专利名称：甲胎蛋白及其编码基因的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲胎蛋白及其编码基因的新用途。
背景技术：
肝细胞癌是高发病率的肿瘤，严重威胁人类健康。肝癌细胞耐受化学药物是造 成肝癌细胞复发、转移和难治的主要原因。肝癌细胞耐受化学药物诱导凋亡的分子 机制至今还不清楚。
RA是维生素A的衍生物，它通过与细胞内的受体RAR (ou (3、 y)和RXR (a、 (3、 Y)结合调控相关基因表达而发挥调节细胞分化和诱导细胞凋亡的作用。因RA 能有效的诱导肿瘤细胞凋亡而且毒性小，所以在在临床上已开始将其应用于肺癌、 乳腺癌和肝癌等实体肿瘤的治疗，早前该RA已被广泛应用于白血病治疗；但肝癌 细胞明显耐受药理剂量的RA作用，使用RA治疗肝肿瘤效果并不理想。肝细胞癌耐 受RA是限制使用RA治疗肝癌的重要因素，因而探索肝癌细胞耐受RA的分子机制 是合理使用RA治疗肝肿瘤的理论基础。
甲胎蛋白(AFP)是肝癌细胞发生发展过程高表达的特异性很高的蛋白质。有 关研究表明AFP能通过受体介导促进癌基因(如c-ras等基因)的表达，导致肝癌 细胞增殖；AFP也能通过抑制肝癌细胞表达TRAIL受体，减少肿瘤细胞与淋巴细胞 分泌的TRAIL结合，从而导致肝癌细胞逃避淋巴细胞的免疫监视；AFP能与细胞内 的蛋白质结合，通过影响细胞内的信息传递和热休克蛋白的功能调节细胞的生长。 AFP结构复杂，其3个结构域与相应的配体蛋白结合会产生不同的生物学效应。已 经有人推测AFP具有能与胞内类固醇/甲状腺素类家族受体结合的结构域基础，但 是AFP是否能和这些蛋白质结合还没有得到研究验证，而且AFP对胞内受体的生物 学功能有没有影响，也是需要探索的科学问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供甲胎蛋白及其编码基因的新用途。 本发明所提供的甲胎蛋白及其编码基因的一种新用途是甲胎蛋白及其编码基 因在设计和/或筛选药物中的应用。
本发明所提供的甲胎蛋白及其编码基因的另一种新用途是以甲胎蛋白及其编
3码基因为靶点的物质在制备药物中的应用。
其中，所述药物可为用于预防和/或治疗肝癌的药物。
所述以甲胎蛋白及其编码基因为靶点的物质可具体为蛋白质或者核酸。本发明的另一个目的是提供一种以甲胎蛋白及其编码基因为耙点的用于预防和/或治疗肝癌的药物。
所述药物的活性成分可具体为核酸。
上述核酸可为抑制所述甲胎蛋白编码基因表达的小干扰RNA、表达所述小干扰
RNA的载体、表达抑制所述甲胎蛋白编码基因表达的shRNA的载体、与所述甲胎蛋
白编码基因发生同源重组且抑制所述甲胎蛋白编码基因表达的同源序列或含有所
述同源序列的载体。
所述shRNA由茎I 、环和茎II构成的茎环结构；所述茎I的序列具体可为GAACGUGG UCAA UGUA UAAU，所述茎II的序列具体可为AUUAU ACAU UGAC CACG UUC,环结构是UCAAGAG。
本发明的药物能够通过抑制肝癌细胞内AFP蛋白的表达，从而减少AFP与RA的受体RAR-e的结合，使更多的RAR-e进入细胞核中，与survivin的启动子结合从而抑制survivin的表达，进而抑制肝癌细胞的增殖。试验证明，对于没有用本发明药物处理过的肝癌细胞，要用80mM或更高剤量的ATRA才能抑制肝癌细胞的增殖，而用本发明药物处理过的肝癌细胞，只要用40]LiM的ATRA就能抑制肝癌细胞的增殖，因此，本发明的药物降低了肝癌细胞对RA的耐受性，在治疗肝癌领域有重要的应用价值。
图l为AFP或ATRA对Bel 7402生长的调节作用。
图2为AFP对ATRA诱导Bel 7402凋亡的拮抗作用。
图3为AFP与RAR- e在胞浆里的相互结合检测。
图4为荧光能量共振转移技术(FRET)分析AFP与RAR-p的相互作用。
图5为出发载体的图谱及转染效率。
图6为siRNA干扰载体对Bel 7402细胞中AFP和survivin表达的影响。图7为siRNA干扰载体对Bel 7402细胞凋亡的影响。
图8为siRNA干扰AFP表达后，对RAR-0对Bel 7402细胞survivin基因启动子相互作用的影响。图9为编码shRNA的DNA的设计。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。人肝癌Bel 7402细胞购自上海天呈科技有限公司，产品目录号为Bel 7402;
H印G2购自中国科学院上海细胞库，产品目录号为H印G2人肝癌细胞；HLE细胞
购自中国科学院上海细胞库，产品目录号为HLE人肝癌细胞；
AFP纯品(从肝癌细胞中提取)购自Biodesign公司，产品编号为A32260H;
小鼠抗人AFP的单克隆抗体从P印roTech EC. LTD (USA)购买，产品编号为T-2;
小鼠抗人RAR-p的单克隆抗体购自Santa Cruz (USA)，产品目录号为sc-14028;兔
抗人AFP的多克隆抗体购自Santa Cruz (USA) ; RPMI-1640培养基购自GIBCO公
司；全反式维甲酸(All frs/AS retinoic acid, ATRA)购自Sigma (USA)，产品
目录号为..98F-0178。
ATRA能够诱导肝癌细胞凋亡(Nakanishi M， Tomaru Y， Miura H， Hayashizaki
Y， Suzuki M. Identification of transcriptional regulatory cascades in
retinoic acid-induced growth arrest of H印G2 cells. Nucleic Acids Res. , 2008;
36(10) : 3443 - 3454.)。
实施例1、甲胎蛋白(AFP)与肝癌细胞耐受药物的关系
下述各实验中，在进行前，均先将人肝癌Bel 7402细胞进行适应性培养48h。
适应性培养方法将人肝癌Bel 7402细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640
培养基中，置于37。C、 5% C02的培养箱中培养，每隔24h更换新的培养基。一、MTT法检测AFP、 ATRA对肝癌细胞生长的影响
细胞适应性培养48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2xl(^个/ml;将细胞接种于96空培养板中(120pL/孔)，每组设8个平行孔，待培养24h后，去掉培养液，加入无血清RPMI-1640 U20pL/孔)，培养24h后，再去掉培养液，然后向各实验组及对照组分别加入药物，处理24h(处理条件和细胞常规培养条件一致，均为置于37。C、 5%0)2的培养箱中培养)；再向各孔加入2(^L MTT (5mg/L)，置于37°C、 5% C02的培养箱中继续培养4h,去掉培养液，用PBS液洗细胞2次，向各孔加入DMSO (120pL/孔)，微振荡30rain,在570nm波长下测光密度(0D57。)，计算细胞的增殖率，增殖率-[l-(样本组0D，-
5对照组0Ds7。) ]/对照组0057。><100%。实验设如下各组
(1) AFP和mAb对肝癌细胞生长的影响(图1A)空白对照组除加入正常培养液外，没有加入任何物质；
5-160 mg/L组向孔中加入AFP和mAb， AFP和mAb在孔中的终浓度各自依次为5、 10、 20、 40、 80、 160 mg/L。
图1A中，l表示空白对照组，2表示5 mg/L组，3表示10 mg/L组，4表示20 mg/L组，5表示40 mg/L组，6表示80 mg/L组，7表示160 mg/L组。图1中各纵坐标是以空白对照组计作100%。
(2) ATRA对肝癌细胞生长的影响(图1B)
Control (空白对照组)除加入正常培养液外，没有加入任何物质；
10-160 ii M组向孔中加入ATRA和相应DMSO， ATRA在孔中的终浓度为10、 20、
40、 80、 160 u M (用DMSO溶解ATRA，实际DMSO在孔中的终浓度为0. 5-1. 6% (体
积百分含量))。
图1B中，l表示空白对照组，2表示10uM组，3表示20uM组，4表示40 u M组，5表示80uM组，6表示160uM组。
(3) AFP和ATRA抑制肝癌细胞生长的影响(图1C)
对照组l (control):除加入正常培养液外，没有加入任何物质；
ATRA组向孔中加入ATRA，ATRA在孔中的终浓度为160yM(用DMSO溶解ATRA，
实际DMSO在孔中的终浓度为1.6% (体积百分含量))；
DMSO组向孔中加入DMSO，实际DMSO在孔中的终浓度为1. 6%(体积百分含量)；ATRA+AFP组向孔中加入ATRA和AFP， ATRA和AFP在孔中的终浓度分别为160
ix M禾口 20mg/L;
DMSO+AFP组向孔中加入DMSO和AFP， DMSO在孔中的终浓度为1. 6% (体积百分含量)，AFP在孔中的终浓度为20mg/L;
抗AFP单克隆抗体(mAb)组向孔中加入raAb, mAb在孔中的终浓度为40mg/L;
ATRA+AFP+mAb组:向孔中分别加入ATRA、 AFP和mAb， ATRA、 AFP和mAb在孔中的终浓度分别为160uM、 20mg/L和40mg/L。
实验设3次重复。
图1C中，1表示空白对照组，2表示ATRA组，3表示DMSO组，4表示ATRA+AFP组，5表示DMS0+AFP组，6表示抗AFP单克隆抗体(mAb)组，7表示ATRA+AFP+mAb组。
结果表明，用ATRA (10-160uM)处理人肝癌Bel 7402细胞24小时后，MTT检测结果显示，ATRA大于80"M时，对肝癌细胞的增殖才有明显的抑制作用(图1B);而AFP在浓度大于10mg/L时对Bel 7402细胞的生长则有促进作用(图1A);这些药物对Bel 7402细胞生长的影响有剂量和时间的依赖性；AFP和ATRA共同处理肝癌细胞，则观察到AFP具有对抗ATRA的诱导凋亡作用(图1C)。
二、流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡状况
人肝癌细胞Bel 7402适应性培养48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，再用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2. 5"04个/1111;将细胞接入24孔板(2ml/孔)，培养24h后，去掉培养液，用无血清的RPMI-1640继续培养24h (此为细胞饥饿周期同步化)后，换成含有10%血清和相应浓度药物的RPMI-1640处理细胞24h，每个组别设3个平行孔。处理结束后，吸出细胞培养液于FACS管，离心(1000g， 5min)收集悬浮的细胞，并用0.025%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，去掉0.25%胰蛋白酶，用lmlPBS把细胞吹散，吸到FACS管里，离心(1000g, 5min)收集细胞，和悬浮的细胞一起，用l ml PBS重悬细胞，再加入-20。C预冷的3 ml无水乙醇(无水乙醇的终浓度为75%)，置于-20。C冰箱过夜(或12h)。上机测样前，离心细胞(lOOOg，5min)，用1 ml PBS离心清洗细胞(lOOOg， 5min)三次，用lml PBS重悬细胞，在lml PBS的细胞悬液中加入20mg/L的RNA酶lO(il， 37°C保温30min，再加入碘化丙锭(PI) 200nl (终浓度liag/ml)。用FACS Scan-420 Flow Cytometry检测细胞周期和细胞凋亡情况。
实验组、对照组及对应加入的药物如下
ATRA (用DMSO溶解)、AFP和mAb (用RPMI-1640溶解)，待溶解后，加入各孔中；
实验组l:向孔中加入ATRA， ATRA在孔中的终浓度为160
实验组2:向孔中加入ATRA和AFP， ATRA在孔中的终浓度为160 u M， AFP在孔中的终浓度为20mg/L;
实验组3:向孔中加入mAb， mAb在孔中的终浓度为40mg/L;
实验组4:向孔中加入ATRA、 AFP、 mAb， ATRA在孔中的终浓度为160 w M， AFP在孔中的终浓度为20rag/L， mAb在孔中的终浓度为40mg/L。对照组l (control):空白对照组，该组除加入正常培养液外，没有加入任何 物质；
对照组2:向孔中加入DMSO， DMSO在孔中的终浓度为1.6% (体积百分含量)。 实验设3次重复。
流式细胞仪检测结果如图2A所示(每个图片上的数据代表在药物处理后细胞 凋亡的百分比)。图2A中，l表示对照组l， 2表示实验组1， 3表示对照组2， 4 表示实验组2， 5表示实验组3， 6表示实验组4。
流式细胞仪试验的统计学分析(t检验)结果如图2B所示。 结果表明，ATRA阻止肝癌细胞周期进入M/G2期，从而抑制细胞生长，增加细 胞的凋亡率，从5. 7%-56. 5% (对照组1中的凋亡率为5. 7%，实验组1为56. 4%，实 验组2为8. 6%，实验组3为4. 5%，实验组4为47. 5%，对照组2为21. 7%)，这些 凋亡率在使用AFP处理时能明显被消除(平均为8. 6%)，而抗AFP的单克隆抗体能显 著性拮抗AFP的作用，说明AFP对ATRA诱导Bel 7402凋亡具有拮抗作用。 三、显微镜照相和DAPI染色观察细胞形态的变化和凋亡小体的形成 人肝癌细胞Bel 7402适应性培养48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2. 0xl()4个/ml;取5 ml细胞液培养于33cm2 的培养瓶，待细胞长到80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的 RPMI-1640把细胞调整到2xlO'个/ml，将细胞接于24孔培养板中(2ml/孔)，每 组设4个平行孔，细胞培养24h后，去掉培养液，用无血清的RPMI-1640继续培养 24h(此为细胞饥饿周期同步化)后，换成含有10%血清和相应浓度药物的RPMI-1640 处理细胞24h，用数码相机拍摄细胞形态的改变；然后收集悬浮细胞到离心管，再 用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，用1.5ml PBS把细胞轻轻吹下，收集到装有悬浮 细胞到离心管中，离心(1000g， 5min)，去掉PBS，用lml PBS把细胞轻轻吹散， 加入10(^1浓度为100(ig/ml DAPI，避光37。C保温30min，离心(1000g， 5min)， 去掉上清也，加入lml PBS把细胞轻轻吹散，离心(1000g， 5min)清洗细胞三次， 去掉上清液，加入lOO)alPBS把细胞吹散，吸出20]ul细胞悬液加到干净的载玻片上， 再轻轻压上盖玻片，静置5min后，再用荧光显微镜观察细胞凋亡小体，并显微拍 摄图像。
实验组、对照组及对应加入的药物如下
ATRA (用DMSO溶解)、AFP、 raAb (用RPMI-1640溶解)，待溶解后，加入各
8孔中；
实验组l:向孔中加入ATRA， ATRA在孔中的终浓度为160uM;
实验组2:向孔中加入ATRA和AFP， ATRA在孔中的终浓度为160 ii M， AFP在孔 中的终浓度为20mg/L;
实验组3:向孔中加入mAb， mAb在孔中的终浓度为40mg/L;
实验组4:向孔中加入ATRA、 AFP、 mAb， ATRA在孔中的终浓度为160 y M， AFP 在孔中的终浓度为20mg/L， mAb在孔中的终浓度为40mg/L。
对照组l:空白对照组，该组除加入正常培养液外，没有加入任何物质；
对照组2:向孔中加入DMSO， MSO在孔中的终浓度为1.6% (体积百分含量)。
结果如图2C所示。结果表明，大剂量的ATRA (160(imol/L)处理24小时后能 诱导肝癌Bel 7402细胞凋亡小体的形成和核萎縮；AFP能消除ATRA的这种作用。
图2C中，l表示对照组l， 2表示实验组1， 3表示对照组2， 4表示实验组2， 5表示实验组3， 6表示实验组4。
四、细胞蛋白质的提取和Western Blotting
人肝癌细胞Bel 7402适应性培养48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2. 0xl04个/ml;取5 ml细胞液培养于33cm2 的培养瓶，每组设4个平行瓶，细胞培养24h后，去掉培养液，用无血清的RPMI-1640 继续培养24h (此为细胞饥饿周期同步化)后，换成含有10%血清和相应药物浓度 的RPMI-1640处理细胞24h，按文献(Tahk S. et al. Control of specificity and magnitude of NF- B and STAT1-mediated gene activation through PIASy and PIAS1 cooperation, PNAS， 2007; 104: 11643 - 11648.)中所述方法提取细胞蛋 白质，做蛋白质杂交分析相关的抗原，用FUJI 2000化学发光/荧光仪拍摄杂交蛋 白质条带。探针分别为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(一抗分别为人MR-(3 抗体、小鼠抗人AFP抗体、小鼠抗人(3-actin抗体)；显色剂为BCIP/NBT显色试剂
实验组、对照组及对应加入的药物如下
对照组l:空白对照组，该组除加入正常培养液外，没有加入任何物质； 对照组2:向瓶中加入DMS0， DMS0在瓶中的终浓度为0.4X (体积百分含量)。 对照组3:向瓶中加入DMS0， DMS0在瓶中的终浓度为1.6% (体积百分含量)。 实验组l:向瓶中加入ATRA， ATRA在瓶中的终浓度为40uM。实验组2:向瓶中加入ATRA， ATRA在瓶中的终浓度为160uM。 以H印G2和HLE细胞的AFP表达作为参照。 实验设3次重复。
结果表明，ATRA的两种浓度(40或160 p M)均能诱导RAR-P表达，同时也能 检测到胞浆中AFP的表达，但是用ATRA(160uM)处理后，AFP的表达量明显下降，表 明160 y M的ATRA能够抑制AFP的表达(图3A)。
H印G2和HLE细胞的AFP表达结果如图3B所示，表明H印G2能表达AFP，而 HLE细胞则不表达AFP。
图3A中，泳道l表示对照组l，泳道2表示对照组2，泳道3表示对照组3， 泳道4表示实验组1 ，泳道5表示实验组2; a表示RAR- 0 ， b表示AFP， c表示 P -actin。
图3B中，泳道1表示人肝癌细胞Bel 7402，泳道2表示HLE细胞，泳道3表 示H印G2细胞；a表示AFP， b表示P-actin。
五、激光共聚焦显微镜技术研究蛋白质的细胞内定位
20x20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放到6孔培养板中，然后 加入用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2xl(T个/ml的细胞悬液2ml， 待细胞长到70%融合，用药物处理细胞12h后，用4y。多聚甲醛固定细胞30min，再 用O. 3%的曲拉酮-X 100浸泡细胞30min，去掉全部液体，用1 ml PBS清洗细胞3 次，去掉全部液体，用5%的胎牛血清封闭细胞lh，去掉封闭液，加入小鼠抗人-RAR卩 的单克隆抗体(抗体浓度为1: 200)和兔抗人AFP的多克隆抗体(Santa Crutz， USA)(抗体浓度为l: 200) ， 4。C轻摇12h，去掉一抗液体，用lmlPBS清洗细胞 3次，加入FITC标记的羊抗小鼠二抗和TRITIC标记的羊抗兔的二抗，室温轻摇2h (避光)，再加入10nl浓度为10(Vg/mlDAPI，室温轻摇30min (避光)，去掉全 部液体，用lmlPBS清洗细胞3次，用激光共聚焦显微镜观察标记结果并拍摄图像。 实验组、对照组及对应加入的药物如下
对照组l:是空白对照组，该组除加入正常培养液外，没有加入任何物质； 实验组2:向瓶中加入ATRA， ATRA在孔中的终浓度为160ixM。 结果如图3E(a为用DAPI染Bel 7402细胞核；b为FITC连接的二抗检测RAR- e 抗体在细胞的分布；c为TRITC连接的二抗检测AFP抗体在细胞的分布；d图所显 示的是a， b， c三图的重合)和图3F所示(a为用DAPI染Bel 7402细胞核；b为FITC连接的二抗检测RAR- 3抗体在细胞的分布，RAR- 0被ATRA激活后进入细胞内的绿 色荧光已经用箭头提示；c为TRITC连接的二抗检测AFP抗体在细胞的分布；d图 所显示的是a，b，c三图的重合)。图3E为对照组(空白对照，没有用任何物质处 理)的结果，图3F为实验组2的结果，是用ATRA(160 uM)处理后，AFP和RAR-{3 在Bel 7402细胞里的定位。
表明，未经ATRA处理时，AFP能与RAR-卩相互作用，并在细胞浆有共定位现象； 当用ATRA (160fimol/L)分别处理细胞24小时后，有部分RAR-(5移入细胞核，而AFP 仍然停留在细胞浆中。
六、免疫共沉淀技术分析蛋白质相互作用
人肝癌细胞Bel 7402适应性培养48h后，用0. 25%胰蛋白酶消化，用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2. 0xl(T个/ml;取5 ml细胞液培养于33cm2 的培养瓶，每组设2个平行瓶，细胞培养24h后，去掉培养液，换成含有10%血清 和相应药物浓度的RPMI-1640处理细胞24h,按文献(Tahk S. et al. Control of specificity and magnitude of NF- B and STATl-mediated gene activation through PIASy and PIAS1 cooperation, PNAS， 2007; 104: 11643 - 11648.)中 所述方法提取细胞蛋白质，每个培养瓶中的细胞得到的蛋白质分4份，其中一份做 INPUT,剩下的3份分别用抗AFP的单克隆抗体(mAb) 、 RAR-(3的单克隆抗体和兔 免疫血清(IgG)沉淀相应的抗原，然后protein A _ agarose把抗原抗体复合物 吸附于agarose珠子上，并离心清洗其它蛋白质，用上样缓冲液和高温的方法使 agarose珠子与蛋白质复合物分离，经过SDS-PAGE电泳分离把抗原和抗体分离，再 用做Western Blotting杂交分析相关的抗原，用FUJI 2000化学发光/荧光仪拍摄 杂交蛋白质条带。用input来证明总的AFP和RAR- e的表达状况，免疫复合物的 沉淀和分离用A-S印harose珠子，非免疫复合物用非免疫抗兔IgG沉淀作为阴性对 昭。
用上述相同的方法研究细胞H印G2和HLE。
试验设3次重复，结果如图3C (细胞Bel 7402)和图3D (细胞H印G2和HLE) 所示。表明RAR-0能与AFP相互作用，这样的结果在H印G2细胞有同样的体现， 然而用HLE做研究，并不能检测到有AFP蛋白表达，显示研究结果的AFP作用特异性.
图3C中，I组为未经ATRA处理的，II组为经ATRA处理的，I组中泳道1表 示用AFP单克隆抗体沉淀并检测AFP和RAR- 0 ，泳道2表示检测细胞提取物AFP和RAR- P ，泳道3表示用RAR- P单克隆抗体沉淀并检测AFP和RAR- P ，泳道4表 示用非免疫羊球蛋白IgG沉淀并检测AFP和RAR- 0 ; II组中泳道1表示检测细胞提 取物AFP和RAR- P ，泳道2表示用AFP单克隆抗体沉淀并检测AFP和RAR- P ，泳 道3表示用RAR- 0单克隆抗体沉淀并检测AFP和RAR- P ，泳道4表示用非免疫羊 球蛋白IgG沉淀并检测AFP和RAR- 3 。 a表示AFP， b表示RAR- e 。
图3D中，I组为未经ATRA处理的，II组为经ATRA处理的，I组中泳道1表 示检测细胞提取物RAR- P ，泳道2表示用AFP单克隆抗体沉淀并检测RAR- P ，泳 道3表示非免疫羊球蛋白IgG沉淀并检测RAR-e ; II组中泳道l表示检测细胞提取 物RAR-P，泳道2表示用AFP单克隆抗体沉淀并检测RAR-e，泳道3表示非免疫 羊球蛋白IgG沉淀并检测RAR- e 。 a表示H印G2细胞，b表示HLE细胞。
综合试验C、 D、 F的试验表明，AFP与RAR-P在胞浆里具有相互结合特性。
七、荧光能量共振转移技术研究AFP与RAR-P相互作用。
试验方法20x20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放置到6孔培 养板中，然后加入用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把细胞调整到2xlCT"个/ml的细 胞悬液2ml，待细胞长到70%融合，用4。/。多聚甲醛固定细胞30min，再用0.3°/。的曲 拉酮(Triton) -X 100浸泡细胞30min，去掉全部液体，用lml PBS清洗细胞3次， 去掉全部液体，用5%的胎牛血清封闭细胞lh，去掉封闭液，加入小鼠抗人RAR-e 的单克隆抗体(抗体浓度为1: 100)和兔抗人AFP的多克隆抗体(Santa Cruz， USA) (抗体浓度为l: 100) ， 4。C轻摇12h，去掉一抗液体，用lmlPBS清洗细胞3次， 加入FITC标记的羊抗小鼠二抗和TRITC标记的羊抗兔的二抗，室温轻摇2h(避光)， 再加入10pl浓度为100|ig/mlDAPI，室温轻摇30rain (避光)，去掉全部液体，用 lml PBS清洗细胞3次，用90%甘油(PBS配制)10|al封片，用Olympus Fluoview FV1000 (Japan)型激光共聚焦显微镜观察FITC (绿色荧光，波长488nm)和TRITC (红色荧光，波长543nm)荧光共振能量转移情况。具体步骤是先常规采FITC和 TRITC荧光图象，并合成，观察细胞某些区域两种荧光有共定位的可能，选择要扫 描有共定位的可能区域，确定扫描前后的激光条件(条件前后一致)后，关闭激发 FITC的激光(波长488nm)，把激发TRITC的激光(波长543nm)开到最大(100%)， 也就是要漂白红色荧光，选择要漂白的时间(300-500numb)，扫描采图，漂白完 毕后，回到刚开始采图的条件，打开激发FITC的激光(波长488nm)，把激发TRITC 的激光(波长543nm)调整到漂白前的百分比，去掉选择的区域，扫描并拍摄图像，
12并用Olympus Fluoview FVIOOO软件合成图象和计算荧光共振能量转移的两个分子 的距离值(R)即光谱尺(spectroscopic ruler)，计算公式R=R。x [ (1/E)-1]' e。 其中R。是Foster Distance,当Donor是FITC, Ace印tor是TRITC时，R。的值是 0. 5nm, E是能量转移效率=1—(Prebleaching/Postbleaching)。
试验结果发现，在所选择的区域内供体分子漂白后的荧光强度明显高于漂白前 (图4A);图4B所显示的是荧光能量图和相对荧光强度，漂白以后的图片能观察到更 为明亮的荧光强度；用分析软件荧光能量转移效率.绿色展现的是相对高的转移效 率；图4D图片所展示的是两个荧光分子之间的距离，这些距离计算的结果是(供体 和受体之间的分子距离)5. 8±1. 7A.说明两种荧光分子发生相互作用。
实施例2、以甲胎蛋白AFP为耙点的shRNA在抑制肝癌细胞增殖中的应用。 本实施例是通过RNA干扰技术封阻AFP表达，进而抑制肝癌细胞增殖。 本实施例中所用的肝癌细胞除特殊说明外，均分别为Bel 7402、 HepG2细胞、 HLE细胞。
一、siRNA干扰载体的构建
siRNA干扰载体编码的shRNA是由茎I、茎II和环构成的茎环结构，其中茎I 的序列为GAAC GUGG UCAA UGUA UAAU，茎II的序列为AUUAU ACAU UGAC CACG UUC， 环的序列为UCAAGAG;
编码上述shRNA的DNA序列为GAAC GTGG TCAA TGTA TAAT TCAAGAG ATTAT ACAT TGAC CACG TTC (图9);
构建过程如下
(1) 构建双链DNA oligo片段
人工合成编码上述shRNA的DNA的两条链，然后在如下条件下退火合成双链DNA oligo片段将体系混匀，9(TC温育4分钟，7(TC温育10分钟，缓慢冷却至室温， 得到双链DNA oligo片段。
(2) 重组载体的构建
用限制性内切BamHI和Bbsl酶切出发载体pGPU6/GFP/Neo(上海吉玛生物医药 技术公司，产品编号E-07)(图5A)，用限制性内切酶BamHI和Bbsl酶切上述 双链DNA oligo片段，连接得到重组载体。
(3) 筛选及验证将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞E. C0li，挑选阳性克隆；用DNA序列测
定方法对阳性克隆进行鉴定，结果表明，得到了正确插入DNAoligo片段的阳性质 粒，备用。将得到的阳性siRNA干扰载体命名为pGPU6/GFP/Neo/siRNA。 二、将siRNA干扰载体转入肝癌细胞及结果检测
1、 转染效率的检测
方法20x20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放到6孔培养板中， 然后加入用含有10%胎牛血清的RPMI-1640把Bel 7402细胞调整到2xl()4个/ml的 细胞悬液2ml，置于37°C、5% 002的培养箱中培养，待细胞长到80%融合，用Lipo 2000 脂质体将pGPU6/GFP/Neo/siRNA质粒转入细胞中，待转染12h后，去掉全部液体， 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养细胞，18h后，取出盖玻片，置于载玻片上， 用荧光显微镜观察转染效率。
转染结果如图5B所示，转染效率在75%以上。图5B中，l表示未经任何转染 的细胞，2表示转入空载体pGPU6/GFP/Neo的细胞，5表示转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA 的细胞。
2、 转染后细胞内的蛋白表达变化
将Bel 7402细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640调整到2. 0xl04个/ml， 5 ml 细胞液培养于33cm2的培养瓶，每组设2个平行瓶，待细胞培养80%融合后，分别转 染空载体pGPU6/GFP/Neo质粒和pGPU6/GFP/Neo/siRNA，转染12h后更换新的培养 液再培养细胞18h，加入40 n M的ATRA处理细胞，按Western Blotting杂交分析 方法提取细胞蛋白质，并用Western Blotting杂交分析AFP和其它蛋白质的表达。
经ATRA处理的细胞中AFP的表达情况如图6A所示，表明，在细胞转染 pGPU6/GFP/Neo/siRNA后，Bel 7402细胞的AFP表达明显受抑制。图6A中，泳道1 表示未转入任何载体的细胞，泳道2表示转入空载体pGPU6/GFP/Neo的细胞，泳道 5表示转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA的细胞；a表示AFP蛋白，b表示(3-actin。
经ATRA处理的细胞中survivin基因的表达情况如图6B所示，结果表明，干 扰AFP表达后，再用ATRA (40 u M)进行处理细胞12小时后，细胞中survivn的表 达明显下降，肝癌细胞对低剂量的ATRA (40jimol/L)也敏感。图6B中，泳道1表 示未转入干扰载体也未经任何处理的细胞，泳道2表示未转入干扰载体但经 0.4。/。DMS0处理过的细胞，泳道3表示未转入干扰载体但经40 w M ATRA处理过的细 胞，泳道4表示没有任何处理的细胞，泳道5表示转入空载体的细胞，泳道6表示仅转染pGPU6/GFP/Neo/siRNA质粒的细胞，泳道7表示转染pGPU6/GFP/Neo/siRNA 质粒并且用0. 4%DMS0处理的细胞，泳道8表示转染pGPU6/GFP/Neo/siRNA质粒并 且用40 uM ATRA处理的细胞。a表示survivn， b表示(5-actin。
3、 转染后细胞的增殖情况
转染将肝癌细胞分别用含有10。/。胎牛血清的RPMI-1640培养，培养条件为 37°C、 5。/。C02的培养箱，待细胞长到80%融合，用Lipo 2000脂质体将干扰载体 pGPU6/GFP/Neo/siRNA转入细胞中。
检测待转染30h后，用0.25%胰蛋白酶消化，再用含有10%胎牛血清的 RPMI-1640把细胞调整到2xl(^个/ml，将细胞液加入96空培养板中(120pL/孔)， 每组设8个平行孔，细胞培养24h，然后向孔中加入药物处理24h， MTT计数法分析 细胞的增殖情况。
每种肝癌细胞均设以下处理
对照组l:细胞未经任何转染和处理；
对照组2:细胞转入空载体(pGPU6/GFP/Neo质粒)但未经任何处理； 对照组3:细胞中转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA但未经任何处理； 对照组4:细胞中转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA且用0. 4%DMS0处理； 实验组细胞中转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA后经40uM ATRA处理； 对照组5:细胞未经任何转染但经40wM ATRA处理。 实验设3次重复。
结果如图7A所示，结果表明，对于Bel 7402细胞和H印G2细胞，转入siRNA 干扰载体即干扰AFP表达后，细胞的生长明显被ATRA抑制，和没有转染siRNA干扰 载体的细胞相比，转染siRNA干扰载体的细胞对ATRA更敏感；对于HLE细胞，干 扰AFP表达后，HLE细胞的生长则没有明显的影响。
图7A中，是以对照组1中的细胞数量计作100%， I表示未经任何转染和处理 的细胞，II表示转入空载体但未经任何处理的细胞，III表示转入siRNA干扰载体但 未经任何处理的细胞，IV表示转入siRNA干扰载体且用0.4。/c)DMS0处理的细胞，V 表示转入siRNA干扰载体且经40 ii M ATRA处理的细胞，VI表示未经任何转染但经 40 pM ATRA处理的细胞。
4、 转染后细胞的形态变化按照实验3中所述方法进行转染，待转染30h后，加入药物处理24h，用数码 相机拍摄细胞形态的改变；然后收集悬浮细胞到离心管，再用0.25%胰蛋白酶消化 贴壁细胞，用1.5ml PBS把细胞轻轻吹下，收集到装有悬浮细胞的离心管中，离心 (1000g， 5min)，去掉PBS,用lml PBS把细胞轻轻吹散，加入10pl浓度为lOOjag/ml DAPI，避光37°C保温30min，离心(1000g， 5min)，去掉上清液，加入lml PBS 把细胞轻轻吹散，离心(1000g, 5min)清洗细胞三次，去掉上清液，加入lOOplPBS 把细胞吹散，吸出2(^1细胞悬液加到干净的载玻片上，再轻轻压上盖玻片，静置 5min后，再用荧光显微镜观察细胞凋亡小体，并显微拍摄图像。
每种肝癌细胞均设以下处理
对照组l:细胞未经任何转染和处理；
对照组2:细胞转入空载体pGPU6/GFP/Neo质粒，但未经任何处理； 对照组3:细胞中转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA但未经任何处理； 对照组4:细胞中转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA且用0. 4%DMS0处理； 实验组细胞中转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA后经40 u M ATRA处理； 对照组5:细胞未经任何转染但经40 y M ATRA处理。 试验设3次重复。
转入siRNA干扰载体后如图7B所示，荧光显微镜下细胞的形态学变化及细胞 核萎縮和凋亡情况如图7C所示，试验结果表明，用siRNA干扰载体干扰AFP表达 并用ATRA(40 yM)处理细胞后，细胞核浓縮、凋亡小体形成，转染siRNA干扰载体 的细胞比未转染的细胞结果明显，图中箭头现实的凋亡小体。林代0.01表示的是与 其它处理组的比较。试验结果也显示，表达AFP的人肝癌细胞均得到图7B和C的 结果)。
图7B中，1表示未经任何转染和处理的细胞，2表示转入空载体但未经任何处 理的细胞，3表示转入siRNA干扰载体但未经任何处理的细胞，4表示转入siRNA 干扰载体且用0. 4%DMS0处理的细胞，5表示转入siRNA干扰载体且经40 u M ATRA 处理的细胞，6表示未经任何转染但经40uM ATRA处理的细胞；
图7C中，1表示未经任何转染和处理的细胞，2表示转入空载体但未经任何处 理的细胞，3表示转入siRNA干扰载体但未经任何处理的细胞，4表示转入siRNA 干扰载体且用0. 4%DMS0处理的细胞，5表示转入siRNA干扰载体且经40 u M ATRA 处理的细胞，6表示未经任何转染但经40uMATRA处理的细胞，图中箭头指示的是凋亡小体。
5、转染后细胞中AFP对RAR-p和survivin promoter相互作用的影响
(1) 用ChIP技术进行研究将肝癌细胞用含10。/o胎牛血清的RPMI-1640调整 到3.0xl()4个/ml， 3ml细胞液培养于10cm2的培养皿，每组设2个平行皿，待细胞 培养80%融合后，转入pGPU6/GFP/Neo/siRNA质粒，转染12h后更换新的培养液再 培养细胞18h;非转染质粒组按照相同的条件培养细胞。完成转染后，加入ATRA
(160,1/L)处理细胞2小时，按文献(Testa A. et al. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) on Chip Experiments Uncover a Widespread Distribution of NF-Y Binding CCAAT Sites Outside of Core Promoters. J. Biol. Chem. ， 2005; 280: 13606 - 13615.)的方法固定细胞，超声粉碎细胞，免疫沉淀 相应的蛋白质-DNA复合体(所用的抗体为小鼠抗人RAR-(3单克隆抗体)，解交联， 用UPstate (USA)公司提供的ChIP试剂盒(EZ ChIP )提取DNA片段，PCR扩增 基因survivin的启动子DNA拷贝。2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，用凝胶成像系统 扫描DNA条带。Input代表的是用于做染色体免疫共沉淀总的染色体。Marker: 100 bp DNA梯度；IgG:是用于做染色体免疫共沉淀对照的非免疫兔血清IgG。
PCR扩增survivin所用的引物序列为 Sense 5' -GATTACAGGCGTGAGCCACT-3'
Antisense5' -ATCTGGCGGTTAATGGCGCG-3'
结果如图8A所示，结果表明，对于Bel 7402细胞和H印G2细胞，干扰AFP表 达并经ATRA处理后，ATRA更能促进RAR-P与DNA的顺式元件结合；对于HLE细胞
(不表达AFP)，干扰AFP表达并经ATRA处理后，RAR-0与DNA的结合程度则没 有显著性变化。
图8A中，I组表示转染siRNA干扰载体的细胞，II组表示转入空载体 pGPU6/GFP/Neo的细胞；A表示未经任何处理，B表示经ATRA (160fimol/L)处理； I组中泳道1表示marker,泳道2表示i叩ut，泳道3表示非免疫兔血清IgG沉淀 组，泳道4表示抗RAR-p单克隆抗体沉淀组；II组中泳道1表示i叩ut，泳道2表 示非免疫兔血清IgG沉淀组；泳道3表示抗RAR-(5单克隆抗体沉淀组。
ChIP技术研究表明，AFP能阻止RAR-p与survivin的启动子结合，RNA干扰技 术封阻AFP表达后，再用ATRA处理，则增强RAR-p与survivin的启动子结合。
(2) pcDNA3. 1-3// 的构建
17s/p基因的获得以AFP基因全长DNA为模板，用如下引物进行扩增 Sense 5' -TAGG AATT CTAG CAAC CATG AATG TGGT GG-3'
Antisense5' -AGCT CTAG ATTA AACT CCCA AAGC AGCA CG-3'.
用限制性内切酶^coR I和i7;s I酶切上述PCR产物，再用相同的酶酶切载体 pcDNA3. 1，连接，得到重组载体pcDNA3. 用G418方法进行筛选，再测序验
证，得到结构正确的重组载体pcDNA3. l-a^。
将pcDNA3. 1-3//7转入HLE细胞，再用Western blot分析HLE细胞在转染 pcDNA3. l-a/p后的AFP表达情况，结果如图8B所示(泳道1表示没有任何处理的 对照组，泳道2表示转入空载体pc丽A3. 1的HLE细胞，泳道3表示转入pcDNA3. l-a/p 的HLE细胞，a表示AFP，b表示(3-actin).表明在转染pcDNA3. 1-a/p后，HLE细胞 明显有AFP表达。
(3)将转入pcDNA3. 1- 的HLE细胞用ATRA(160 y M )处理24小时，再用 Western blot分析HLE细胞中survivin表达的变化。结果如图8C所示(泳道1 表示没有任何处理的对照组，泳道2表示未经任何转染但用160 uMATRA处理后 的HLE细胞，泳道3表示转染pcDNA3. l-a/p但未经任何处理的HLE细胞，泳道4 表示转染pcDNA3. 1-a/p且经160 u M ATRA处理后的HLE细胞，泳道5表示转染空 载体pcDNA3. 1且经160 u M ATRA处理后的HLE细胞，a表示survivin， b表示 (3-actin)，表明survivin的表达明显升高，ATRA对survivin表达的抑制明显减 弱。
以上结果表明在胞浆里AFP与RAR-e相互作用，能抑制RA-RAR信号的传递， AFP是RAR信号传递的辅抑制子。肝癌细胞耐受ATRA是因为在细胞胞浆里AFP与 RAR相互作用，阻断RA-RAR-3信号途径。细胞内的AFP能够阻止ATRA与RAR-P 相互结合，继而形成复合体，阻止RAR-P与DNA结合，因而促进survivin的表达， 导致细胞肿瘤细胞增殖(图8A-C)。
图8D为细胞内的AFP和血液循环里的AFP对肝癌Bel 7402细胞耐受ATRA的 影响示意图。
综上试验结果表明用ATRA (10-160一)处理人肝癌Bel 7402细胞24小时后， MTT检测结果显示，ATRA大于80ioM时，对肝癌细胞的增殖才有明显的抑制作用， 而AFP在浓度大于10mg/L时对Bel 7402细胞的生长则有促进作用；这些药物对Bel 7402细胞生长的影响有剂量和时间的依赖性；AFP和ATRA共同处理肝癌细胞，则观察到AFP具有对抗ATRA的诱导凋亡作用。显微镜技术和DAPI标记表明，大剂量 的ATRA (160|i M)处理24小时后能诱导肝癌Bel 7402细胞凋亡小体的形成；细胞 流式分析发现，ATRA阻止肝癌细胞周期进入M/G2期，从而抑制细胞生长；ATRA处 理Bel 7402细胞24小时后，Western Blotting检测发现，ATRA不仅能促进肝癌 细胞表达RAR-p，而且也能抑制AFP和survivin的表达；CO-IP和共聚焦激光显微 镜技术研究发现，AFP能与RAR-財目互作用，并在细胞浆有共定位现象；当用ATRA
(160nM)分别处理细胞24小时后，发现AFP还能与RAR-(5相互作用，但有部分RAR-卩 移入细胞核。RANi技术干扰AFP表达后，再用ATRA (40pM)处理Bel 7402细胞12 小时后，发现肝癌Bcl-2和survivin的表达明显下降，肝癌细胞对低剂量的ATRA
(40,)也敏感。ChIP技术研究表明，AFP能阻止RAR-(3与survivin的启动子结合， RNA干扰技术封阻AFP表达后，再用ATRA处理，则增强RAR-(3与survivin的启动 子结合。
结论肝癌细胞能耐受药理剂量的ATRA诱导作用，其主要原因是肝癌细胞合 成的AFP能与RAR-p结合，影响RAR-p转录调节功能，AFP阻止RAR-(5入核抑制 survivin的表达是Bel 7402细胞耐受ATRA诱导凋亡的关键环节。
权利要求
1、甲胎蛋白及其编码基因在设计和/或筛选药物中的应用。
2、 以甲胎蛋白及其编码基因为靶点的物质在制备药物中的应用。
3、 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述药物为用于预防和/或治疗肝癌的药物。
4、 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述以甲胎蛋白及其编码基因为靶点的物质为核酸。
5、 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述核酸为抑制所述甲胎蛋白编码基因表达的小干扰RNA、表达所述小干扰RNA的载体、表达抑制所述甲胎蛋白 编码基因表达的shRNA的载体、与所述甲胎蛋白编码基因发生同源重组且抑制所述 甲胎蛋白编码基因表达的同源序列或含有所述同源序列的载体。
6、 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述shRNA由茎I、环和茎II 构成的茎环结构；所述茎I的序列为GAAC GUGG UCAA UGUA UAAU，所述茎II的序列 为AUUAU ACAU UGAC CACG UUC，所述环的序列是UCAAGAG。
7、 一种以甲胎蛋白及其编码基因为靶点的用于预防和/或治疗肝癌的药物。
8、 根据权利要求7所述的药物，其特征在于所述药物的活性成分为核酸。
9、 根据权利要求8所述的药物，其特征在于所述核酸为抑制所述甲胎蛋白 编码基因表达的小干扰RNA、表达所述小干扰RNA的载体、表达抑制所述甲胎蛋白 编码基因表达的shRNA的载体、与所述甲胎蛋白编码基因发生同源重组且抑制所述 甲胎蛋白编码基因表达的同源序列或含有所述同源序列的载体。
10、 根据权利要求9所述的药物，其特征在于所述shRNA由茎I、环和茎II 构成的茎环结构；所述茎I的序列为GAAC GUGG UCAA UGUA UAAU，所述茎II的序列 为AUUAU ACAU UGAC CACG UUC，所述环的序列是UCAAGAG。
全文摘要
本发明公开了甲胎蛋白及其编码基因的新用途。一种新用途为甲胎蛋白及其编码基因在设计和/或筛选药物中的应用。一种以甲胎蛋白及其编码基因为靶点的用于预防和/或治疗肝癌的药物。本发明的药物能够通过抑制肝癌细胞内AFP蛋白的表达，从而减少AFP与RA的受体RAR-β的结合，使更多的RAR-β进入细胞核中，与survivin的启动子结合从而抑制survivin的表达，进而抑制肝癌细胞的增殖。试验证明，对于没有用本发明药物处理过的肝癌细胞，要用80μM或更大剂量的ATRA才能抑制肝癌细胞的增殖，而用本发明药物能靶向的抑制肝癌细胞AFP的表达，通过阻断AFP的表达，减少AFP促进肝癌细胞增殖或减轻AFP对ATRA的对抗作用，可以把ATRA诱导肝癌细胞凋亡的剂量降低到40μM以下，因此，本发明的药物增加了肝癌细胞对RA的敏感性，在靶向治疗肝癌领域有重要的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK101475996SQ20091007755
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者刚 李, 李孟森 申请人:北京大学