专利名称：一种协调植物生长与抗病相关基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种调控拟南芥生长和抗病的基因LHR(Leaf and Height Regulator)，该基因所编码的蛋白质及其功能类似物，以 及含有所述LHR基因核苷酸序列的载体和含有该基因核苷酸序列或该载体的宿主细胞。
背景技术：
当今世界粮食短缺，如何提高粮食产量来解决日益增长的粮食需求是一个不容忽 视的问题。植物生长在自然环境中，会受到环境中很多不利因素的影响，分为非生物胁迫和 生物胁迫。其中生物胁迫包括细菌、真菌、病毒、昆虫、线虫等。这些植物病害给农作物的产 量带来严重损失。植物进化出一系列的防御机制来减低这些伤害，但同时这些诱导的抗性 会影响植物的生长与产量，因此，认识植物对病害的反应和这种生长的适应性调节机制，在 提高植物的抗病性的同时尽量增加植物产量，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍 受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。拟南芥是一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学 的研究。拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到，有关拟南芥的发现都很可能应用于 其他植物研究，专家指出，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。目前研究发现，一种植物内源的激素水杨酸(Salicylic acid, SA)在植物抗活体 营养和半活体营养病原菌的反应中起重要作用⑴。病原菌侵染植物会诱导植物体内水杨 酸含量增加和一类发病进程相关基因(pathogenesis-related，PR)表达，从而产生一种广 谱持久的免疫反应，称为系统获得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)⑵。通过 分子遗传研究鉴定出水杨酸通路中一个重要的因子NPRl(Nonexpresser of I3Rgenes)(3)。 NPRl编码一个含Ankyrin Repeats结构的蛋白，在细胞质氧化还原态的改变下进入细胞核 与转录因子TGA等共同作用，调节下游抗性响应基因表达，如冊1、PR2,冊5，从而使植物产 生抗病性(3’4’5)。另外，WRKY是另一类广泛参与植物抗病反应的转录因子，拟南芥中有74 个，其中8个被鉴定为NPRl直接的转录底物(6)。过表达WRKY18，WRKY40等，可以增强植物 的抗病性，但同时导致植物产生矮化表型⑺。对另一些突变体的研究同样发现，持续表达抗性的突变体大部分都表现为矮化的 表型，而植物体内另一类激素生长素(auxin)在调节这一适应性生长过程中起重要作用。 研究表明生长素与水杨酸存在拮抗的作用，生长素含量升高会抑制植物抗病性，植物抗病 性需要抑制生长素通路的相关基因，水杨酸处理会抑制植物的生长素相关基因^’9’"1’11)。水 杨酸与生长素之间又是如何发生拮抗的？目前研究只发现GH3. 5在这个过程中起作用。 GH3. 5是生长素早期响应基因，编码一类生长素氨基酸偶联酶，可以抑制生长素活性，从而 抑制植物生长，使植物将更多的代谢资源应用于抗病反应，在病害下更好的存活(12)。目前，水杨酸介导的抗病反应与生长素介导的生长调节的偶联机制仍不清楚。其 中涉及到的关键基因仍未鉴定出。本发明从加深理解植物抗病与生长适应性调节的分子机理，提高粮食抗病与产量出发，通过对拟南芥突变体的研究鉴定了一个协调水杨酸介导的抗病反应与生长素介导的 生长调节的基因LHR，并通过功能互补实验也已鉴定了该基因。
发明内容
在第一个方面，本发明提供一种协调植物生长和抗病的基因LHR编码的蛋白质或 其功能类似物，其中所述LHR编码的蛋白质具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述功能 类似物是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有 协调植物生长和抗病功能的类似物，或与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少55%的 同源性的功能类似物。在一个实施方案中，所述蛋白质具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列。在第二个方面，本发明提供编码第一个方面所述蛋白质或其功能类似物氨基酸序 列的基因或所述基因所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而产生的 突变体等位基因或衍生物，其与上述基因序列具有相同功能并能达到本发明目的。在一个 实施方案中，所述基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。在第三个方面，本发明提供一种载体，其包含第二个方面所述的基因或其片段。在一个实施方案中，所述载体是植物表达载体。在一个优选实施方案中，所述载体是 PCAMBIA1300。在第四个方面，本发明提供一种含有第二个方面所述的基因或其片段或第三个方 面所述的载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌或植物 细胞。在第五个方面，本发明提供一种用LHR进行高效植物遗传转化的方法，所述方法 包括植株培育、农杆菌培养、花序侵染转化、抗性筛选、表型观察。在第六个方面，本发明提供了 一种利用植物表达载体转化植物以改变植株生长和 抗病性的方法，其包括用第三方面所述的载体转化植物细胞，和将转化的植物细胞培育成 植株。在一个实施方案，所述转化的方法包括农杆菌介导法或基因枪法。在一个实施方 案中，所述植物是拟南芥。在第七个方面，本发明提供了一种增加植物抗病性的方法，该方法包括将植物中 如第二方面所述的基因突变。在一个实施方案中，所述植物抗病性是对细菌感染的抗性。在第八个方面，本发明提供了一种在植物中诱导抗病基因表达的方法，所述方法 包括将植物中如第二方面所述的基因突变。为实现上述目的，本发明的一种优选实施方式步骤如下一、拟南芥突变体Ihr的鉴定和遗传分析本发明中鉴定出的Ihr突变体是哥伦比亚生态型的T-DNA插入突变体，突变体表 现出矮化表型。Southern杂交检测显示突变体中有单拷贝T-DNA插入该基因。将突变体与 Landersberg生态型杂交，Fl代植株表现正常，在杂交组合的F2代分离群体中，正常和矮化 的植株呈典型的3 1分离(χ2 2. 51，P >0.1)。这一结果表明Ihr突变体性状受单隐 性基因控制。二、LHR基因调节生长和抗病的功能分析
对Ihr突变体的矮化表型分析，说明LHR基因正向调节植物生长。另外，对突变体 和野生型植株的接菌实验，说明LHR基因负调节抗病反应。用荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)检测抗病反应的marker基因在突变体中表达上调。利用pCAMBIA1300质粒构建互补 载体，通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体恢复 正常功能的转基因植株。
本发明提供了一个协调植物生长和抗病反应的基因——LHR，利用该基因的功能 特性，用转基因的方法，适当调节LHR基因或者其他植物中LHR的同源基因的表达水平，使 植物抗病并协调生长。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本 发明的基因可广泛用于培育抗病植物新品种。
下面将结合附图对本发明进行进一步详细描述。图1野生型与Ihr突变体的Southern分析结果电泳图谱图2野生型与Ihr突变体的表型比较图2A幼苗期植株大小比较， 左为野生型，右为lhr，图2B成熟期植株高度比较， 左为野生型，右为Ihr图3野生型与Ihr突变体的抗病比较图4抗病marker基因的荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)直方5LHR基因功能互补载体图谱图6LHR基因功能互补实验验证图6A幼苗期植株大小比较，图6B成熟期植株高度比较左为野生型，中为lhr，右为转LHR基因互补植株
具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述发明，但是所述实施例仅是为了举例说明， 而并非对本发明的限定。实施例1 :LHR的克隆把T-DNA插入的拟南芥突变体和哥伦比亚野生型种子(均购自Arabidopsis BioloRical Resource Center)经过消毒，4°C春化三天后播种于MS培养基(参照14)上， 约两周后移苗到蛭石中。在温度22°C、光照强度120umOl/m2/S (光暗周期16h/8h)、相对湿 度保持在60%-70% (幼苗时期保持80-90%的相对湿度)的条件下培养观察表型。结果 发现，突变体Ihr和野生型相比，表现为矮化。对突变体相对应的基因进一步验证(表型观 察、Southern、互补验证)，命名该基因为LHR。实施例2 野生型与突变体Ihr的Southern分析结果野生型拟南芥和突变体Ihr拟南芥基因组DNA的提取按Paterson等(1993)的 方法进行。取1 μ g基因组DNA，分别用HindIII和NdeI (Takara产品)酶切。酶切产物 经0.7%琼脂糖凝胶电泳(30-50V，0/N)分离，然后用常规方法在摇床上处理电泳胶经 0. 125N HCl 浸洗 15min，变性液(1. 5M NaCl,0. 5N NaOH)浸洗 30min,中和液(1. 5M NaCl，0. 5M Tris-HClpH7. 2)浸洗 30min。最后用 20 X SSC 将 DNA 印迹到 HybondN+ 尼龙膜上。预杂交、杂交均按常规方法进行(金冬燕等，1996 ；Hybond Nmannual,Amersham)。探针及其标记杂交探针为NPTII，
其中引物1 :5，ggg-cgc-ccg-gtt-ctt-ttt-g 3，，弓I物 2 :5，aca-ccc-agc-cgg-cca_cag-tcg, 3，。用 Promega 公司的 Primer-a-Gene 试剂盒进行标记过夜。杂交前用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒进行探针纯化。洗膜用高严紧方法进行(HybondNmannual，Amersham) :2XSSC,0. 1 % SDS, 15min ；IX SSC, 0. 1% SDS, 65°C, 15min ；2XSSC，0. 1% SDS，65°C，15min。保鲜膜包裹杂交膜，_70°C下对X光片曝光。结果如图1所示，从图中可以看出，该基因在NdeI的酶切泳道中杂交到一条约 11.4kb带；在HindIII的酶切泳道中杂交到一条约4. 4kb带；可以确定，Ihr突变体中T-DNA 是单拷贝，且插入了基因组的LHR基因而造成突变。实施例3 野生型拟南芥和Ihr突变体 的表型观察结果1、突变体矮化表型野生型拟南芥和突变体Ihr种子在MS培养基上萌发并长成四叶期幼苗后，转移到 蛭石中。生长约一周后，突变体植株表现出矮化表型，突变体叶片明显比野生型的小(图 2A)。到植株抽苔成熟后，突变体植株的高度也明显比野生型矮(图2B)。2、突变体抗病表型野生型拟南芥和突变体Ihr种子在MS培养基上萌发并长成四叶期幼苗后，转移到 土壤中(营养土与蛭石以1 1比例混合均勻)。在短日照下，生长约两个月后，进行接菌 实验，检测野生型和突变体中细菌生长数目(参照3，13)。细菌有毒菌株 Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 (参照 15)在含 50 μ g/ mL利福平(rifampicin)的King，s B培养基上28°C生长，2天后用IOmM MgCl2重悬细菌， 使重悬菌液OD6tltl = 5*10_4，用重悬的菌液侵染上述植株叶片。在侵染当天和侵染三天后，用 打孔器取相同面积的侵染叶片。而后将叶片在ImL IOmM MgCl2中磨碎，稀释成不同浓度梯 度，涂在含SOyg/mL利福平(rifampicin)的King’ s B培养基上。28°C生长2天，然后统 计每个样品中的细菌克隆数目，计算出每平方厘米叶片的细菌数目。每个基因型做三个重 复，每个重复取三片叶，每个重复稀释3-4个浓度梯度。结果如图3所示，纵坐标为对每平方厘米叶片的细菌数目以10为底取对数，从图 中可以看出，野生型和突变体在接种O天时，接种情况一致，接种三天后，突变体中细菌数 目明显比野生型少，说明突变体增强了对细菌的抗性。3、抗病marker基因在野生型拟南芥和Ihr突变体中的表达情况野生型拟南芥和突变体Ihr种子在MS培养基上萌发并长成四叶期幼苗后，转移到 土壤中(营养土与蛭石以1 1比例混合均勻)。约一周后，取地上部分材料提取总RNA。用Plant RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，经1 %琼脂糖电泳检测RNA的完整 性。使用 TaqMan Reverse Transcription Regents试剂盒(Applied Biosystems)进行反转 录，所得到cDNA样品稀释为lng/μ 1，取一微升样品进行检测，在实验中每个样品设三次重 复。基因特异引物的设计使用raiMEREXPRESS软件(Applied Biosystems)。PCR反应及其 检测分别使用 SYBR Green Master mix 和 ABI 7900 序列检测系统(AppliedBiosystems)。数据的处理采用Comparative Ct方法(User Bulletin#2, ABIPRISM 7700序列检测系统)。 以18S rRNA作为内对照对数据进行归一化。检测的基因rai、PR2, PR5是抗病marker基因，会受病害或者激素SA诱导表达。 结果如图4所示，在正常生长条件下，Ihr突变体中PR1、PR2、PR5的表达量比野生型高几十 倍，说明突变体中持续表达抗病基因。实施例4 =LHR基因的功能互补验证用SalI和BamHI作为酶接头的特异引物从野生型拟南芥全基因组中扩增3. 778kb 的基因组DNA片段，包含起始密码子ATG上游的1，839个碱基的promoter区和终止密码 子TAA后的597个碱基的全长序列，克隆到双元载体pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司) 中，获得了用于转化的质粒pCAMBIA1300-LHR(图5)。质粒通过电击的方法转入农杆菌 (AgroBacterium tumefaciens)株系GV3101 (本实验室制备，参照《植物基因工程》(参考 书的作者王关林、方宏筠，出版日期2004年，第2版等))中转化拟南芥。采用农杆菌介 导的转化方法导入突变体Ihr中。具体步骤如下(1)转化植株的培育突变体Ihr种子在MS培养基上萌发并长成四叶期幼苗后，转移到土壤中(营养土 与蛭石以1 1比例混合均勻)。长日照条件下，生长约一个月后，开始抽苔时准备转化。(2)农杆菌的培养。将构建好的pCAMBIA1300-LHR重组质粒用1800v电压，2秒电 击转化GV3101农杆菌感受态细胞(本实验室制备，参照《植物基因工程》(参考书的作者 王关林、方宏筠，出版日期2004年，第2版等))，在含有50mg/L潮霉素的YEB平板培养基 上28°C培养48小时。挑取农杆菌单克隆接种于20ml YEB液体培养基中，28°C摇菌培养至 对数生长晚期；取2.5ml活化后的菌种转接至250ml Y^培养基(50mg/L潮霉素)中，28°C 培养至 OD6tltl 为 0. 6-0. 8。(3)转化、筛选及表型观察首先收集转入PCAMBIA1300-LHR重组质粒的农杆菌培养好的农杆菌菌体，4°C， 4，000g, IOmin离心，用等体积的转化渗透液重悬，将转化植株倒置，使植株的花序浸入转化 液中，浸染5min。然后将植株用保鲜袋包住，平放于暗处培养一天，而后竖放于光下，正常培 养，收种子。将收下的种子播于含25mg/L潮霉素的MS培养基上，进行筛选。筛选两代后进 行表型观察。转入LHR基因的Ihr突变体的表型可恢复到野生型表型。在幼苗期，互补植 株与野生型的叶大小相似，无明显差别(图6A)。在抽苔成熟后，互补植株的株高也恢复到 野生型植株的高度(图6B)。结果说明LHR能够在突变体中实现功能互补，证明LHR发生功 能失活突变，会导致突变体矮化。参考文献1. Bari, R. and Jones, J. D. Role of plant hormones in plant defence responses.Plant Mol Biol,2008, DOI 10.1007/sl1103-008-9435-0
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权利要求
一种协调植物生长和抗病基因LHR编码的蛋白质或其功能类似物，其中所述LHR编码的蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述功能类似物是SEQ ID NO2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有协调植物生长和抗病功能的类似物，或者与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少55％的同源性的功能类似物。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其具有SeqID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求1所述的蛋白质或其功能类似物的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其具有Seq.ID. No. 1所示的核苷酸序列。
5.一种基因，其是权利要求3或4所述基因的核苷酸序列经过取代，缺失或添加一个或 多个核苷酸且与权利要求3或4所述基因具有相同功能的突变体、等位基因或衍生物。
6.一种含有权利要求3，4或5所述的基因或其片段的载体。
7.权利要求6所述的载体，其为植物表达载体。
8.权利要求7所述的载体，其为pCAMBIA1300。
9.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求3，4或5所述的基因或其片段。
10.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求6-8任一项所述的载体。
11.根据权利要求9或10的宿主细胞，该细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
12.—种在植物中协调抗病和生长的方法，包括用权利要求6-8任一项所述的载体转 化植物细胞，和将转化的植物细胞培育成植株。
13.按照权利要求12所述的方法，其中所述的转化包括农杆菌介导法或基因枪法。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述植物为拟南芥。
15.一种增加植物抗病性的方法，该方法包括将植物中如权利要求3-5任一项所述的 基因突变。
16.根据权利要求15的方法，其中所述植物抗病性是对细菌感染的抗性。
17.一种在植物中诱导抗病基因表达的方法，所述方法包括将植物中如权利要求3-5 任一项所述的基因突变。
全文摘要
本发明公开了一种协调植物生长和抗病的基因及其编码蛋白，本发明还公开了包含所述基因及其片段的载体，宿主细胞，本发明还公开了在植物中调控生长和抗病反应的方法，所述方法包括用包含所述基因的表达载体转化植物，获得转化植株。本发明的基因在揭示植物对病害的反应和生长的适应性调节机制具有重要理论意义，对于培育农作物抗病新品种，有效地提高农作物抗病性及产量也具有极强的可操作性。
文档编号C12N1/21GK101798340SQ200910077628
公开日2010年8月11日 申请日期2009年2月9日 优先权日2009年2月9日
发明者张玉娥, 徐文英, 李钟惠, 薛勇彪 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所