抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中抗病转化MYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材 料与应用。
【背景技术】
[0002] 小麦(Triticuma aestivum)是人类赖W生存的四大作物之一，世界上1/3W上的 人口 W小麦为主食，小麦的产量与品质直接影响着人类的生存与生活质量。随着耕作制度、 肥水条件和气候条件等因素的改变，±传病害纹枯病、根腐病在我国小麦生产区呈加重发 生态势，已成为制约小麦高产、稳产的重要因素之一。
[0003] 小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是一种世界性小麦± 传真菌病害，主要是由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-l或 立枯丝核菌(化izoctonia solani)AG4、AG5融合群引起。我国小麦纹枯病主要病原菌为禾 谷丝核菌(化izoctonia cerealis)。纹枯病一般可使小麦减产10%~30%，严重地块则使 小麦减产50% W上。据全国农技推广站报道，2005-2015年我国小麦纹枯病每年发生面积 约1-1.2亿亩，经济损失达数十亿元W上，已成为我国小麦主产区小麦第一大病害。因此，选 育和推广抗性的小麦品种是防治小麦病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保证我 国小麦高产、稳产非常重要。然而，由于小麦纹枯病抗性均由多基因控制，缺乏理想的小麦 抗病种质资源，常规育种方法在选育对纹枯病抗性小麦品种方面的研究进展缓慢。分子生 物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。植物抗性蛋白基因的分离克隆 与功能分析，对阐明植物抗性机制、有效地进行分子育种研究十分必要，已成为国内外植物 科学研究的热点。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。
[000引为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为抗病相关蛋白（TaMYB-KW)的蛋白 质，该蛋白质为如下A1)、A2)或A3):
[0006] A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
[0007] A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质；
[0008] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0009] 其中，序列2由243个氨基酸残基组成。
[0010] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或簇基末端连接上如表1所示的标签。
[00川表1、标签的序列
[0012]
[0013] 上述A2)中的TaMYB-KW蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述A2)中的TaMYB-KW蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。
[0015] 上述A2)中的TaMYB-KW蛋白质的编码基因可通过将序列1的第99-830位所示的DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5/端和/或y端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016]为解决上述技术问题，本发明还提供了与化MYB-KW相关的生物材料，该生物材料 为下述B1)至B9)中的任一种：
[0017] B1)编码TaMYB-KW的核酸分子；
[0018] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0020] B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或 含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0021] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系；
[0022] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植 物组织；
[0023] B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植 物器官；
[0024] B8)降低TaMYB-KW表达的核酸分子；
[0025] B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
[0026] 上述生物才料中，B1)所述核酸分子可为如下bl)-b4)中任一种：
[0027] bl)其编码序列是序列表中序列1的第99-830位核巧酸的cDNA分子或DNA分子；
[0028] b2)其编码序列是序列表中序列1的第1-1028位核巧酸的cDNA分子或DNA分子；
[0029] b3)与bl)或b2)限定的核巧酸序列具有75%或75% W上同一性，且编码TaMYB-KW 的cDNA分子或基因组DM分子；
[0030] b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的核巧酸序列杂交，且编码化MYB-KW的cDNA分 子或基因组DNA分子；
[0031] B8)所述核酸分子为与序列表中序列1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA 分子。
[0032] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0033] 其中，序列1由1028个核巧酸组成，其中序列1的第99-830位核巧酸所示的DNA分子 编码序列2所示的蛋白质。
[0034] 本领域普通技术人员可W很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码TaMYB-KW的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 分离得到的TaMYB-KW的核巧酸序列75 %或者更高同一性的核巧酸，只要编码TaMYB-KW且具 有TaMYB-KW功能，均是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0035] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核巧酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％)表示，其可W 用来评价相关序列之间的同一性。
[0036] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SS阳(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0037] 上述75%或75%W上同一性，可为80%、85%、90%或95%^上的同一性。
[0038] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码TaMYB-KW的核酸分子的表达盒(TaMYB-KW基 因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达TaMYB-KW的DNA，该DNA不但可包括启动TaMYB-KW基 因转录的启动子，还可包括终止TaMYB-KW基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括 增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异 的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于:花挪菜花叶病毒的组成型启动子 35S:来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肤酶（"LAP"，Chao等人（1999)Plant Physiol 120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1 (PR1)(由水杨酸和 BTH(苯并嚷二挫-7-硫代径酸S-甲醋)诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启 动子(均可用莱莉酬酸甲醋诱导）；热休克启动子(美国专利5，187,267);四环素诱导型启动 子（美国专利5,057,422 );种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pFl 28 (CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子胆存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球 蛋白、napin,oleosin和大豆be1:a conglycin的启动子(Beachy等人（1985化MB0 J.4:3047- 3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全 文引用。合适的转录终止子包括但不限于:农杆菌姻脂碱合成酶终止子(N0S终止子）、花挪 菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、魏豆rbcS E9终止子和姻脂氨酸和章鱼氨酸合酶 终止子（参见，例如：〇dell等人（198日）化1脚6313:810;3〇36扣6'旨等人（1987)66116,56:125; Guerineau等人（1991)Mol .Gen.Genet,262:141 ;P;rou壯oot(1991)Cell ,64:671 ;Sanfaeon 等人Genes Dev. ,5:141 ;Mogen等人（1990)Plant Cell ,2:1261 ;Mun;roe等人（1990)Gene, 91:151;Ballad等人（1989)Nucleic Acids Res.17:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res .,15:9627)〇
[0039] 可用现有的表达载体构建含有所述TaMYB-KW基因表达盒的重组载体。所述植物表 达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、 pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3/端非翻译区 域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺巧酸信 号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的3/端，如农杆菌冠瘦瘤诱导(Ti)质粒基因（如姻脂碱 合成酶基因 Nos)、植物基因（如大豆胆存蛋白基因）3/端转录的非翻译区均具有类