去甲万古霉素衍生物及其制备纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明设及去甲万古霉素衍生物及其制备 纯化方法。
【背景技术】
[0002] 去甲万古霉素是一类糖肤类抗生素，在中国已经商业化应用近四十年，临床主要 应用于治疗屯、内膜炎、骨髓炎等严重感染性疾病。去甲万古霉素主要对革兰氏阳性菌有效， 特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐青霉素的肠杆菌、肺炎 链球菌W及梭状芽抱杆菌。去甲万古霉素的产生菌为1959年李群等从贵州±壤中分离出的 放线菌万-23号，后来命名为东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)。去甲万古霉素 有着与另一个糖肤类化合物万古霉素(VCM)基本类似的化学结构和生物活性，它们均由一 个Ξ环组成的屯肤母体和一个由葡萄糖-氨基糖组成的双糖取代基，不同之处在于去甲万 古霉素的N-末端较万古霉素缺少一个N-甲基（图1)。文献中组成屯肤的氨基酸分别WAA-1 到AA-7表示，五个芳香环从A-E依次编号，另外，Ξ个大环的编号W芳香环编号组成A-B，C- 0-D和D-0-E，为了方便化合物结构解析，本申请将沿用文献的编号方法。
[0003] 早期，万古霉素初始使用阶段，临床使用过程中发现其引起多种负反应，如肾毒性 和耳毒性等，可能的原因是其纯度低，杂质含量高的原因。随后，人们使用高效液相色谱 化PLC)，毛细管电泳(CE似及液相质谱-质谱连用技术(LC-MS/MS)对万古霉素有关物质进 行过系统深入的研究，从中发现了八个杂质分别是去氯万古霉素 A和B，去双氯万古霉素，万 古霉素过程降解产物CDP-Im和CDP-Im，去双糖万古霉素，去氨基糖万古霉素和去甲万古霉 素。进一步药理活性实验研究发现，含有CDP-Im和CDP-Im的万古霉素药品能引起临床治疗失 败，而Ξ个去氯万古霉素类似物的抗菌活性比万古霉素降低了 2至10倍，去氨基糖的万古霉 素的体内抗菌活性也大大降低，MIC约为万古霉素的五倍。因此，《欧洲药典》和《美国药典》 将去氨基-，去双糖基-，和去甲基万古霉素定义为万古霉素原料Ξ个主要杂质，并且规定其 单杂不得超过4%，总杂不得超过7%。
[0004] 相比而言，去甲万古霉素由于其杂质成分不明确，因此，中国药典规定W峰面积积 分计算，总杂不得超过12%，单杂少于4%。因此，需要更为有效的纯化及鉴定去甲万古霉素 的方法，同时，为了明确去甲万古霉素原料药中有关物质成分结构，还可W对去甲万古霉素 原料药进行更为系统的化学成分研究，发掘其新结构的结构类似物。
【发明内容】
[000引本发明从去甲万古霉素原料药中分离得到Ξ个糖肤类化合物，借助于1D，2D NMR 和HRESIMS等方法确定Ξ个化合物结构，均为去甲万古霉素类似物，包括一个C-0-D开环和 两个去糖基衍生物。
[0006]本发明首先设及一种去甲万古霉素及其衍生物的HPLC制备分离方法，所述方法 为：
[0007] (1)流动相：甲醇:0.05~0.2 %甲酸水溶液，
[000引（2)梯度洗脱步骤:30~50min内甲醇从10%逐渐上升至70%，
[0009] (3)将去甲万古霉素原料药水溶液过色谱柱，流速为1.0~5.Oml/min，检测波长 280nm，所述的去甲万古霉素原料药优选为去甲万古霉素盐酸盐原料药，
[0010] (4)收集主峰产物即得去甲万古霉素纯品，收集次峰产物即得去甲万古霉素衍生 物。
[0011] 所述方法中，色谱柱优选为C18色谱柱或苯基柱。
[0012] 本发明还设及由所述方法分离获得的去甲万古霉素衍生物，所述的去甲万古霉素 衍生物为:化合物1(结构如下式1所示）、化合物2或3(结构如下式2、3所示），
[0013]
[0014] R = 0-D-glucosyl，式2;
[0015] R = H，式 3
[0016] 本发明还设及所述化合物1-3在制备药物中的应用，所述药物为抗革兰氏阳性菌 的药物，所述的革兰氏阳性菌优选为:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球 菌、耐青霉素的肠杆菌、肺炎链球菌W及梭状芽抱杆菌。
【附图说明】
[0017] 图1化合物1-3,去甲万古霉素和万古霉素的结构，化合物1的HMBC相关用虚线弯箭 头表不。
[0018] 图2去甲万古霉素原料药的HPLC色谱分析图。
[0019] 2A，使用《中国药典》方法的册L姻谱；
[0020] 2B，A图中a，b，c和去甲万古霉素的紫外图谱叠加图；
[0021 ] 2C，方法优化后HPLC图谱；
[0022] 2D，C图中杂质1，2,3,4和去甲万古霉素的紫外图谱叠加图。
[0023] 图3去甲万古霉素(母离子为[M+扣Vz 1434,图3A)和化合物1(母离子为[M+扣V Z1452，图3C)的ESIMS/MS图和两者的裂解途径(3B为去甲万古霉素，3D为化合物1)。
【具体实施方式】
[0024] 去甲万古霉素盐酸盐由华北制药（中国河北石家庄市)提供；
[0025] 万古霉素标准品购于中国食品药品检定研究院；
[0026] 色谱级乙腊和甲醇购于Adamas公司（中国上海）；
[0027] DMSO-ds由Cambridge Isotope公司生产（Cambridge ,ΜΑ,USA.);
[0028] 所有其它试剂（甲酸、憐酸、盐酸、Ξ氣乙酸、氨水(含氨气质量分数为25~28%)、 Ξ乙胺、四氨巧喃)均为化学级。
[0029] 使用的仪器，包括Ρ-2000旋光仪(JASC0，Tokyo Japan)，JASC0P-650紫外分光光度 计（JASC0)，SYS 600MHz核磁仪（Palo Alto,CA,USA)，Finnigan LTQ XT离子阱质谱仪 (Finnigan,San Jose,CA)，Finnigan LTQ轨道离子阱谱仪(Finnigan)，岛津LC-20液相色谱 仪（Shim曰dzu,Jap曰η)D
[0030] 核磁测定方法：
[0031] 所有样品的1h和1化NMR均在带低溫探头的SYS 600MHz核磁仪上测定，溶剂为気代 DMS0。1h和 1? NMR化学位移均使用TMS(δ = 0.0 Oppm)和DMSO-ds(δ = 39.5ppm)溶剂做内标。
[0032] 实施例1化合物1~3的制备与分离纯化
[0033] 首先，我们使用了《中国药典》中去甲万古霉素原料药HPLC方法来分析样品（见图 2A和2B)，发现在保留时间为21.44min的一个主峰，积分面积占所有峰面积总和的95.5%， 根据药典中去甲万古霉素出峰位置为18~22min，推测该物质就是去甲万古霉素，另外，如 图2A中所示，保留时间在该主峰前后还存在至少Ξ个积分面积较小的杂质峰，保留时间分 别为10.31(a) ,12.30(b) ,14.73(c)min，它们的在线紫外吸收峰型也与去甲万古霉素相类 似，如图2B所示。然而，由于该方法中使用了憐酸盐，并且因为制备过程或者制备后样品中 憐酸盐的残留会严重干扰质谱检测，因此，运方法不适合对样品进行液相色谱-质谱联用 (LC-MS)。
[0034] 我们为了借助于LC-MS初步获得运些衍生物杂质分子量等相应信息，建立了一套 流动相不含盐的HPLC方法。当我们使用甲醇-0.1 %甲酸水溶液进行HPLC分析时候，发现相 应的主峰和杂质峰都能获得很好的峰型，并且杂质与杂质之间，杂质与主峰之间也具有较 好的分离度，如图2C所示，衍生物杂质1，2，3，4峰面积分别占总面积的3.4 %，1.91 %， 0.96%，和 2.02%，主峰为87.97%。
[00对 （1)优化的HPLC分析方法如下：
[0036] Agilent。8色谱柱（150X4.6mm i.d. ,5皿），
[0037] 流动相：甲醇:0.1 %甲酸水溶液，
[003引梯度洗脱步骤：（1)40111111内甲醇从10%逐渐上升至70%。
[0039] 1.0ml mirfi流速，280皿波长检巧U，柱溫和检测池溫度均为室溫(25°C)，3.Omg ml ^去甲万古霉素原料药水溶液，进样量为20μ1。
[0040] (2)优化的HPLC制备方法如下：
[0041 ] YMC-化ck苯基柱（150X20mm i.d.，20ym，YMC Co.，1^(1，的〇扣，化9日11)，流动相配 置与梯度洗脱方法与分析实验一致。
[0042] 流速为5.0ml min-i，单次洗脱时间为120min。
[0043] lOO