专利名称：检测黄病毒属病毒的基因芯片探针及基因芯片检测方法
技术领域：
本发明涉及一组可检测黄病毒属病毒的基因芯片探针及一种通用的黄病毒属病
毒基因芯片检测方法。
背景技术：
目前针对病毒性病原体的检测，检测方法仍然局限于传统的免疫荧光检测、ELISA 及PCR检测，尽管具有较好的特异性，但仅能同时检测一种或几种病原体，耗时且费力。基 因芯片技术具有快速、高通量的特点，可设计多种病毒的检测探针，点在同一张芯片上，用 来检测多种病原体。与传统方法相比，可大大提高检测效率。 目前对黄病毒属中登革病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒等的检测，有直接免疫 荧光方法、间接免疫荧光的方法，实时定量PCR方法，RT-PCR检测方法等(1'2'3'4)。这些方法 均可仅检测一种或几种黄病毒属病毒。采用基因芯片方法检测黄病毒属中的病原体，国外 文献中有设计人类全部致病病毒的检测探针的报道(5，6)，即广谱型基因芯片。该种基因芯 片覆盖面广，可用于几乎全部人类致病的病毒性病原体的初步筛查和检测，但该芯片并未 对黄病毒属中病毒探针特异性的实验验证及用于临床样品的检测报道。
用基因芯片方法检测病原体，目前常见的问题是检测结果容易出现假阳性或假阴 性的问题。原因在于病毒基因的扩增方法，目前常用随机PCR扩增方法，由于病毒具有细胞 内寄生的特性，提取RNA过程中不可避免地会提取到宿主细胞的DNA及RNA，真核生物的基 因组通常比病毒基因组大数十倍，随后的随机扩增过程中，含量高的基因将得到优势扩增， 干扰了病毒基因组的有效扩增，从而造成检测结果的假阳性或假阴性。
参考文献 1 :Niedrig M， Kiirsteiner 0， Herzog C， Sonnenberg K. Evaluation of an indirectimm皿ofluorescence assay for detection of immunoglobulin M(IgM)and IgGantibodies against yellow fever virus. Clin Vaccine Immunol. 2008Feb ; 15(2): 177-81. Epub 2007Nov 28. 2 :Lanciotti RS. Molecular amplification assays for the detection offlaviviruses. Adv Virus Res. 2003 ;61 :67—99. 3 :Holzmann H. Diagnosis of tick-borne encephalitis. Vaccine. 2003Apr 1; 21Suppl 1 :S36-40. 4:Koraka P， Zeller H， Niedrig M， 0sterhaus AD， Groen J. Reactivity of serumsamples from patients with a flavivirus infection measured by imm皿ofluorescenceassay and ELISA. Microbes Infect. 20020ct ;4 (12) :1209-15.
5 :David Wang， Laurent Coscoy， Maxine Zylberberg， et al. Microarray-baseddeteetion and genotyping of viral pathogens, PNAS，2002(99)， 15687-15692 6 :Cheng—Chung Chou， Te—Tsui Lee， Chun_Houh Chen， et al.Design ofmicroarrayprobes for virus identification and detection of emerging viruses atthe ge墜level.BMC Bioinformatics 2006,7:23
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一组检测黄病毒属病毒的基因芯片探针及一种通用的基因芯片检测方法。使用该探针检测黄病毒属病毒，能提高检测结果的特异性和准确性，而且可同时检测多种病原体。 本发明提供的技术方案是设计一组可检测黄病毒属多种病毒的检测探针，并采用一种通用的病毒基因处理与扩增方法，进行黄病毒属病毒的基因芯片检测。包括黄病毒属中的森林脑炎病毒、乙型脑炎病毒、登革病毒。黄病毒属森林脑炎病毒(Tick borneenc印halitis)探针、登革病毒(Dengue virus)探针、乙型脑炎病毒(Japaneseenc印halitis)探针序列如下森林脑炎病毒(Tick borne enc印halitis)探针序列包括5条，分别如SEQ IDNo. 1至SEQ ID No. 5所述；登革病毒(Dengue virus)探针序列包括5条，分别如SEQ IDNo. 6至SEQ ID No. 10所述；乙型脑炎病毒(J即anese enc印halitis)探针序列包括5条，分别如SEQ ID No. 11至SEQ ID No. 15所述。
所述的基因芯片探针的制备方法，包括以下步骤 1)设计病原体特异性探针从Genbank中搜索权利要求1所述的全基因序列，对
每种病毒序列分别进行比对分析，设计病毒属特异性的反转录引物，进而确定种内保守序
列，针对保守序列设计检测探针，从中挑选出权利要求1所述的的森林脑炎病毒、登革病
毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒探针序列； 2)合成探针；探针由上海生工公司合成。 所述的病毒属特异性的反转录引物，其序列为SEQ ID No. 16所述。 —种所述检测黄病毒属病毒基因芯片探针的使用方法，包括以下步骤 1)基因芯片的制备将合成后的探针溶于3XSSC溶液内，用点样仪在醛基化玻片
上进行点样，同时将丙肝病毒的一段寡核苷酸探针(5'-cctcccgggagagccatagtggtctgcgga
accggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcct-3，)点在玻片上作为阳性对照探针，点样完
成后用紫外交联仪照射30秒，照射能量为65焦耳，以固定探针。 2)病原体RNA提取及合成cDNA :将待测样本用RNA提取试剂盒处理获得病原体RNA，同时提取BHK细胞的RNA作为阴性对照，然后利用权利要求3中所述的反转录引物进行反转录获得病原体cDNA待用； 3)病原体基因组的扩增以病原体和BHK细胞的基因组双链cDNA为模板扩增病毒基因组，采用含有aa-dUTP的dNTP混合物，以将aa-dUTP掺入到扩增产物中，扩增反应条件为 94。C变性5min，然后94。C变性30sec，40。C退火30sec，50。C退火30sec，72。C延伸lmin，反应40个循环； 4)染料标记将病原体PCR产物纯化标记CY3染料，用CY5标记BHK细胞基因组作为阴性对照，室温下避光反应lh，间隔15min振荡混匀一次，然后加入4. 5ul羟胺(4M)，避光反应15min，使反应体系中未与DNA结合的染料淬灭。然后用PCR纯化试剂盒对标记产物进行纯化，以洗掉多余的染料。 5)预杂交先将所述的芯片点上50iil预杂交液(5XSSC，0. 1%SDS，0. 1%BSA)，盖上盖玻片，置42t:水浴锅中预杂交1-1. 5h。然后用水洗涤两次，用离心机甩干芯片。
6)杂交向纯化后的荧光染料标记的基因中加入35iU杂交液(50%去离子甲酰胺，5XSSC，0. 1% SDS，O. 5ii g/ii 1鲑鱼精DNA)，置PCR仪中95。C变性5min，取40ii 1加于芯片上，盖上盖片。置杂交盒中42t:杂交2 4h。取出杂交后的芯片，轻轻除去盖片。芯片分别于洗液1(2XSSC，0. 1% SDS)、洗液II (0. 2XSSC，0. 1% SDS)、洗液III (0. 2XSSC)中洗涤5min，最后用无水乙醇漂洗2min，用离心机甩干芯片。 7)芯片扫描取出杂交后的芯片用芯片扫描仪进行扫描，CY3荧光染料用532nm波长，CY5荧光染料用635nm波长。然后判断结果。
本发明的具有如下优点 本发明设计了可用于检测多种黄病毒属病毒如乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒等的基因芯片探针，将此3种病毒探针与其它多种病毒的探针共同点在同一张基因芯片上，可同时检测多种病原体，与传统的免疫荧光、RT-PCR等方法相比，可简化实验流程，縮短实验时间。并且，本发明设计了可特异性反转录黄病毒属病毒的通用引物序列，提出了半特异的病毒基因扩增方法，可特异性扩增病毒基因，降低宿主基因的干扰，提高了检测结果的特异性和准确性。该方法可用于黄病毒属所有病毒的基因扩增和基因芯片检测。
图1为乙型脑炎病毒的芯片检测图； 图2为乙型脑炎病毒的基因芯片检测分析结果图； 图3为登革病毒的检测图； 图4为登革病毒的芯片杂交分析结果图； 图5为森林脑炎病毒的芯片检测图； 图6为森林脑炎病毒的芯片杂交分析结果图。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1 :检测黄病毒属病毒的基因芯片的制备 1、设计病原体特异性探针从Genbank中搜索多种病毒的基因序列，包括森林脑炎病毒(Tick borne enc印halitis)、登革病毒(Dengue virus)、乙型脑炎病毒(Japaneseenc印halitis)的全基因序列。用Clustal. 83对每种病毒序列分别进行比对分析，设计病毒属特异性的反转录引物，该反转录引物序列如序列表SEQ ID No. 16所述。进而确定种内保守序列，针对保守序列用Array designer 4. 0软件设计检测探针，通过在Genbank中对探针进行序列比对分析，挑选出特异性较强的探针序列。每种病毒确定探针数量5条，长度约50bp。所述的探针序列如序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 15所述。
2、合成探针探针序列由华大基因公司合成。 3、基因芯片的制备将包括森林脑炎病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒等的共计18种病毒的检测探针合成后溶于3 X SSC溶液内，用点样仪在醛基化玻片上进行点样。同时将
丙肝病毒的一段寡核苷酸探针(5'_CCtCCCggg￡lg￡lgCC￡lt￡lgtggtctgCgg￡l￡lCCggtg￡lgt￡lC￡lCCgg
aattgccaggacgaccgggtcct-3')点在玻片上作为阳性对照探针。点样完成后用紫外交联仪照射30秒，照射能量为65焦耳，以固定探针。 实施例2 :用实施例1制备的基因芯片检测黄病毒属病毒
1 、病毒核酸提取及合成cDNA 病毒的RNA提取，操作步骤按RNA提取试剂盒(QIAGENE公司产品)说明书进行，同时提取BHK细胞(购自ATCC)的RNA作为阴性对照。病毒RNA在DNase I作用下37°C 20min降解其中的DNA分子。然后利用黄病毒属特异性引物进行反转录，引物序列如SEQ IDNo. 21所述，即5' -3， GTTTCCCAGTAGGTCTCTTCCCATCATGTT， AMV反转录酶是Fermentase公司产品。42t:反应lh。然后在Klenow酶(Fermentase公司产品)的作用下利用随机引物5' -GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN-3'合成第二链，BHK细胞RNA的反转录及第二条链的合成均在随机引物的引导下合成。
2 、病毒基因组的随机扩增 以病毒和BHK 细胞的基因组双链cDNA 为模板，禾U用引物(5， -GTTTCCCAGTAGGTCTC-3')扩增病毒基因组，采用含有aa-dUTP的dNTP混合物(Sigma公司产品)，以将aa-dUTP掺入到扩增产物中。反应条件为94t:变性5min，然后94。C变性30sec， 40。C退火30sec， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin，反应40个循环。
3、染料标记 将病毒PCR产物纯化标记CY3染料，室温下避光反应lh，间隔15min振荡混匀一次。然后加入4. 5ul羟胺(4M)，避光反应15min，使反应体系中未与DNA结合的染料淬灭。同时用CY5标记BHK细胞基因组作为阴性对照。然后用PCR纯化试剂盒对标记产物进行纯化，以洗掉多余的染料。 4、预杂交先将所述的芯片点上50ii1预杂交液(5XSSC，0. 1% SDS，O. 1% BSA)，盖上盖玻片，置42t:水浴锅中预杂交1-1. 5h。然后用水洗涤两次，用离心机甩干芯片。
5、杂交向纯化后的荧光染料标记的基因中加入35iU杂交液(50%去离子甲酰胺，5 X SSC， 0. 1 % SDS， 0. 5 ii g/ ii 1鲑鱼精DNA)，置PCR仪中95。C变性5min，取40 ii 1加于芯片上，盖上盖片。置杂交盒中42。C杂交2 4h。
6、芯片扫描 取出杂交后的芯片，轻轻除去盖片。芯片分别于洗液I(2XSSC，0. 1% SDS)、洗液II (0. 2XSSC，0. 1% SDS)、洗液III (0. 2XSSC)中洗涤5min，最后用无水乙醇漂洗2min，用离心机甩干后，进行芯片扫描，CY3荧光染料用532nm波长，CY5荧光染料用635nm波长。
杂交扫描后用Gen印ix软件进行分析，将CY3荧光信号值从高到低排列，取荧光信号CY3/CY5 > 2且CY3 > 500的点作为阳性信号，每种病毒的5条检测探针若有2条以上出现阳性信号，则该病毒检测结果判定为阳性，荧光信号值越强，说明待测样本基因与探针序列互补匹配性越好，为该探针所代表病毒的可能性越大。三种病毒的检测结果如图1至图6所示。 乙型脑炎病毒的芯片检测结果中，出现了 3条乙型脑炎病毒检测探针的阳性信号，登革病毒和森林脑炎病毒分别出现了 2条和3条特异性检测探针阳性信号，未出现其他病毒的特异性信号。说明本发明人所设计的乙型脑炎病毒、登革病毒和森林脑炎病毒检测
探针具有较好的特异性和灵敏性，本发明人所设计的黄病毒属保守区引物，可特异性引导
病毒基因的合成和扩增。 核苷酸序列表 〈110>(申请人) 〈120〉检测黄病毒属病毒的基因芯片及基因芯片检测方法 〈160>16 〈210>1 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林脑炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400〉 1 CTCCATACCG CCCAGAGGTG ATAGAAGCAC TACACAGATT TCAACTGCGG 50 〈210>2 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林脑炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>2 GATTCTTGGA GTGATGGGAC TGTGGACGCT ATCAGAAATG ATGAGATCGG 50 〈210>3 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林脑炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>3 CAGACTGTCA TTCTTGAGCT TGATAAGACT CTGGAACACC TTCCGACGGC 50 〈210>4 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林脑炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>4 GGGACTTATG TGCTGGTGGT GTCTCTCTTC ACTCCATACA TCATCCACCA 50 〈210>5 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林脑炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>5 CGAGAGATGG TGACAATCTA CTTCCTCTTG TTGGTCTTGG AGCTAGGGTT 50 〈210>6 〈211>50
7
〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>6 CACTCTATGG AGCAATGGAG TCCTGGAAAG TGAGATGATA ATCCCAAAGA 50 〈210>7 〈211>50 〈212>DNA 〈213〉登革病毒(Dengue virus) 〈400>7 TCCCCAAGAT AACCAATTAA CTTATGTTGT CATAGCCATC CTCACAGTGG 50 〈210>8 〈211>50 〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>8 GCCACAACAG TAATAACACC AATGCTGAGA CATACCATAG AGAATTCCAC 50 〈210>9 〈211>50 〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>9 TAGAGTGATA GACCCTAGAA GATGCCTCAA GCCAGTTATC CTACCAGATG 50 〈210>10 〈211>50 〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>10 GCTGGACAAC TACTCTTGAT GAGAACAACA TGGGCTTTCT GTGAAGTCTT 50 〈210>11 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型脑炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400〉 11 CACTACAGGA GTCTACCGAA TTATGGCTAG AGGGATTCTT GGCACTTACC 50 〈210>12 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型脑炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>12
GAGGGCTCTA TACCTAGACA CTTACAGAAT CATCCTCCTC GTCATAGGGA 50 〈210>13 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型脑炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>13 ACTTATTGTT GCCATTACTG TGATGACAGG AGGATTCTTC CTACTAATGA 50 〈210>14 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型脑炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>14 GCAGAACAAG AGCCGTGGGA AAGGGAGAAG TCCATAGCAA TCAGGAGAAA 50 〈210>15 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型脑炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>15 TGACAGTAAC CTAGCCCATT GGACAGAGGC AAAGATCATG TTAGACAACA 50 〈210>16 〈211>30 〈212>DNA 〈213>黄病毒属 〈400>16 GTTTCCCAGT AGGTCTCTTC CCATCATGTT 30
9
权利要求
一组可采用基因芯片的方法检测黄病毒属多种病毒的探针，其特征在于它包括森林脑炎病毒(Tick borne encephalitis)探针、登革病毒(Dengue virus)探针、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis)探针，所述探针序列如下森林脑炎病毒(Tick borne encephalitis)探针序列包括5条，分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所述；登革病毒(Dengue virus)探针序列包括5条，分别如SEQ ID No.6至SEQ ID No.10所述；乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis)探针序列包括5条，分别如SEQ ID No.11至SEQ ID No.15所述。
2. 根据权利要求1所述的基因芯片探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤1) 设计病原体特异性探针从Genbank中搜索权利要求1所述的全基因序列，对每种病毒序列分别进行比对分析，设计病毒属特异性的反转录引物，进而确定种内保守序列，针对保守序列设计检测探针，从中挑选出权利要求1所述的的森林脑炎病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒探针序列；2) 合成探针。
3. —条可特异性引导黄病毒病毒基因反转录合成的引物，其特征于所述的病毒属特异性的反转录引物，其序列为SEQ ID No. 16所述。
4. 一种如权利要求1所述检测黄病毒属病毒的基因芯片探针的使用方法，其特征在于包括以下步骤1) 基因芯片的制备将权利要求1所述的探针溶于3XSSC溶液内，用点样仪在醛基化玻片上按预先设定好的顺序进行点样，同时将丙肝病毒的一段寡核苷酸探针点在玻片上作为阳性对照探针，点样完成后用紫外交联仪照射，以固定探针；2) 病原体RNA提取及合成cDNA :将待测样本用RNA提取试剂盒处理获得病原体RNA，同时提取BHK细胞的RNA作为阴性对照，然后利用权利要求3中所述的反转录引物进行反转录获得病原体cDNA待用；3) 病原体基因组的扩增以病原体和BHK细胞的基因组双链cDNA为模板扩增病毒基因组，采用含有aa-dUTP的dNTP混合物，以将aa-dUTP掺入到扩增产物中，扩增反应条件为94。C变性5min，然后94。C变性30sec，40。C退火30sec，50。C退火30sec，72。C延伸lmin，反应40个循环；4) 染料标记将病原体PCR产物纯化标记CY3染料，用CY5标记BHK细胞基因组作为阴性对照5) 预杂交先将所述的芯片点上预杂交液，置42t:水浴锅中预杂交1-1. 5h，然后洗涤，并甩干芯片；6) 杂交向纯化后的荧光染料标记的基因中加入杂交液，置PCR仪中95t:变性5min，取出加于芯片上，置杂交盒中42t:杂交2 4h，取出杂交后的芯片，将芯片放入洗液中洗涤，然后用无水乙醇漂洗，并甩干芯片；7) 芯片扫描取出杂交后的芯片用芯片扫描仪进行扫描，CY3荧光染料用532nm波长，CY5荧光染料用635nm波长，然后判断结果。
全文摘要
本发明提供一组检测黄病毒属病毒的基因芯片探针及一种通用的检测方法。包括森林脑炎病毒(Tick borne encephalitis)探针、登革病毒(Denguo virus)探针和乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis)探针，并设计了可特异性反转录黄病毒属病毒的通用引物序列，利用该病毒属特异性引物进行反转录，以引导病毒基因组的合成，从而尽可能地减少宿主细胞基因成分的干扰，提高了检测结果的特异性和准确性。本发明可用于黄病毒属所有病毒的基因扩增和森林脑炎病毒、登革病毒和乙型脑炎病毒的基因芯片检测。
文档编号C12N15/10GK101781687SQ200910077169
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者刘洪 , 孙庆歌, 康晓平, 李永强, 杨银辉, 祝庆余 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所