专利名称：以卵裂后的发育胚胎替代卵母细胞的治疗性克隆新方法
技术领域：
本发明涉及一种新的核移植受体，该核移植受体为卵裂后的发育胚胎，本发明还 涉及一种获得核移植受体的方法，使用所述核移植受体获得胚胎干细胞的方法，以及使用 该核移植受体获得克隆动物的方法。本发明还涉及一种治疗性克隆新方法，其中，以卵裂后 的发育胚胎替代卵母细胞作为核移植受体。
背景技术：
随着环境恶化、人类年龄延长、农药和抗生素的滥用，人类各种疑难病越来越多， 胚胎干细胞(ES细胞)为解决上述问题提供很多机遇，胚胎干细胞因其具有在体外可无限 增殖，在一定条件下又可以向某一方向诱导分化的特点，为治疗和修复人类身体的组织提 供了诱人的应用前景和巨大的商业潜值。1997年克隆羊多莉诞生，1998年人类成功建立人胚胎干细胞系，人们开始思索将 核移植和胚胎干细胞这两项振奋人心的技术结合起来，提出了治疗性克隆技术。利用核移 植技术可以生产用于组织和细胞替代治疗的人类胚胎细胞，干细胞定向分化为特定的组织 类型，来替代那些受损的体内组织。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重 组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的 特定细胞类型(如神经细胞、肌肉细胞和血细胞)，用于替代疗法。这种核移植法得到的干 细胞和分化细胞由于与供体细胞同源，因此在组织和细胞替代治疗中不会发生免疫排斥。 然而，由于作为重编程受体的人卵母细胞的稀缺，使治疗性克隆的应用受到了限制。自二十世纪中叶人们认为相对于卵母细胞，受精卵以及早期胚胎几乎没有重编程 能力；但2007年Nature报道了受精卵可以重编程体细胞核并获得克隆动物彻底改变了之 前人们的观点。受精卵也可以重编程体细胞获得克隆胚胎干细胞系。但受精卵的来源依然 有限，而据最新研究发现，世界范围内在各IVF中心有大量的冻存的早期废弃胚胎。如果这 些胚胎能用于治疗性克隆，就可以大大缓解重编程受体不足的状况。关于核移植技术的发展过程，可通过以下描述而获知 早在1958年Gurdon等人将爪蟾分化细胞的核物质移植到去核卵母细胞中即获得 了克隆动物(Gurdon et al.，1958)，从而推翻了之前被广泛接受的分化状态不可逆转的假 说(Briggs and King，1952)。之后，McGrath和Solter等通过受精卵原核互换可得到到 期小鼠的实验(受精卵为供体)，证明在哺乳动物中同样可以获得克隆动物(McGrath and Solter, 1983)。同时，对于分化细胞的细胞核，他们试图用间期去核受精卵作为受体对其进 行重编程，却不具备这样的能力(McGrath and Solter, 1984) 0然而，与合子细胞质不同的 是，MII期卵母细胞的细胞质具有重编程分化细胞核的能力。迄今为止，已经获得了 12个 物种的克隆动物(Baguisi et al.，1999 ；Chesne et al.，2002 ；Galli et al.，2003 ；Kato et al. , 1998 ；Lee et al. ,2005 ；Li et al. ,2006 ；Polejaeva et al. ,2000 ；Shin et al., 2002 ；Wakayama et al. ,1998 ；Wilmut et al. ,1997 ；Woods et al. ,2003 ；Zhou et al.， 2003)。在此期间，Wakayama等也曾重新评估合子细胞质的重编程能力，得到了否定的结论(ffakayama et al.，2000)，为 Solter 的观点提供了佐证(Solter，1999)。然而，2006 年 Eggan等证明中期的小鼠受精卵胞质具有重编程的能力(Greda et al.，2006)。最近，Egli 等进一步证实了 Eggan等人的实验结果，同时认为重编程因子存在于核中，只有核膜破裂 的中期受精卵才具有重编程能力(Egli，et al，2007)。如上所述，目前，成熟卵母细胞和受精卵是唯一可以获得体细胞来源克隆胚胎干 细胞和克隆动物的核移植受体。但是作为克隆技术中发挥重编程作用的受体一卵母细胞 的获得受到诸多限制，同时面临医学、伦理学等问题。利用受精卵作为受体为治疗性克隆开 辟了一个新的思路，但其来源依然有限。如果其他发育阶段的植入前胚胎也具有重编程能 力的话，就可以大大增加克隆受体来源的途径。因此，需要提供一种新的核移植受体来拓展治疗性克隆和克隆研究的供体来源， 而利用新的移植受体可为胚胎干细胞的获得、以及克隆动物的生产提供带来新的发展契 机。
发明内容
为了解决以上问题，本发明以卵裂后的发育胚胎替代卵母细胞作为一种新型的核 移植受体。本发明提供了一种获得核移植受体的方法，其特征在于，所述核移植受体为卵裂 后的发育胚胎，所述方法包括以下步骤将由卵裂后的发育胚胎的卵裂球融合成单细胞的 胚胎，以及使所述单细胞的胚胎同步到有丝分裂中期。将所述卵裂球根据孕鼠注射人绒 毛膜促性腺激素(HCG)的时间进行所述融合，通常在注射HCG之后38-40小时。通过用 0. 05 μ g/ml democolcine持续处理融合后的胚胎7小时，之后用2. 5-3μΜ MG-132处理 30-40分钟，使所述单细胞的胚胎同步到有丝分裂中期。所述卵裂后的发育胚胎例如为小鼠 2_细胞期胚胎。该融合具体为电融合。本发明涉及一种核移植受体，其特征在于，所述核移植受体为卵裂后的发育胚胎 的卵裂球融合而成的、并且同步到有丝分裂中期的单细胞的胚胎。本发明的核移植受体用于治疗性克隆，用于获得核移植胚胎干细胞以及用于克隆 动物。利用本发明的核移植受体获得胚胎干细胞的方法包括去除所述核移植受体的染 色体，进行核移植操作，获得重构胚胎；以及在所述重构胚胎发育到囊胚阶段时，分离核移 植胚胎干细胞。核移植操作使用的供体选自胎儿体细胞、成体体细胞、胚胎干细胞或者卵裂 球。利用本发明的核移植受体获得克隆动物的方法包括去除所述核移植受体的染色 体，进行核移植操作，获得重构胚胎；以及在所述重构胚胎发育到囊胚阶段时，将其移植到 代孕动物的子宫中，获得所述克隆动物。
本发明还提供了一种治疗性克隆方法，其中，将卵裂后的发育胚胎替代卵母细胞 作为核移植受体，所述卵裂后的发育胚胎通过如下方法而用作核移植受体将卵裂后的发 育胚胎的卵裂球融合成单细胞的胚胎，以及使所述单细胞的胚胎同步到有丝分裂中期。所 述方法包括将所述卵裂球根据孕鼠注射HCG的时间进行电融合，(通常在注射HCG之后 38-40小时)。通过用0.05μ g/ml democolcine持续处理融合后的胚胎7小时，之后用2. 5-3 μ M MG-132处理30-40分钟，使所述单细胞的胚胎同步到有丝分裂中期。由上所述，本发明在很大程度上解决了重编程受体不足的问题，可为治疗性克隆 中移植受体的选择提供新思路；为治疗性克隆在临床上的应用研究开辟了新的思路，有助 于治疗性克隆的研究；并且有助于动物克隆的进一步发展。
图 1 是通过 PCR 微卫星标记 DlMit62，D7Mit44 和 D17Mit49(Zhou et al. ,2001) 来鉴定克隆小鼠以及NT-ES的来源的实验结果。Fl代表(C57/B6 χ 129)杂交后的Fl代小 鼠，用该遗传背景的小鼠卵裂后的发育胚胎作为核移植的受体；CD-I为假孕小鼠；Rl是供 体细胞，克隆代表克隆小鼠，RlES代表小鼠胚胎干细胞Rl，CTES为NT-ES。图2是处于有丝分裂中期的胚胎的显微照片，显微镜的倍数为10 X 20。左图是2-细胞期胚胎融合前，右图是2-细胞期胚胎融合后的单细胞胚胎。图3是以处于有丝分裂中期的融合后的单细胞胚胎作为受体，以处于有丝分裂中 期的二细胞卵裂球作为供体进行核移植后获得的克隆囊胚的照片。左图是在活细胞工作站 (Leica)明场下的图片，中间为荧光镜下的图片，右图是合成图。图4是用胚胎干细胞Rl作供体获得的发育到期的胎儿的照片。
具体实施例方式材料与方法胚胎培养每20-30枚胚胎置于30 μ 1的KSOM培养液(CHEMIC0N)滴中，覆盖矿物油，并 在37 °C，5 % CO2的培养箱中培养。所有的常温操作均以修改的!fepes-buf f ered CZB medium(Chatot et al. , 1990)代替KSOM。常温操作指的是在培养箱外进行的操作。受体胚胎的制作及中期同步6-8周龄的B6D2F1 (C57BL/6XDBA/2)雌鼠腹腔注射10IUPMSG (孕马血清促性腺 激素)，48小时后注射10 IU hCG(人绒毛膜促性腺激素)并与B6D2F1雄鼠交配。从受 精的雌鼠输卵管中取卵裂后发育的2-细胞期胚胎培养在KSOM培养液滴中。卵裂球根据 孕鼠注射hCG的时间进行所述融合。33小时内分裂的卵裂球在注射hCG后38-40小时电 融合成单细胞的四倍体胚胎，注射hCG(人绒毛膜促性腺激素)后48小时至55小时，用 0. 05 μ g/mldemocolcine (Sigma)持续处理四倍体胚胎使其停止在前中期，Democolcine是 一种秋水仙素或秋水酰碱的类似物，该持续处理时间为大约7小时；33-38小时内分裂的 卵裂球在注射hCG后38-40小时电融合成单细胞的四倍体胚胎，在注射hCG后52-58小时 用democolcine处理，这样的胚胎将全部停止在前中期。之后用2. 5-3 μ M MG_132(全称为 Z-leu-leu-leu-al, Sigma)处理30-40分钟，从而将所有的胚胎同步到有丝分裂中期。供体细胞培养以及同步化使用了四种供体细胞，这四种供体细胞主要体现重编程不同分化程度的体细胞 核。供体胚胎干细胞Rl (Nagy et al.，1993)培养在丝裂霉素处理过的小鼠胎儿成纤 维细胞(MEF)上，培养液为含15% FBS (胎牛血清，Gibco)的DMEM，并添加1000U的LIF (白血病抑制因子，Chemicon)、2mM的谷氨酰胺(glutamine，Sigma)、ImM的丙酮酸钠(sodium pyruvate, Sigma)、\)J,R 0. ImM 的 β _ ^MZ^W- ( β -mercaptoethanol, Sigma)、0·ImM 必需氨基酸(non-essentialamino acid, Gibco)等。小鼠卵裂后的2-细胞期胚胎卵裂球用0.05 μ g/ml demecolcine处理3小时同步 到中期，作为供体。从13. 5天的小鼠胚胎中获取小鼠胎儿成纤维细胞(MEF) (Onoet al.，2001)，作为供体。小鼠尾尖成纤维细胞作为供体，其培养方法与Wakayama等方法相同(Wakayama and Yanagimachi, 1999) ο所有有丝分裂中期细胞均以0.04μ g/ml demecolcine处理3-5小时后，轻轻摇 晃，中期细胞将从饲养层上脱落，收获上清并离心之后去上清加入少量培养液重新悬浮即 可用于核移植操作。核移植操作核移植操作采用一步法(OSM) (Zhou et al. 2003)，即将供体细胞注入MII (有丝分 裂中期)融合后的单细胞胚胎后，在注射针退出的同时去除该单细胞胚胎的中期染色体。 注射针内径6 8 μ m，固定针外径80 μ m，内径30 μ m。每批取做30枚融合后的单细胞胚 胎，并在20 30分钟内完成。核移植操作30 60min后用含10mMSrC12、5 μ g/ml细胞松 弛素B (CB)、2 μ M MG-132的无钙CZB激活重构胚5 6h。之后，在37°C ,5% C02，饱和湿度 的条件下，于CZB培养液中培养。在核移植操作中，当供体为2-细胞期胚胎卵裂球或者胚胎干细胞Rl，则获得的重 构胚胎用于进行克隆小鼠的实验；当供体为小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)或者小鼠尾尖成纤 维细胞时，则获得的囊胚用于建立NT-ES细胞系。胚胎移植以及分离胚胎干细胞待重构胚胎发育到囊胚阶段，将其移植到dpc2. 5 (交配后2. 5天)的OT-I (远交 系小鼠)母鼠子宫角中。妊娠母鼠分别在dpc8. 5、dpclO. 5和dpcl9. 5天解剖观察体内发 育情况。19. 5天到期出生的克隆小鼠由⑶-1母鼠代乳。核移植胚胎干细胞系(NT-ES系)的建立和培养参照Bryja等的报道(Bryja et al.，2006)。基因组DNA分析通过PCR 微卫星标记 DlMit62，D7Mit44 和 D17Mit49(Zhou etal.，2001)来鉴定克 隆小鼠以及NT-ES的来源。 畸胎瘤和嵌合体小鼠的制作将IO7的NT-ES细胞注射到SCID (严重联合免疫缺陷病)免疫缺陷小鼠背脊处，4 周后获取畸胎瘤。每10-15个NT-ES细胞注射到⑶_1 (远交系)小鼠囊胚腔中，培养数小时后移植 到CD-I假孕鼠的子宫内，19. 5天后观察产下的胎儿。嵌合体小鼠培养6-8周后与CD-I小 鼠交配，并观察所产鼠仔的毛色，以判定是否能够种系嵌合。在一个具体实施例中，将10-15个NT-ES (黑色眼睛，棕色毛发)细胞注射到一个 ⑶-1 (远交系，眼睛为红色，白色毛发)小鼠囊胚腔中，培养1-3小时后移植到⑶-1假孕鼠的子宫内，17. 5天后观察产下的新生小鼠，若新生小鼠中某些小鼠眼睛的晶状体为黑色，或 者出生3周后毛色为花色或棕色，该小鼠为嵌合体小鼠。嵌合体小鼠培养6-8周后与CD-I 小鼠交配，观察所产仔鼠的毛色。由于NT-ES细胞所带基因(显性)表达后毛色为棕色，而 CD-I小鼠的基因(隐性)表达后毛色为白色，如果交配后所产的鼠仔的毛色为棕色，则可以 判定该NT-ES细胞能够种系嵌合。结果
卵裂后的发育胚胎可以重编程分化细胞的细胞核，获得克隆动物。通过PCR 微卫星标记 DlMit62，D7Mit44 和 D17Mit49(Zhou etal.，2001)来鉴定小 鼠以及NT-ES的来源的鉴定结果如图1所示。从该图1中可以看出小鼠和NT-ES具有供体 基因。用demecolcine与MG132处理电融合后的单细胞胚胎，可以稳定地获得处于有丝 分裂中期的单细胞胚胎(2-细胞期胚胎的两个卵裂球融合得到)(见图2)。以处于中期的融合后的单细胞胚胎作为受体，以处于中期的2-细胞期胚胎卵裂 球作为供体进行核移植，获得了高比例的克隆囊胚(见图3)。将这些囊胚移植到代孕的⑶-1母鼠中，可以高效地得到克隆胎儿，充分证明了卵 裂后的发育胚胎具有重编程的能力，改变了之前人们认为卵裂后的胚胎重编程能力较差的 观点。用分化程度更高的胚胎干细胞Rl作供体也可以获得发育到期的胎儿(见图4)，更 进一步说明了卵裂后的发育胚胎具有较强的重编程能力。卵裂后的发育胚胎可以重编程分化细胞的细胞核，获得具有多能性的NT-ES细胞 系在生成嵌合体小鼠的实施例中，⑶-1假孕鼠所产下的5只小鼠的毛色为棕色，由 于NT-ES细胞(129背景)为棕色毛色(显性)，而CD-I小鼠毛色为白色(隐性)，所产下 的小鼠为棕色或花色说明NT-ES细胞注射到CD-I小鼠的囊胚中能形成高度嵌合的嵌合体。嵌合体小鼠培养6-8周后与CD-I小鼠交配后所产的1只(即可)鼠仔的毛色为 棕色，说明了能够种系嵌合。卵裂后的2-细胞期胚胎可以重编程体细胞核，获得囊胚，并通过胚胎干细胞技术 建立NT-ES细胞系。这些NT-ES表达所有的ES细胞所特有的标记(例如Nanog，0ct4, Sox2, SSEA-I等)，当注射到⑶-1小鼠的囊胚中能形成高度嵌合的嵌合体，充分证明这些NT-ES 细胞完全满足当前所有的胚胎干细胞的标准，是具有多能性的胚胎干细胞系。这些NT-ES 细胞在体外可以诱导分化为可以跳动的心肌细胞以及有突触的神经细胞，说明这些NT-ES 细胞将来可以在体外诱导分化为细胞或组织，并移植回病人体内，彻底解决当前某些疾病 无法治疗的困境。由此可证明卵裂后的发育胚胎具有较强的重编程能力，可以用于治疗性克隆的研 究中，这在很大程度上解决了重编程受体不足的问题，为治疗性克隆在临床上的应用研究 开辟了新的思路，为解决治疗性克隆面临的人卵母细胞严重不足的问题，为解决人类治疗 性克隆的伦理问题开辟了新的途径。参考文献Bryja, V. , Bonilla, S. , Cajanek, L. , Parish, C. L. , Schwartz, C. Μ. , Luo, Y.,Rao, Μ. S.，and Arenas，Ε. (2006). An efficient method for thederivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells 24,844-849. Chatot, C. L.，Lewis, J. L.，Torres，I.，and Ziomek，C. A. (1990). Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZBmedium. Biol Reprod 42， 432-440.Nagy, A.，Rossant，J.，Nagy, R.，Abramow-Newerly, W.，and Roder, J. C. (1993). Derivation of completely cell culture-derived mice fromearly-passage embryonic stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A 90，8424—8428.Wakayama, T. ， and Yanagimachi, R. (1999).Cloning of male micefrom adult tail-tip cells. Nat Genet 22，127-128.Zhou，Q.，Jouneau, Α.，Brochard，V.，Adenot, P.，and Renard，J. P. (2001). Developmental potential of mouse embryos reconstructed frommetaphase embryonic stem cell nuclei.Biol Reprod 65,412-419.Zhou，Q.，Renard, J. P.，Le Friec，G.，Brochard, V.，Beaujean，N.，Cherifi, Y.， Fraichard，Α·，and Cozzi,J. (2003). Generation of fertilecloned rats by regulating oocyte activation. Science 302,1179.
权利要求
一种获得核移植受体的方法，其特征在于，所述核移植受体为卵裂后的发育胚胎，所述方法包括以下步骤将所述卵裂后的发育胚胎的卵裂球融合成单细胞的胚胎，以及使所述单细胞的胚胎同步到有丝分裂中期。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述卵裂球根据孕鼠注射人绒毛膜促 性腺激素的时间进行所述融合，通常在注射人绒毛膜促性腺激素之后38-40小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使所述单细胞的胚胎同步到有丝分 裂中期是通过用0. 05 μ g/ml democolcine处理融合后的所述单细胞胚胎7小时，之后用 2. 5-3 μ MMG-132处理30-40分钟来实现的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法获得的核移植受体。
5. 一种核移植受体，其特征在于，所述核移植受体为由卵裂后的发育胚胎的卵裂球融 合而成的、并且同步到有丝分裂中期的单细胞胚胎。
6. 一种利用权利要求4或5所述的核移植受体获得胚胎干细胞的方法，所述方法包括去除所述核移植受体的染色体，进行核移植操作，获得重构胚胎；以及在所述重构胚胎 发育到囊胚阶段时，分离核移植胚胎干细胞。
7.根据权利要求6所述的获得胚胎干细胞的方法，其中所述核移植操作使用的供体选 自胎儿体细胞、成体体细胞、胚胎干细胞或者卵裂球。
8. 一种利用权利要求4或5所述的核移植受体获得克隆动物的方法，其中所述方法包括去除所述核移植受体的染色体，进行核移植操作，获得重构胚胎；以及在所述重构胚胎 发育到囊胚阶段时，将其移植到代孕动物的子宫中，获得所述克隆动物。
9.根据权利要求4或5所述的核移植受体在获得核移植胚胎干细胞、克隆动物或治疗 性克隆中的应用。
10. 一种治疗性克隆方法，其特征在于，以卵裂后的发育胚胎作为核移植受体，所述卵 裂后的发育胚胎通过如下方法而用作核移植受体将所述卵裂后的发育胚胎的卵裂球融合成单细胞胚胎，以及使所述单细胞胚胎同步到 有丝分裂中期。
全文摘要
本发明涉及一种以卵裂后的发育胚胎替代卵母细胞的治疗性克隆新方法，其中，将所述卵裂后的发育胚胎作为核移植受体，该核移植受体通过以下方法获得将卵裂后的发育胚胎的卵裂球融合成单细胞的胚胎，以及使所述单细胞的胚胎同步到有丝分裂中期。本发明还涉及一种使用所述核移植受体获得胚胎干细胞的方法，以及使用所述核移植受体而获得克隆动物的方法。本发明在很大程度上解决了重编程受体不足的问题，可为治疗性克隆中移植受体的选择提供新思路。
文档编号C12N5/10GK101798569SQ200910077408
公开日2010年8月11日 申请日期2009年2月9日 优先权日2009年2月9日
发明者于洋, 周琪, 李伟, 王柳, 赵小阳, 阿姆贾德·里亚兹 申请人:北京华盛兴邦生物技术有限公司