提高了过敏原特异性抗体的检测灵敏度和特异性，使得检测结果更真实可信；同时优化了反应时间和反应步骤，使操作更简单。
【专利说明】屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及屋尘螨过敏原特异性IgE抗体(定量)检测试剂盒及其制备方法，用于体外定量测定人血清中的针对屋尘螨过敏原特异性的IgE抗体的含量。
【背景技术】
[0002]屋尘螨是常见的吸入性过敏原(因此，屋尘螨特异性IgE抗体的检测通常被称之为屋尘螨过敏原的检测)，其所能引起的过敏症状多为呼吸道的相关病症，其检测结果对于我们日常生活的改善紧密相关。
[0003]尘螨是诱发过敏性哮喘、过敏性鼻炎和湿疹过敏性结膜炎等过敏性疾病的重要变应原。近年研究证实尘螨与过敏性疾病关系密切，根据美国、新西兰和澳大利亚等许多国家的调查相继证实了尘螨是许多国家重要的过敏原之一。目前全球已有几百项研究证实了尘螨与哮喘等过敏性疾病之间的密切关系。
[0004]尘螨过敏的诊断主要依赖免疫学检测。目前临床上有许多体内和体外的免疫学检测方法，包括尘螨变应原皮肤试验、血清尘螨特异性IgE测定、尘螨支气管或鼻腔激发试验、肥大细胞脱颗粒试验、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平测定等。尘螨过敏患者的血清特异性抗体水平增高。可通过ELISA或RAST方法检测尘螨特异性抗体。有临床意义的指标包括特异性IgE、IgG和IgA抗体。检测特异性抗体水平可以帮助确诊尘螨过敏及其过敏程度，同时可作为临床疗效评价的指标。
[0005]目前临床多采用的ELISA方法，由于其局限性，检测灵敏度和准确性远不如化学发光的方法，而且我们克服了 ELISA的非均相反应所带来的本底高特异性不好的缺点。
[0006]过敏性疾病是指由变态反应机制引起的疾病。变态反应又称超敏反应，是免疫机体再次接触相同变应原时发生的反应过渡剧烈而引起生理功能紊乱和(或)组织损伤的病理性免疫反应。变态反应性疾病(又称过敏性疾病)包括特应性皮炎、食物过敏、变应性鼻炎和过敏性哮喘等，其发病率日益增高，且病情逐趋复杂化。WHO已将变态反应性疾病列为21世纪重点研究和防治的疾病。近年，随着免疫组化、分子生物学技术和临床新技术，如纤维支气管镜的开展，已对该病达成共识，即其属于过敏性炎症，在炎症区有大量炎症细胞(包括嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞等)浸润。该病的发病主要涉及过敏原、抗体、细胞、受体和介质5个环节。当过敏原激发后，在15-20分钟所发生的速发相反应主要与肥大细胞有关，而在激发后4-24小时所发生的迟发相反应则被认为有嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞参与。这两个时相的反应均依赖于T淋巴细胞，特别是辅助T细胞(TH)中的一个亚型TH2。过敏原是引起过敏性炎症的原因，因此若能发现致敏变应原种类，则对防治过敏性疾病有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、操作简单的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒、其制备及其使用方法。
[0008]本发明的目的是这样实现的:
一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒，所述试剂盒含有如下组分:磁分离试剂，过敏原试剂，酶反应物，校准品、质控品，浓缩清洗液，底物A液和底物B液；其中，过敏原试剂含有生物素标记的特异性过敏原，磁分离试剂含有包被有抗人IgE抗体的磁微粒，所述底物A液为含鲁米诺试剂，底物B液为含过氧化物试剂，所述酶反应物为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素试剂。所述浓缩清洗液为含有吐温的磷酸盐缓冲液浓缩清洗试剂。
[0009]一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法，其中制备过程如下:
步骤一、磁分离试剂的制备一、磁微粒缓冲液配制
(I)、称取 TRIS (三羟甲基氨基甲烷)4.58g/L，NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 (聚乙二醇单辛基苯基醚)0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取防腐剂Proclin-300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；(3)、调节pH值到7.95-8.05之间；(4)、称取牛血清白蛋白BSA 3-5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔滤器过滤；做好标记于2-8°C冷库贮存。
[0010]二、磁分离试剂的制备
(I)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50 μ I 二甲基亚砜DMSO中，取2mg抗人IgE抗体溶于PH 9.0-9.5的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中至总体积为Iml ; (2)、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述抗人IgE抗体溶液中，置室温90min ;(3)、然后将抗体溶液加入到Centricon-1O浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml ； (4)、取0.5ml磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；(5)、每次加入1.5ml pH9.5的0.lmol/L的PB缓冲液(磷酸盐缓冲液)，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；(6)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液37°C 15分钟；(7)、每次加入1.5ml ρΗ7.2的0.lmol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；(8)、用10ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为
0.05%的IgE磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1% BSA，0.05%吐温-20，0.02% NaN3,20%乙醇，4°C保存；(9)、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；
步骤二、过敏原试剂的制备
一、过敏原稀释液的配置
(I)、称取 TRIS (三羟甲基氨基甲烷)4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取Proclin-300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；(3)、调节pH值到7.95-8.05之间；(4)、称取BSA 3_5g至上述IL容器中；
(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔滤器过滤；做好标记于2_8°C冷库贮存；
二、生物素偶联的过敏原的配置
将生物素标记的屋尘螨过敏原按照0.1-1.0 μ g/ml的浓度，使用过敏原稀释液进行稀释。
[0011]步骤三、酶反应物的制备
一、酶反应物稀释液配置
(I)、取TRIS 4.846g、HCl 2847 μ I于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；(2)、调pH，控制在7.35-7.45 ; (3)、称取BSA 4g至上述烧瓶中；
(4)、最后烧杯定容至1000ml,用0.22 μ m微孔滤器过滤即得。
[0012]二、酶反应物的配置
按照1:2000-1:5000的稀释体积比例，使用酶反应物稀释液对辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行稀释，混合均匀即得酶反应物。
[0013]步骤四、校准品、质控品的制备一、校准品、质控品稀释液的配置
(I)、称取Tris 7.268g和HCl 4270 μ I于IL的容器中，定容至600ml ; (2)、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即为校准品稀释液，2-8°C储存备用。
[0014]二、校准品、质控品的配置
校准品的浓度为0,0.35,0.7,3.5,17.5、100KU/L，质控品的浓度分别为0.35,17.5KU/L.使用校准品、质控品稀释液按照以上浓度进行稀释。校准品、质控品所含物质为纯化的人IgE抗体。
[0015]步骤五、浓缩清洗液的配制
(I)、称取 KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 1g 于 IL 容器中；(2)、称取 0.225g Tween-20 于10ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、量取Proclin-300
0.225ml至上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解；(5)、调pH至7.35-7.45之间；(6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22 μ m微孔滤器过滤即得。
[0016]步骤六、底物液(含A液和B液)的制备
一、底物A液的配置
(I)、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于IL烧杯中；(2)、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至7.95-8.05之间；(3)、用0.22 μ m微孔滤器过滤,收集滤液,用纯化水定容至500ml,混勻后即得。
[0017]二、底物B液的配置
(1)、称取硼砂5.721g、硼酸 2.474g、过氧化脲 0.1g 和 Proclin-300 250ul 于 IL 烧杯中；(2)、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH值至7.95-8.05之间；(3)、用0.22 μ m微孔滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即得。
[0018]一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的使用方法，其包括检测步骤如下:
采用的反应容器为常见的化学发光反应平底试管。
[0019](I)、加入50μ I磁分离试剂至化学发光反应管底；
(2)、加入50μ I标准品、质控品、待检血清至化学发光反应管底；
(3)、用多功能均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟； (4)、反应管放至磁分离器上，确保每个管底都与分离器表面接触，沉淀2-3分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，用力在吸水纸上将反应管内的液体拍干，以除去粘在反应管中的液滴；
(5)、浓缩清洗液用纯化水稀释20倍后，加300-500μI稀释后的清洗液至每一反应管中，置多功能均匀混合器上轻轻振荡混匀30s ；
(6)、重复步骤(4)、(5)、(4)一遍；
(7)、加入50μ I过敏原试剂至反应管底；
(8)、加入50μ I酶反应物至反应管底；
(9)、用多管均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟；
(10)、重复步骤(4)、(5)、(6)—遍；
(11)、加入50μ I底物液A和50 μ I底物液B至反应管底手动混匀(或放置在多管均匀混合器上轻轻震荡5-lOs)，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
(12)、根据校准品采用四参数拟合方式拟合一条曲线，通过曲线计算待检样本所含的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体的浓度。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒，其检测方法为化学发光免疫分析技术和磁微粒分离技术相结合的一种检测方法，同时采用了酶免的捕获方法，具有操作方便、灵敏度高、准确性好、快速和无污染的特点。
[0021]工作原理:
本发明为捕获法化学发光免疫分析法与磁微粒分离技术相结合的一种检测方法。用包被有抗人IgE的磁微粒与血清中的人IgE反应，在外加磁场的作用下直接沉淀，然后加入生物素标记的屋尘螨过敏原，偶联在磁微粒上的人IgE中的过敏原特异性IgE抗体捕获生物素标记的屋尘螨过敏原，经洗涤后，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，催化底物发光。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，反应的发光强度与样本中的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体浓度成正比。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒，所述试剂盒含有如下组分:磁分离试剂，过敏原试剂，酶反应物，校准品、质控品，浓缩清洗液，底物A液和底物B液；其中，过敏原试剂含有生物素标记的特异性过敏原，磁分离试剂含有包被有抗人IgE抗体的磁微粒，所述底物A液为含鲁米诺试剂，底物B液为含过氧化物试剂，所述酶反应物为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素试剂。所述浓缩清洗液为含有吐温的磷酸盐缓冲液浓缩清洗试剂。
[0023]实施例2:
上述实施例1记载的一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒，其制备方法如下:
步骤一、磁分离试剂的制备一、磁微粒缓冲液配制
(I)、称取 TRIS (三羟甲基氨基甲烷)4.58g/L，NaCl 6.81g/L, TRITON X-1OO (聚乙二醇单辛基苯基醚)0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取防腐剂Proclin-300 0.5_lml于IL容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；(3)、调节pH值到7.95-8.05之间；(4)、称取牛血清白蛋白BSA 3-5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔滤器过滤；做好标记于2-8°C冷库贮存。
[0024]二、磁分离试剂的制备
(I )、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50 μ I 二甲基亚砜DMSO中，取2mg抗人IgE抗体溶于PH 9.0-9.5的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中至总体积为Iml ; (2)、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述抗人IgE抗体溶液中，置室温90min ;(3)、然后将抗体溶液加入到Centricon-1O浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml ； (4)、取0.5ml磁珠加入5ml反应杯中,放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；(5)、每次加入1.5ml pH9.5的0.lmol/L的PB缓冲液(磷酸盐缓冲液)，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；(6)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液37°C 15分钟；(7)、每次加入1.5ml ρΗ7.2的0.lmol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；(8)、用10ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为
0.05%的IgE磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1% BSA，0.05%吐温-20，0.02% NaN3,20%乙醇，4°C保存；(9)、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；
步骤二、过敏原试剂的制备
一、过敏原稀释液的配置
(I)、称取 TRIS (三羟甲基氨基甲烷)4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取Proclin-300 0.5_lml于IL容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；(3)、调节PH值到7.95-8.05之间；(4)、称取BSA 3_5g至上述IL容器中；
(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔滤器过滤；做好标记于2_8°C冷库贮存；
二、生物素偶联的过敏原的配置
将生物素标记的屋尘螨过敏原按照0.1-1.0 μ g/ml的浓度，使用过敏原稀释液进行稀释。
[0025]步骤三、酶反应物的制备
一、酶反应物稀释液配置
(I)、取TRIS 4.846g、HCl 2847 μ I于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；(2)、调pH，控制在7.35-7.45 ; (3)、称取BSA 4g至上述烧瓶中；(4)、最后烧杯定容至1000ml,用0.22 μ m微孔滤器过滤即得。
[0026]二、酶反应物的配置
按照1:2000-1:5000的稀释体积比例，使用酶反应物稀释液对辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行稀释，混合均匀即得酶反应物。
[0027]步骤四、校准品、质控品的制备一、校准品、质控品稀释液的配置 (I)、称取Tris 7.268g和HCl 4270 μ I于IL的容器中，定容至600ml ; (2)、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即为校准品稀释液，2-8°C储存备用。
[0028]二、校准品、质控品的配置
校准品的浓度为0,0.35,0.7,3.5,17.5、100KU/L，质控品的浓度分别为0.35,17.5KU/L.使用校准品、质控品稀释液按照以上浓度进行稀释。校准品、质控品所含物质为纯化的人IgE抗体。
[0029]步骤五、浓缩清洗液的配制
(I)、称取 KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 1g 于 IL 容器中；(2)、称取 0.225g Tween-20 于10ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、量取Proclin-300
0.225ml至上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解；(5)、调pH至7.35-7.45之间；(6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22 μ m微孔滤器过滤即得。
[0030]步骤六、底物A液的配置
(I)、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于IL烧杯中；(2)、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至7.95-8.05之间；(3)、用0.22 μ m微孔滤器过滤,收集滤液,用纯化水定容至500ml,混勻后即得。
[0031]步骤七、底物B液的配置
(I)、称取硼砂 5.721g、硼酸 2.474g、过氧化脲 0.1g 和 Proclin-300 250ul 于 IL 烧杯中；(2)、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH值至7.95-8.05之间；(3)、用0.22 μ m微孔滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即得。
[0032]实施例3:
实施例2制备的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的使用方法如下:
(1)、加入50μ I磁分离试剂至化学发光反应管底；
(2)、加入50μ I标准品、质控品、待检血清至化学发光反应管底；
(3)、用多功能均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟；
(4)、反应管放至磁分离器上，确保每个管底都与分离器表面接触，沉淀2-3分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，用力在吸水纸上将反应管内的液体拍干，以除去粘在反应管中的液滴；
(5)、浓缩清洗液用纯化水稀释20倍后，加300-500μI稀释后的清洗液至每一反应管中，置多功能均匀混合器上轻轻振荡混匀30s ；
(6)、重复步骤(4)、(5)、(4)一遍；
(7)、加入50μ I过敏原试剂至反应管底；
(8)、加入50μ I酶反应物至反应管底；
(9)、用多管均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟；
(10)、重复步骤(4)、(5)、(6)—遍；
(11)、加入50μ I底物A液和50 μ I底物B液至反应管底手动混匀(或放置在多管均匀混合器上轻轻震荡5-lOs)，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
(12)、根据校准品采用四参数拟合方式拟合一条曲线，通过曲线计算待检样本所含的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体的浓度。
【权利要求】
1.一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有如下组分:磁分离试剂，过敏原试剂，酶反应物，校准品、质控品，浓缩清洗液，底物A液和底物B液；其中，过敏原试剂含有生物素标记的特异性过敏原，磁分离试剂含有包被有抗人IgE抗体的磁微粒，所述底物A液为含鲁米诺试剂，底物B液为含过氧化物试剂，所述酶反应物为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素试剂。
2.根据权利要求1所述的一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒，其特征在于:所述浓缩清洗液为含有吐温的磷酸盐缓冲液浓缩清洗试剂。
3.制备如权利要求1或2所述的一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的方法，其特征在于包括如下步骤: 步骤一、磁分离试剂的制备 一、磁微粒缓冲液配制
(I)、称取 TRIS 4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-1OO 0.5ml/L 于 IL 容器中;(2)、量取防腐剂Proclin300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；(3)、调节pH值到7.95-8.05之间；(4)、称取牛血清白蛋白BSA 3_5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔滤器过滤；做好标记于2_8°C冷库贮存； 二、磁分离试剂的制备 (I)、将1.0mg辛二酸二琥拍酰亚胺酯溶于50 μ I 二甲基亚砜中，取2mg抗人IgE抗体溶于pH 9.0-9.5的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中至总体积为Iml ; (2)、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述抗人IgE抗体溶液中，置室温90min ; (3)、然后将抗体溶液加入到Centricon-1O浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml ； (4)、取0.5ml磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；(5)、每次加入1.5ml pH9.5的0.lmol/L的PB缓冲液，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混勻后室温反应4小时；(6)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液37°C 15分钟；(7)、每次加入1.5ml pH7.2的0.lmol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；(8)、用10ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05%的IgE磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1% BSA，0.05%吐温-20，0.02% NaN3, 20%乙醇，4°C保存；(9)、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂； 步骤二、过敏原试剂的制备 一、过敏原稀释液的配置
(I)、称取 TRIS 4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 0.5ml/L 于 IL 容器中；(2)、量取Proclin-300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml纯化水于上述容器，充分搅拌；(3)、调节pH值到7.95-8.05之间；(4)、称取BSA 3_5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml, 0.22 μ m微孔滤器过滤；做好标记于2_8°C冷库贮存； 二、生物素偶联的过敏原的配置 将生物素标记的屋尘螨过敏原按照0.1-1.ομ g/ml的浓度，使用过敏原稀释液进行稀释； 步骤三、酶反应物的制备 一、酶反应物稀释液配置 (I)、取TRIS 4.846g、HCl 2847 μ I于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；(2)、调pH，控制在7.35-7.45 ; (3)、称取BSA 4g至上述烧瓶中；(4)、最后烧杯定容至1000ml,用0.22 μ m微孔滤器过滤即得； 二、酶反应物的配置 按照1:2000-1:5000的稀释体积比例，使用酶反应物稀释液对辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行稀释，混合均匀即得酶反应物； 步骤四、校准品、质控品的制备 一、校准品、质控品稀释液的配置 (I)、称取Tris 7.268g和HCl 4270 μ I于IL的容器中，定容至600ml ; (2)、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即为校准品稀释液，2-8°C储存备用； 二、校准品、质控品的配置 校准品的浓度为0,0.35,0.7,3.5,17.5、100KU/L，质控品的浓度分别为0.35,17.5KU/L ;使用校准品、质控品稀释液按照以上浓度进行稀释； 校准品、质控品所含物质为纯化的人IgE抗体； 步骤五、浓缩清洗液的配制 (I)、称取 KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 1g 于 IL 容器中；(2)、称取 0.225g Tween-20于10ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、量取Proclin-3000.225ml至上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解;(5)、调pH至7.35-7.45之间；(6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22 μ m微孔滤器过滤即得； 步骤六、底物液的制备 一、底物A液的配置 (I)、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于IL烧杯中；(2)、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至7.95-8.05之间；(3)、用0.22 μ m微孔滤器过滤，收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即得； 二、底物B液的配置 (I)、称取硼砂 5.721g、硼酸 2.474g、过氧化脲 0.1g 和 Proclin-300 250ul 于 IL 烧杯中；(2)、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH值至7.95-8.05之间；(3)、用0.22 μ m微孔滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即得。
4.一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于其包括检测步骤如下: (1)、加入50μ I磁分离试剂至化学发光反应管底； (2)、加入50μ I标准品、质控品、待检血清至化学发光反应管底； (3)、用多功能均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟； (4)、反应管放至磁分离器上，确保每个管底都与分离器表面接触，沉淀2-3分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，用力在吸水纸上将反应管内的液体拍干，以除去粘在反应管中的液滴； (5)、浓缩清洗液用纯化水稀释20倍后，加300-500μ I稀释后的清洗液至每一反应管中，置多功能均匀混合器上轻轻振荡混匀30s ； (6)、重复步骤(4)、(5)、(4)一遍； (7)、加入50μ I过敏原试剂至反应管底； (8)、加入50μ I酶反应物至反应管底； (9)、用多管均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37°C恒温箱反应15分钟； (10)、重复步骤(4)、(5)、(6)—遍； (11)、加入50μ I底物液A和50 μ I底物液B至反应管底手动混匀或放置在多管均匀混合器上轻轻震荡5-lOs，迅速用准备好的发光检测仪进行检测； (12)、根据校准品采用四参数拟合方式拟合一条曲线，通过曲线计算待检样本所含的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体的浓度。
【文档编号】G01N33/558GK104165987SQ201410397013
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】叶兴旺, 奚伟红 申请人:江苏福隆生物技术有限公司