专利名称：核糖体抗性诱变选育万古霉素生产菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的选育，尤其是涉及东方拟无枝酸菌Uff^co/ato;w"on'ewtoto) AO-l的诱变菌株V500-S400-1 (诱变菌株V500-S400-1称为万古霉素生产菌株)的诱变选 育方法及其万古霉素生产菌株的应用。
背景技术：
万古霉素是由McCormick等(McCormick MH, Stark WM， Plttenger GE, et al. Vancomycin, a new antibiotic [J]. Chemical and biological properties, 1955-1956， 23: 601-611)于1956年从印 度尼西亚土壤中选育到的一株被称为东方拟无枝酸菌^附少co/ato/w^ 的发酵液中分 离得到的具有抗革兰氏阳性菌的一种糖肽类抗生素。万古霉素问世后的20年，由于青霉素 和头孢菌素类抗生素的上市使用及其很强的耳肾毒性，它仅作为保留药物，用于治疗由少数 耐药性金黄色葡萄球菌引起的严重感染性疾病，临床使用很少。后来随着A内酰胺类抗生素 的大量使用，由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐渐流行。1998 2000 年间，MRSA占金黄色葡萄球菌的比例高达30%以上。在这种情况下，万古霉素愈来愈受人 们的重视，成为目前临床上用于治疗由MRSA引起的严重感染疾病的首选药物 (Rimakrishnanl N. Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides[J]. Antimicrobical agents chem., 1991, 35(4): 605-609)，并被国际抗生素专家誉为 "人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线"和"王牌抗生素"。由于万古霉素作用机制独特， 而且在体内易分解，使其不仅在临床上，而且在畜牧等行业上也得到了广泛的应用(徐嘉惠. 抗生素工业信息[M]，北京化学工业出版社.1993)。
目前万古霉素的生产主要采用培养生产万古霉素的东方拟无枝酸菌^ _yc0toto;w& on'e toto的方法获得，但菌株生产能力有限。研究人员通过各种手段对菌株进行分离、选育 或突变，获得了一些万古霉素生产菌株，但耗时耗力。核糖体突变选育的方法通过引入某些 抗生素(剌激物)对菌体核糖体蛋白合成的相关基因进行刺激，使得抗生素基因超量表达，从 而提高菌株生产能力，是一种简单有效的菌株诱变选育方法。Shima等(Shima J, Hesketh A, Okamoto S, et al. Induction of actinorhodin production by r^wZ (encoding ribosomal protein SI2) mutations that confer streptomycin resistance in Syrepfo附jv"cgs //vzWo"s and coe/z'co/orA3(2)[J]. Bacteriol, 1996, 178(24): 7276-7284)发现将链霉素抗性引入野生的d蓝色链霉菌，可 以使放线菌紫红素产量提高10倍，胡海峰等(Hu HF, Ochi K. Novel approach for improving the productivity of antibiotic-producing strains by inducing combined resistant mutations[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(4): 1885-1892)利用联合诱变(str-rif-gen)先后引入d蓝色链霉菌， 使得放线菌红素产量最大提高了 48倍。将这一技术应用于Sdo7/船属和Aewflfowo"as属， 使其抗生素产量提高5 50倍。涂国全等(涂国全，刘姝.通过获得链霉素抗性基因(str)突变 株选育梅岭霉素万古霉素生产菌株[J].中国抗生素杂志，2002， 27(6): 321-325)通过获得str抗 性突变株选育梅岭霉素万古霉素生产菌株，获得突变产量提高了 77.9%。陶纯长等(陶纯长, 谌颉.链霉素抗性突变理性选育avermetin万古霉素生产菌株[J].中国抗生素杂志，2002, 27(9): 521-523)利用链霉素抗性选育avermetin万古霉素生产菌株，得到的突变株产素能力提 高30%以上。Nagy等(Nagy M, Jarai M， Financsek I， et al. Process for the preparation of vancomycin[P]. U.S. 1993: N0.5223413)对万古霉素产生菌株M&TOpo/yra NCAIM 001091进行诱变，将诱变后的饱子悬液分别涂布在链霉素和卡那霉素抗性平板上，最终选 育到V-l和V-2两株万古霉素生产菌株，并进行了 12 L发酵罐的放大试验，30 °C、 600 rpm 培养120 h，终产量可达3.6 3.8 g/L。
发明内容
本发明的目的在于提供东方拟无枝酸菌"附少co/"to戸"AO-1的诱变菌株 V500-S400-l (诱变菌株V500-S400-1称为万古霉素生产菌株)的诱变选育方法。
本发明的另一目的在于提供万古霉素生产菌株在制备万古霉素中的应用。
本发明所述万古霉素生产菌株为东方拟无枝酸菌"ff^co/ato/w/s w/e"tofc) AO-1的诱 变菌株V500-S400-l ，已于2009年4月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，微牛物菌种保藏号为CGMCCNo. 3046 。
本发明的技术方案是所述万古霉素生产菌株以东方拟无枝酸菌(Jwyco/flffopw's on'e"tofc) AO-l为出发菌株，经核糖体抗性诱变选育获得，其具体歩骤如下
1 )将东方拟无枝酸菌AO-1接种至高氏1号琼脂培养基平板中，28 30 'C培养5 7 d;
2) 取出孢子用无菌水制成103 10411止"的孢子悬液，将孢子悬液涂布于50 1250mg/L 的万古霉素及100 15000 mg/L的链霉素混合抗性的高氏1号琼脂培养基平板中28 30 °C 培养7 10d;
3) 随机选取生长出来的单菌落划线接种于高氏1号琼脂平板培养基上，28 30'C培养 5 7d，用琼脂块抑菌圈法对长出的诱变菌株进行生物活性测定；
44) 选取抑菌圈直径大于出发菌株AO-12mm的诱变菌株接种于液体发酵培养基中，于 28 30°C、 170 220rpm的摇床中培养90 130h，通过HPLC法测定发酵液中万古霉素的 含量，验证所获的万古霉素诱变菌株；
5) 将获得的万古霉素诱变菌株经5次连续传代稳定性考察，获得万古霉素生产菌株。 所述东方拟无枝酸菌AO-l可购于美国菌种保藏中心，编号ATCCNo. 19795。 本发明所述万古霉素生产菌株可用于生产万古霉素，其方法如下 将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，液体发酵种子培养基组成为酵母粉3
6g/L,麦芽提取物3 5g/L，蛋白胨10 15g/L，葡萄糖15 20g/L， pH6.8;种子培养条 件为28 30°C，装液量40/250 mL，摇床转速150 220 rpm，培养24 48 h;液体发酵培 养基组成为糊精100 150g/L， 土豆蛋白15 25g/L，黄豆粉15 25 g/L，磷酸氢二钾0.1 0.5g/L，消沫剂l 3g/L，氯化钠1.2 1.6g/L， pH6.8 7.2，培养条件为28 30 °C,装液 量40/250 mL，摇床转速150 220 rpm，培养90 130h，万古霉素的产率8.0 8.9 g/L。
本发明采用核糖体诱变选育的手段进行万古霉素生产菌株选育，获得一株东方拟无枝酸 菌J附少cototo;w/s 万古霉素生产菌株，该菌株万古霉素的生产能力比出发菌株提高
了7.12倍，高达8.9 g/L。且经过传代稳定性研究，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高 达92.7%。
图1为实施例1中诱变菌株对生物活性指示菌枯草芽孢杆菌a^7/wraZ^'fc抑制结果。 在图l中，中心位置的琼脂块为空白高氏l号培养基(做空白对照)；最下方位置的含出发菌 株AO-l的琼脂块(阳性对照)；其余为含诱变菌株的琼脂块。
图2为实施例1中诱变菌株的5次连续传代稳定性研究。在图2中，口表示万古霉素 生产菌株的万古霉素产量遗传稳定性；O表示东方拟无枝酸菌AO-l的万古霉素产量遗传稳 定性；横坐标为传代次数Generation,纵坐标为万古霉素的浓度Vancomycin concertration(g/L)。
图3为实施例2中万古霉素生产菌株在液体发酵培养基中生产万古霉素的曲线。在图3 中，横坐标为时间Time(h)，左纵坐标为菌体生物量Biomass concentration(g/L) (■)，右纵坐 标为万古霉素产量Vancomycin concentration(g/L) ( △)。
图4为实施例3万古霉素-链霉素混合抗性高氏1号平板培养基上所长的诱变菌株与在 普通高氏l号培养基平板上生长的出发菌株形态对比图。其中，A:浓度为10000个/mL的 出发菌株AO-l的孢子在万古霉素500 mg/L、链霉素浓度400 mg/L抗性的高氏一号培养基平板生产出的万古霉素生产菌株；B:浓度为1000个/mL的出发菌株AO-l孢子涂布于普通
高氏一号培养基平板生张出的菌落。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。
实施例1
1)取购于美国菌种保藏中心，编号ATCC No. 19795的万古霉素产生菌出发菌株AO-l 接种至高氏1号琼脂培养基平板中28 'C培养7d，孢子长出后，取适量用无菌水制成104mL—1 的孢子悬液。将0.1 mL孢子悬液涂布于含有500、 1000 mg/L万古霉素的高氏1号琼脂培养 基平板中28 'C培养7 d,随机选取50株长出的单菌落划线接种于高氏1号琼脂平板培养基 上，28。C培养7d，用琼脂块抑菌圈法法对长出的诱变菌株进行生物活性测定，选取抑菌圈 直径比出发菌株AO-l大2mm的12株诱变菌株(参见图1)。
2 )将以上12株诱变菌株接种于装有40 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶，于30°C 、 200 rpm的摇床中培养120 h,通过HPLC法测定发酵液中万古霉素的含量，验证选育出2 株万古霉素高产诱变菌株。该2株经5次万古霉素产量连续传代稳定性研究，其中l株的万 古霉素产量遗传稳定性高达92.7% (参见图2),该株即为万古霉素生产菌株。
3)将万古霉素生产菌株进行液体二级发酵。液体发酵种子培养基组成为(g/L):酵母粉 3，麦芽提取物3，蛋白胨IO，葡萄糖15， pH6.8;种子培养条件为30°C，装液量40/250 mL，摇床转速200rpm，培养48 h;液体发酵培养基组成为(g/L):糊精140， 土豆蛋白20， 黄豆粉20，磷酸氢二钾0.1，消沫剂1，氯化钠1.2， pH7.0;培养条件为30 °C，装液量40/250 mL，摇床转速200 rpm,培养120 h。取1 mL万古霉素生产菌株发酵液加入离心管，10000 rpm 离心10 min，取上清，离心3次，上清液稀释100倍后用0.22 nm过滤器过滤，滤液用于 HPLC。
HPLC流动相按体积比，0.4%三乙胺甲醇=85 : 15;色谱条件色谱柱C18 ODS; 柱温40°C;检测器DAD(HP1200);检测波长230nm;流速lmL/min;进样量:20|aL。
经过以上色谱条件测定，万古霉素生产菌株发酵液中万古霉素的产量高达8.9g/L，其万 古霉素生产能力较出发菌株AO-l提高了 7.12倍(生产曲线如图3)。
实施例2
取0.1 mL浓度为10000个/mL的出发菌株孢子涂布于浓度为万古霉素500 mg/L、链霉 素浓度为400 mg/L的混合抗性高氏1号琼脂平板上，同时将出发菌株AO-l孢子稀释成不 同浓度梯度后涂布于普通高氏1号琼脂平板做对照，28 'C培养7d，共获得若干株突变菌株。长出菌株生长情况差异如图4和表1所示。
表l万古霉素生产菌株与出发菌株AO-l菌落形态差异比较
菌株特征万古霉素生产菌株出发菌株AO-l
菌落形态圆形"凸"起，呈馒头状扁平圆形
菌落结构紧密松散
袍子颜色浅黄类白色或黄色白色
袍子丰满程度丰满一般
边缘有无皱纹状突起有或无无
菌落表面是否光滑光滑或粗糙粗糙
实施例3
将实施例1获得的万古霉素生产菌株接入液体种子培养基(液体发酵种子培养基组成为 (g/L):酵母粉5，麦芽提取物4，蛋白胨13，葡萄糖17， pH 6.8;装液量40/250 mL)，于 28 °C， 200 rpm培养48 h后，转接到摇瓶发酵培养基(液体发酵培养基组成为(g/L):糊精 100~150， 土豆蛋白15 25，黄豆粉15 25，璘酸氢二钾0.1 0.5，消沫剂1 3，氯化钠 1.2 1.6， pH6.8 7.2，装液量40/250 mL)， 于28。C， 200 rpm培养120 h，通过HPLC 法测定发酵液中的万古霉素含量。根据实施例1提供的色谱条件，测得发酵液中万古霉素产 量达8.5g/L。其生产曲线见图3。
权利要求
1.万古霉素生产菌株的诱变选育方法，其特征在于包括以下步骤1)将万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌出发菌株AO-1接种至高氏1号琼脂培养基平板中，28～30℃培养5～7d；2)取出孢子用无菌水制成103～104mL-1的孢子悬液，将孢子悬液涂布于50～1250mg/L的万古霉素及100～15000mg/L的链霉素混合抗性的高氏1号琼脂培养基平板中28～30℃培养7～10d；3)随机选取生长出来的单菌落划线接种于高氏1号琼脂平板培养基上，28～30℃培养5～7d，用琼脂块抑菌圈法对长出的诱变菌株进行生物活性测定；4)选取抑菌圈直径大于出发菌株AO-12mm的诱变菌株接种于液体发酵培养基中，于28～30℃、170～220rpm的摇床中培养90～130h，通过HPLC法测定发酵液中万古霉素的含量，验证所获的万古霉素诱变菌株；5)将获得的万古霉素诱变菌株经5次连续传代稳定性考察，获得万古霉素生产菌株。
2. 如权利要求1所述的万古霉素生产菌株在制备万古霉素中的应用。
3. 如权利要求2所述的万古霉素的制备方法，其特征在于其步骤如下 将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，液体发酵种子培养基组成为酵母粉3 6g/L，麦芽提取物3 5g/L，蛋白胨10 15g/L，葡萄糖15 20 g/L， pH 6.8;种子培养条 件为28 30°C，装液量40/250 mL，摇床转速150 220 rpm，培养24 48 h;液体发酵培 养基组成为糊精100 150g/L, 土豆蛋白15 25g/L，黄豆粉15 25 g/L，磷酸氢二钾0.1 0.5g/L，消沫剂l 3g/L，氯化钠1.2 1.6g/L， pH6.8 7.2，培养条件为28 30 °C，装液 量40/250 mL，摇床转速150 220 rpm，培养90 130h。
全文摘要
核糖体抗性诱变选育万古霉素生产菌株及其应用，涉及一种微生物的选育。提供东方拟无枝酸菌的诱变菌株的诱变选育方法及其在制备万古霉素中的应用。将东方拟无枝酸菌接种至高氏1号琼脂培养基平板中培养；取出孢子用无菌水制成孢子悬液涂于万古霉素及链霉素混合抗性的高氏1号琼脂培养基平板中培养；随机选取生长出来的单菌落划线接种于高氏1号琼脂平板培养基上培养，对长出的诱变菌株进行生物活性测定；选取抑菌圈直径大于出发菌株2mm的诱变菌株接种于液体发酵培养基中培养，通过HPLC法测定发酵液中万古霉素的含量，验证所获的万古霉素诱变菌株；将获得的万古霉素诱变菌株经5次连续传代稳定性考察，获得万古霉素生产菌株。
文档编号C12Q1/04GK101608209SQ200910112190
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者凌雪萍, 卢英华, 姚传义, 敬科举, 曾宪海 申请人:厦门大学