金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物医学免疫检测技术领域，具体是涉及一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金试纸卡及制备方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)是一种最为常见的革兰氏阳性致病菌，在自然界中广泛分布，具有很强的致病作用和致死率。S.aureus感染在畜牧业中流行严重，给畜牧业带来了较大的经济损失，尤其在奶牛乳房炎方面，该菌是主要的致病菌之一。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。因此，对金黄色葡萄球菌进行快速、准确的诊断可以及时采取治疗和控制措施，减少不必要的经济损失。
[0003]免疫层析胶体金技术是适应我国现代养殖模式的畜禽疫病快速检测的最佳选择。ELISA技术和分子生物学技术这类适合实验室、医院、大型养殖场的检测方法对广大农民来说并不合适，起码在短期内这些技术离我国广大农民比较遥远。农村需要的是操作简便，人人都能快速实施的检测方法。如能开发检测快速、灵敏度高、特异性强、使用简便、价格低廉的胶体金试纸卡将具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡及其制备方法和应用，可以临床快速检测畜禽、奶牛养殖场及食品业中的金黄色葡萄球菌，用于该菌的临床诊断。
[0005]本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是:
[0006]1、金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡，其特征在于:所述金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡由胶体金试纸条和扣板式卡槽组成；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(硝酸纤维素膜)、金标抗体垫、样品垫和吸收垫组成；
[0007]所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有金标抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；所述NC膜的中部有一条含有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫；
[0008]所述样品垫中金标抗体为兔抗金黄色葡萄球菌isdB蛋白单克隆抗体；
[0009]所述NC膜中金黄色葡萄球菌抗体为兔源金黄色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
[0010]2、上述的金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0011](I)制备 NC 膜
[0012]兔源金黄色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗体的制备:采用原核表达并纯化的金黄色葡萄球菌isdB蛋白作为免疫原，提取IgG抗体，制备兔源金黄色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗体；
[0013]检测线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为53?55dotS/mL/cm，用包被缓冲液稀释兔源金黄色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗体，浓度为60?65 μ g/ml，在NC膜中检测线位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.40?0.45 μ I滤膜过滤的0.05Μ、ρΗ9.6的CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液)；
[0014]质控线的制备:采用三维喷膜仪，调整喷液量为50?55dotS/mL/cm，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，浓度为1.6mg/ml，在NC膜上与检测线平行的位置划线，间隔5mm，即为质控线，所述的包被缓冲液为经过0.40?0.45 μ I滤膜过滤的0.03Μ、ρΗ9.4的CBS缓冲液；
[0015]NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜；用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为2.5?2.8% BSA、2.2?2.6%脱脂奶粉和0.01Μ、ρΗ7.0的CBS缓冲液混合后用0.42?0.45 μ I滤膜过滤得到的封闭工作液；
[0016](2)制备涂覆金标抗体垫
[0017]用20mM含质量百分比为1.5% BSA,0.1 % NaNjP 3 %四硼酸钠的稀释缓冲液(水溶液)，将金标鼠源金黄色葡萄球菌单克隆抗体稀释至终浓度0.08mg/mL ;裁取规格为300X7mm的玻璃纤维棉，将金标抗体溶液用单向喷点仪，以6 μ L/cm的速度(大约22ng/条)，均匀喷洒于玻璃纤维棉，56°C干燥lh，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0018](3)组装金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡
[0019]将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次粘贴含有金标抗体的玻璃纤维膜和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中即为金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡。
[0020](4)金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡使用及判定
[0021]金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡在诊断畜禽、奶牛养殖场临床样本或食品中的金黄色葡萄球菌中应用，将增菌后的培养液50 μ I加至1.5mlEP管中，加入200 μ I灭菌水混匀即得待检样品，将所得的待检样品100 μ I滴加在本试纸卡的载样垫中，在试纸卡的检测线、质控线位置均出现红色条带时，金黄色葡萄球菌检测为阳性；仅质控线出现一条红色条带时，为阴性结果；在试纸卡的质控线未出现红色条带时为无效结果。
[0022]其中，步骤(I)中检测线和质控线的线宽为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6?7_。
[0023]有益效果:
[0024]本发明所述的胶体金试纸卡利用人工合成金黄色葡萄球菌的主要抗原表位isdB蛋白，制备特性新高、敏感性好的鼠源金黄色葡萄球菌单克隆抗体。通过工艺成熟的胶体金免疫层析技术，通过试纸卡中纤维素膜上分别喷涂含金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测线和含羊抗鼠IgG抗体的质控线，能够临床检测金黄色葡萄球菌，为畜禽、奶牛养殖场及食品业等提供一种临床诊断金黄色葡萄球菌的试纸卡，该试纸卡具有特异性强、灵敏度高、检测快速的优点，且不需要使用仪器设备，成本低廉，操作方便，能广泛应用于畜禽、奶牛养殖场及食品业对金黄色葡萄球菌的快速、准确诊断，减少重大经济损失。
【附图说明】
[0025]图1是本发明的胶体金试纸卡的结构示意图；
[0026]图中:1、扣板式卡槽2、支持板，3、加样孔4、样品垫5、金标抗体垫6、NC膜7、观察区8、吸收垫
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]—种金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡，其由胶体金试纸条和扣板式卡槽组成；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标抗体垫、样品垫和吸收垫组成；
[0029]所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有金标抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；所述NC膜的中部有一条含有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫；
[0030]所述样品垫中金标抗体为兔抗金黄色葡萄球菌isdB蛋白单克隆抗体；
[0031]所述NC膜中金黄色葡萄球菌抗体为兔源金黄色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
[0032]实施例2
[0033]金黄色葡萄球菌胶体金检测试纸卡的制备方法，其包括以下步骤:
[0034](I)制备 NC 膜
[0035]兔源金黄色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗体的制备:采用原核表达并纯化的金黄色葡萄球菌isdB蛋白作为免疫原，提取IgG抗体，制备兔