。其中，BSMV:GFP表 示接种BSMV: GFP小麦;接种BSMV: TaMYB-KW-1~3表示Ξ株接种BSMV: TaMYB-KWKW的小麦。
[0077] 图3 TaMYB-KW基因沉默的小麦CI12633植株及其对照的纹枯病表型。其中，BSMV: GFP表示接种BSMV: GFP小麦；接种BSMV: TaMYB-KW-1~3表示Ξ株接种BSMV: TaMYB-KW的小 麦。
[007引图4为转化MYB-KW基因小麦的PCR检测结果。其中，a为To代，b为Τι代，C为T2代;P表 示pA25-TaMYB-KW; WT表示扬麦16;出0:空对照;Μ01~Μ05均表示转基因植株。
[0079] 图5为T0-T2代转TaMYB-KW基因小麦的定量PCR检测结果。其中，WT表示扬麦16，M01 ~5均表示转基因植株。**转基因株系与WT有极显著差异(P<0.01)。
[0080] 图6抗纹枯病转基因小麦植株和扬麦16的表型比较结果。其中，其中，WT表示扬麦 16，M01~M05均表示转基因植株。
【具体实施方式】
[0081] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0082] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0083] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0084] W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平均值。
[0085] 小麦种质资源CI12633抗纹枯病，小麦品种扬麦16中感纹枯病。抗病小麦材料一小 麦CI 12633来自于江苏农业科学院种质资源库，小麦品种扬麦16来自于江苏里下河地区农 业科学研究所，公众可W从中国农业科学院作物科学研究所获得，W重复本申请实验。
[0086] 小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(化izoctonia cerealis)R0301(冷苏凤，张爱香， 李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种（系）对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报，2010，26 (6): 1176-1180;Chen Liang,Zhang Zengyan(Correspondance),Liang Hongxia,Liu Hongxia, Du Lipu, Xu Hui jun,Xin Zhiyong.2008.Overexpression of TiERFlenhances resistance to sharp eyespot in transgenic wheat. Journal of Experimental Botany. 59:4195-4204)，公众可W从中国农业科学院作物科学研究所获得，W重复本申请 实验，不可作为其它用途使用。
[0087] 单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达 盒具有玉米Ubiquitin启动子、6义〇11、1]1付〇]1、61]5、齡3终止子，61]5两端具有51]1曰1和5曰(31酶切 位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、6^11、1]1付〇]1、13曰1'、齡3终止子：（参考文献： Christensen and Quail,1996；Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of select曰ble 曰nd/or screen曰ble m曰rker genes in monocotyledonous plants.TYansgenic Research,5,213-218)。公众可W从中国农业科学院作物科学研究所 获得，W重复本申请实验。PAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米 Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有Sma巧日SacI酶切位点，第2个 表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、6义〇11、1]1付〇]1、13日1'、齡3终止子。
[0088] BSMV-丫（BMSV 病毒的 丫载体）（Holzberg S，Brosio P, Gross C, Pogue GP.2002. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30,315-327)公众可W从中国农业科学院作物科学研究所获 得，W重复本申请实验。BSMV-a和BSMV-β及BSMV-丫-GFP化olzbe巧 S，Brosio P，Gross C, Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30,315-327)公众可W从中国农业科学院作物科学研究所获 得，W重复本申请实验。其中，BSMV- 丫 -GFP是将GFP(绿色巧光蛋白）编码区全长DNA插入 BSMV- γ载体的多克隆酶切位点中得到可表达GFP的重组载体。
[0089] 下述实施例中的PMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。
[0090] 实施例1、小麦抗病蛋白TaMYB-KW及其编码基因的克隆
[0091 ]本申请的发明人，从抗纹枯病小麦CI12633中分离克隆出一个小麦抗病蛋白，将其 命名为TaMYB-KW。TaMYB-KW基因的具体克隆方法如下：
[0092] 取用小麦纹枯病菌接种的小麦CI12633幼苗的叶片，液氮处理，按照Invitrogen TRIZ0L Reagent总RNA提取试剂说明书的方法提取叶片的总RNA。根据Invitrogen公司第一 链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模 板。
[0093] 为了获得TaMYB-KW基因全长的cDNA序列，利用两对引物，采用RACE和巢式PCR方法 进行扩增。利用引物对TaMYB-KWA-Ul (5 ' -GCAGCATTTACCTTCGGAC-3 '）和AUAP (5 ' - GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 '）通过第一轮PCR扩增，PCR扩增体系为：2 XGC Bufferl (TaKaRa) 10μL，cDNA2.0化（50ng)，2.5mMdNTPs(TaKaRa)1.0μl，10皿ol/LTaMYB-KWA-43U10.扣 L10ymol/L TaMYB-KW A-103化 1 0.扣L,抓/μ1 TaKaRa Prime STAR 0.2μ1，(1地2〇补至20μ L; PCR扩增程序为:先95 °C预变性3分钟;然后98 °C 45秒，59 °C 7秒，72 °C 90秒，共30个循环;再 72°C延伸 10分钟。然后，利用TaMYB-KWA-U2(5 ' -CGTCAACACACTGAGCAATC-3 '）和AUAP(5 ' - GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 '）引物和一轮PCR产物稀释液(50倍)做模板，进行二轮PCR扩增， 扩增体系为：2 X GC Buff erI (TaKaRa) lOyL，一轮PCR产物50倍稀释液2 . OyL，2.5mM dNTPs (了曰1(曰1?曰）1.化1，10皿〇1/1化]\1￥8-1(胖4-1]2 0.扣1^，10皿〇1/1了曰]\1￥8-1(胖4-1^2 0.化1^，抓/41 TaKaRa Prime STAR 0.2μ1，(ΗΗ2〇补至20^;ΡΟ?扩增程序为：先95°C预变性3分钟；然后98 °C 45秒，58 °C 7秒，72 °C 90秒，共30个循环;再72 °C延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电 泳，结果扩增得到一条的片段，将该PCR产物连接到PMD18-T载体上并测序。测序结果表明， 该PCR扩增产物的核巧酸序列如序列的序列1(第1-1028位核巧酸)所示，其编码序列是序列 表中序列1的第99-830位核巧酸;编码序列2所示的抗病蛋白TaMYB-KW。
[0094] 实施例2、TaMYB-KW基因受小麦纹枯病致病菌的诱导表达分析
[0095] 为了研究TaMYB-KW基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用Q-RT-PCR分析 TaMYB-KW基因在禾谷丝核菌接种4天和10天的抗纹枯病小麦CI12633中的表达情况。
[0096] 用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(化izoctonia cerealis)R0301菌丝牙签、麦粒 接种于小麦CI12633分葉期幼苗的叶銷与茎间；于接种4天和21天后取小麦茎，液氮速冻后 储存于一80°C超低溫冰箱备用。
[0097] 分别提取各小麦茎的总RNA(每个样品约化g总RNA)，根据Invi化ogen公司第一链 cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品 cDNA浓度均一化。然后用TaMYB-KW基因的特异引物进行实时定量RT-PCR分析，用2-aagt法 (Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quanti1:ative PCR and the 2-aagt method.Methods.25:402-408)分析TaMYB- KW基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。
[0098] 内参基因 actin的引物对：
[0099] WActinF:5'-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3'；WActinR:5'-CTCCATGTCAT CCCAGTTG- 3'。
[0100] TaMYB-KW基因的特异定量引物对：
[0101] TaMYB-KW-QF: 5 ' -CGACTCGTCCTCGTCCAAG-3 ' ; TaMYB-KW-QR: 5 ' -CGACGACGG CATCGAGTAAT-3'
[0102] 从图1的对接种禾谷丝核菌前后的CI12633的化MYB-KW基因表达量分析结果可W 看出，TaMYB-KW基因响应纹枯病菌侵染、表现为上调表达;在接种禾谷丝核菌4天和10天时， TaMYB-KW基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量均显著升高。