植物中特异响应疫霉菌侵染的启动子及遗传构建体及利用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物一个特异响应疫霉菌侵染的启动子，本发明还涉及植物一个特异 响应疫霉菌侵染的启动子的应用，利用该启动子通过特异响应疫霉菌侵染，表达抗病相关 基因，实现植物对疫霉菌侵染的抗性，属于生物技术领域和农业应用领域。
【背景技术】
[0002] 在人类生产活动中，植物病害是一类重要课题。在各种植物病害中，由疫霉属卵菌 引起的疫病是一类重要病害，因为该卵菌对农作物、果蔬、林木都有相当大的危害，可侵染 这些植物的根、茎、叶、花和果，引起多种危害症状，可导致多种植物绝产或灭绝。
[0003] 植物与病原微生物互作的研宄近年来迅速发展。研宄表明，植物的抗病性是通过 识别病原物的侵染实现的，这种识别大多涉及植物受侵染组织的局部细胞死亡。然而，病菌 通过遗传变异逃避被识别，导致农业生产中广泛发生的作物抗病性丧失现象；加之抗病资 源缺乏，利用经典的抗病基因在防控作物病害特别是疫霉菌病害中，受到许多限制，一些疫 霉菌病害的防控高度依赖化学农药。
[0004] 病害造成广泛的作物损失。抗病基因的发掘和利用，是作物病害防控的最为有效 的途径。现有抗病品种的培育主要依赖经典的杂交育种方法。然而，由于病菌的遗传变异， 作物品种的抗病性丧失问题十分突出，加之缺乏有效的抗病资源，一些疫霉菌病害的防控 高度依赖化学农药。
[0005] 通过转基因技术表达一些抗病相关基因，提高作物的抗病性已有一些报道，但罕 有应用实例且应用十分有限，而且转基因表达主要使用组成型启动子，无法实现转基因的 时空特异特别是病菌侵染时的特异激活表达。
[0006] 实现目的基因的精准时空表达，是植物转基因调控的难题之一。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种植物特异响应疫霉菌侵染的 启动子，通过转基因技术稳定地整合到植物基因组中，实现目标抗病性状在疫霉菌侵染时 的特异表达。本发明在国内外首次实验初步证明具有抑制疫霉菌侵染作物的效果，从而在 作物病害的防治领域开辟了一个全新的途径。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：植物中特异响应疫霉菌侵染的 启动子，其创新点在于：获得植物一个特异响应疫霉菌侵染的启动子，能够特异驱动或调节 下游目标基因的特异时空表达，以下为其5' -3'的核苷酸序列SEQID:1 :
[0009] GGCCGTCGGGGCAAGAGCCAGGCCTCGATGAGTAGGAGGGCGCGGCAGTCGCTGCAAAACCTAGGGCGC GAGCCCGGGCAGAGCGGCCGTCGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGAACTTTGAAGGCCGAA GAGGGGAAAGGTTCCATGTGAACGGCACTTGCACATGGGTTATTCGATCCTAAGAGTCGGGGGAAACCCGTCTGATA GCGCTTAAGCGCGAACTTCGAAAGGGGATTTGGTTAAAATTCCGGAACCGGGACGTGGCGGTTGACGGCAACGTTAG GGAGTCCGGAGACGTCGGCGGGGGCCTCGGGAAGAGTTATCTTTTCTGTTTAACAGCCTGCCCACCCTGGAAACGGC TCAGCCGGAGGTAGGGTCCAGCGGCTGGAAGAGCACCGCACGTCGCGTGGTGTCCGGTGCGCCCCCGGCGGCCCTTG AAAATCCGGAGGACCGAGTGCCGCTCACGCCCGGTCGTACTCATAACCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCT GGTCGATGGAACAATGTAGGCAAGGGAAGTCGGCAAAATGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGC TGGGCTCGGGGGTCCCAGTTCCGAACCCGTCGGCTGTCAGCGGACTGCTCGAGCTGCTTTCGCGGCGAGAGCGGGTC GCCGCGTGCCGGCCGGGGGACGGACTGGGAACGGCTCTCTCGGGAGCTTTACCCGGGCGTCGAACAGTCAGCTCAGA ACTGGTACGGACAAGGGGAATCCGACTGTTTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGGTCCCTGCGGATGCTAACGCAAT GTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGTGGGAGTAACTATG ACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCC CTGTCTACTATCCAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGC TTGACTCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACTTGAGAGGTGTAGGATAAGTGGGAGCTTCGGCGCAAGTGAAATACCAC TACTTTTAACGTTATTTTACTTACTCCGTGAATCGGAGGCGGGGTACAACCCC。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种植物特异响应疫霉菌侵染的启动子的遗传构建 体，其特征在于：包括该启动子、与该启动子有效连接的核酸序列以及终止子。
[0011] 本发明的还有一个目的是提供一种植物特异响应疫霉菌侵染的启动子的利用，其 特征在于：包括以下步骤：
[0012] (1)将启动子与抗病相关基因融合连接，形成遗传构建体；
[0013] (2)将得到的遗传构建体导入植物细胞、稳定整合到植物基因组中，实现下游目标 抗病相关基因的特异时空表达，从而提高植物自身抗病性。
[0014] 本发明的有益效果如下：
[0015] (1)本发明包含了已鉴定获得的植物特异响应疫霉菌侵染的HAT4启动子序列。将 HAT4启动子与GUS报告基因融合，通过植物稳定表达和瞬时表达，结合疫霉菌侵染测试，检 测GUS活性，均确认了HAT4启动子的疫霉菌侵染特异响应的表达特征。
[0016] (2)本发明将HAT4基因启动子与我们筛选鉴定获得的抗病相关基因融合，进一步 确认了HAT4启动子响应疫霉菌侵染的特异性。同时，通过该种分析方法，本发明已分析确 认了我们获得的10多个有效的抗病相关基因。
[0017] (3)本发明所提供的启动子经过实验验证，与疫霉菌的侵染有着紧密的联系。利用 这一启动子，通过转基因技术，可实现抗病相关基因等目标基因在植物体内的时空特异表 达，即在疫霉菌侵染时激活表达，从而通过实现目标基因的时空特异表达，有望显著提高植 物对疫霉菌的抗性。
[0018] (4)本发明所提供的植物特异响应疫霉菌侵染的启动子序列将为转基因抗病作物 的研发提供新的途径，有着巨大的商业前景。
[0019] 本发明发现的疫霉菌侵染特异响应的HAT4基因启动子序列，通过转基因技术，可 以达到激活目标抗病相关基因在植物中时空特异表达的目的。因此，本发明可以通过激活 受疫霉菌侵染植物组织的细胞死亡，实现作物广谱和持久抗病目的。
[0020] 利用本发明获得的疫霉菌侵染特异响应的HAT4启动子序列，还可达到研宄和鉴 定作物抗病相关基因的目的。
[0021] 将HAT4基因启动子与抗病相关基因融合，实现抗病性状在疫霉菌侵染时的特异 表达，从而在作物病害的防治领域开辟了一个全新的途径。利用本发明已分析确认了我们 鉴定获得的10多个有效的抗病相关基因，在国内外首次实验初步证明具有抑制疫霉菌侵 染作物的效果。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明。
[0023] 实施例1
[0024]启动子的获得：
[0025] 发明人通过对疫霉菌侵染的植物基因表达情况分析，获得了一个可以特异响应疫 霉菌侵染的基因HAT4,其对真菌、细菌代表的生物胁迫，NaCl代表的盐胁迫、甘露醇代表的 渗透胁迫、ABA代表的植物激素胁迫等非生物胁迫均不响应。通过启动子预测及PCR扩增， 我们获得了HAT4的启动子序列。
[0026] 实施例2
[0027]用于植物转化的启动子-抗病相关基因载体的融合：
[0028] 将本发明启动子区域的实施例1中克隆的启动子序列与携有抗病相关基因的线 性化载体连接，得到的质粒通过测序证实。
[0029] 实施例3
[0030] 本发明启动子可通过驱动抗病相关基因的表达，实现对疫霉菌的抗性：
[0031]用实施例2的构建体转化的植物，并对其进行接菌分析，结果可以通过高效限制 疫霉菌的扩展而实现抗病。
[0032] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【主权项】
1. 植物中特异响应疫霉菌侵染的启动子，其特征在于：包括能够特异驱动下游基因表 达或调节表达的启动子，以下为其5' -3'的核苷酸序列SEQ ID :1 : GGCCGTCGGGGCAAGAGCCAGGCCTCGATGAGTAGGAGGGCGCGGCAGTCGCTGCAAAACCTAGGGCGCGA GCCCGGGCAGAGCGGCCGTCGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGAACTTTGAAGGCCGAAG AGGGGAAAGGTTCCATGTGAACGGCACTTGCACATGGGTTATTCGATCCTAAGAGTCGGGGGAAACCCGTCTGATAG CGCTTAAGCGCGAACTTCGAAAGGGGATTTGGTTAAAATTCCGGAACCGGGACGTGGCGGTTGACGGCAACGTTAGG GAGTCCGGAGACGTCGGCGGGGGCCTCGGGAAGAGTTATCTTTTCTGTTTAACAGCCTGCCCACCCTGGAAACGGCT CAGCCGGAGGTAGGGTCCAGCGGCTGGAAGAGCACCGCACGTCGCGTGGTGTCCGGTGCGCCCCCGGCGGCCCTTGA AAATCCGGAGGACCGAGTGCCGCTCACGCCCGGTCGTACTCATAACCGCATCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTG GTCGATGGAACAATGTAGGCAAGGGAAGTCGGCAAAATGGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCT GGGCTCGGGGGTCCCAGTTCCGAACCCGTCGGCTGTCAGCGGACTGCTCGAGCTGCTTTCGCGGCGAGAGCGGGTCG CCGCGTGCCGGCCGGGGGACGGACTGGGAACGGCTCTCTCGGGAGCTTTACCCGGGCGTCGAACAGTCAGCTCAGAA CTGGTACGGACAAGGGGAATCCGACTGTTTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGGTCCCTGCGGATGCTAACGCAATG TGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGTGGGAGTAACTATGA CTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCC TGTCTACTATCCAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCT TGACTCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACTTGAGAGGTGTAGGATAAGTGGGAGCTTCGGCGCAAGTGAAATACCACT ACTTTTAACGTTATTTTACTTACTCCGTGAATCGGAGGCGGGGTACAACCCC。
2. -种权利要求1所述的植物特异响应疫霉菌侵染的启动子的遗传构建体，其特征在 于：包括该启动子、与该启动子有效连接的核酸序列以及终止子。
3. -种权利要求1所述的植物特异响应疫霉菌侵染的启动子的应用，其特征在于：包 括以下步骤： (1) 将启动子与相关疫霉菌和/或植物基因融合连接，形成遗传构建体； (2) 将得到的遗传构建体导入植物细胞、整合到基因组中，实现目的基因的特异表达， 提高植物自身抗病性。
【专利摘要】本发明公开了植物一个特异响应疫霉菌侵染的启动子及其应用，其创新点在于：包括能够特异驱动或调节下游目标基因在疫霉菌侵染时的时空特异表达，其5’-3’的核苷酸序列SEQ ID：1。启动子的应用，包括以下步骤：(1)将启动子与相关疫霉菌基因和/或植物基因融合，形成遗传构建体；(2)将得到的遗传构建体转入植物细胞、整合到植物基因组中，通过驱动该启动子下游抗病相关基因的特异时空表达，从而提高植物自身对疫霉菌的抗病性。本发明包含了已鉴定获得的植物特异响应疫霉菌侵染的HAT4启动子序列，将HAT4启动子序列与GUS报告基因融合，通过植物稳定表达和瞬时表达均确认了HAT4启动子的疫霉菌侵染特异响应的表达特征。
【IPC分类】C12N15-82, C12N15-113, A01H5-00
【公开号】CN104830861
【申请号】CN201510213358
【发明人】单卫星, 王秦虎, 张伟, 徐珂, 钟成承
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月29日