[0103] 实施例3、TaMYB-KW沉默小麦的获得和抗病性鉴定
[0104] 一、重组表达载体的构建
[0105] 1、用禾谷丝核菌(化izoctonia cerealis)R0301接种小麦CI12633茎与叶銷，4天 后提取RNA，反转录为cDNA; WcDNA为模板，用TaMYB-KW-VIGS-F和TaMYB-KW-VIGS-R组成的 引物对进行PCR扩增，得至化CR扩增产物(携带化el位点的TaMYB-KW片段）。
[0106] TaMYB-KW-VIGS-F: 5' -ACAGCTAGCTCGTCCGCCACCGATTACT-3'（下划线标注为Miel酶 识别位点）；
[0107] TaMYB-KW-VIGS-R: 5 ' -GGCGCTAGCCTCTGCCTAAATCTGAGACAAAC-3 '（下划线标注为 化el酶识别位点）。
[010 引 PCR 反应程序：先 94°C 预变性 3min;然后 94°C30s，56°C30s，72°Clmin，15 个循环；94 °C 30s，60 °C 30s，72 °C Imin，20 个循环；最后 72 °C lOmin 补平末端。
[0109] 2、回收PCR扩增产物。
[0110] 3、用限制性内切酶化e I酶切步骤2的回收产物，回收酶切产物。
[0111] 4、用限制性内切酶化el酶切BSMV- 丫 -GFP载体质粒DNA，回收载体骨架。
[0112] 5、将步骤3回收的片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到连接产物。
[0113] 6、将步骤5获得的连接产物进行测序，取将序列表中序列1的第576-836位所示的 DNA分子反向插入BSMV- 丫 -GFP载体的克隆，即得到BSMV- 丫 -TaMYB-KW重组载体。
[0114] 二、BSMV载体的线性化和体外转录
[011 引将用于BSMV侵染的BSMV-a、BSMV-e、BSMV- 丫 -GFP及BSMV- 丫 -TaMYB-KW进行酶切， 其中BSMV-a、BSMV- 丫 -GFP及步骤一的BSMV- 丫 -TaMYB-KW用限制性内切酶Mlu I进行酶切； BSMV-β用限制性内切酶Spe I进行酶切。酶切反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测载体是 否酶切完全。如果载体被完全酶切，则回收、纯化线性化的载体备用。
[0116]参照RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7kit(P;romega)说明书， 进行体外转录反应，体系如下： 5, X Τ7 TVa,打 script ion Buffer 2 u 1 rNTPs (25mM AlT，CTP，?ΤΡ; 2mMCiTP) 3 μ1 R:ibo 111? Cap Analog (40 曲饭 化巧 P_1
[0117] ' i \ Enzyme: Mix 打巧 1 μ 1 线性化的载体 lug RNase-Free ddHO 补足至 10 μ 1
[0118] 体外转录反应于37°C恒溫条件下进行化，得到转录反应液。
[0119] S、BSMV接种小麦植株
[0120] 吸取线性化的BSMV-a、线性化的BSMV-β及线性化的BSMV- 丫 -TaMYB-KW各10μ1置于 1.5ml离屯、管中，混匀后，加入60μ1的用RNase-free dd出0稀释，得到的90μ1液体，再在上述 90μ1 混合物中加入90μ1 的GKP溶液（50mM Glycine;30mM K2HP〇4，pH=9.2;l%Bentonite; 1 % Cel ite)，共得到180μ1的BSMV病毒混合液。
[0121] 按照上述方法，将线性化的BSMV- 丫 -TaMYB-KW替换为线性化的BSMV- 丫 -GFP，其他 步骤均不变，得到18化1的对照病毒混合液。
[0122] 按照上述方法，将线性化的BSMV- 丫 -TaMYB-KW替换为RNase-free d地2〇,其他步 骤均不变，得到18化1的Mock对照混合液。
[0123] 待小麦幼苗生长至二叶一屯、期时，吸取10μ1的BSMV病毒混合液摩擦接种于小麦幼 苗的第二个叶片上。在接种后的小麦叶片表面喷施〇.1%的〇6?(：水溶液，于22°(：-23°(：条件 下保湿2天，得到接种BSMV: TaMYB-KW小麦。分别用对照病毒混合液和Mock对照混合液进行 实验，分别得到接种BSMV: GFP小麦和Mock对照小麦。
[0124] 四、沉默效果检测及抗病鉴定
[01巧]分别于小麦植株生长至分葉期时对接种BSMV: TaMYB-KW小麦、接种BSMV:GFP小麦 和Mock对照小麦接种禾谷丝核菌(化izoctonia cerealis)R0301，并于接种第14天，剪取第 四叶片液氮速冻后提取总RNA"WTaMYB-KW基因特异的定量引物：
[0126] TaMYB-KW-QF:5 '-CGACTCGTCCTCGTCCAAG-3 '
[0127] TaMYB-KW-QR:5 '-CGACGACGGCATCGAGTAAT-3 '
[0128] 利用定量RT-PCR(Q-RT-RCR)分析TaMYB-KW基因的表达量。结果如图2，与接种 BSMV: GFP病毒的植株相比，接种BSMV: TaMYB-KW病毒的植株叶片中TaMYB-KW基因表达量明 显下调，说明接种BSMV: TaMYB-KW可引起CI12633植株中TaMYB-KW基因表达的沉默。
[0129] 于小麦分葉期接种禾谷丝核菌，接种后30天观察病症，结果如图3所示，按照表2的 小麦纹枯病病级标准，确定病级。接种BSMV:GFP病毒的CI12633植株的病级为1.2级，表现抗 纹枯病表型;Ξ株接种BSMV: TaMYB-KW的小麦病级分别为3.8级、3.2级、2.8级，出现了典型 的小麦纹枯病病斑，表现为感纹枯病病表型；W上结果说明TaMYB-KW基因是小麦CI12633防 御纹枯病反应所需的基因，正向调控抗纹枯病小麦CI12633对禾谷丝核菌的防御反应。
[0130] 表2、小麦纹枯病病级标准
[0131]
[0132] 实施例4、TaMYB-KW过表达转基因小麦的获得和抗病性鉴定
[0133] 一、重组表达载体的构建
[0134] 1、用禾谷丝核菌(化izoctonia cerealis)R0301接种小麦CI12633的叶銷和茎，4 天后提取RNA，反转录为cDNA; WcDNA为模板，用TaMYB-KW-P25-U和TaMYB-KW-P25-L组成的 引物对和高保真扩增酶PRIMERSTAR(TAKARA公司）进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（携带 Sp e I位点的TaMYB-KW基因）。
[0135] TaMYB-KW-P25-U: 5 ' -CAAACTAGTATGGGGAGGTCTCCTTGC-3 '（下划线标注为Spel酶识 别位点）；
[0136] TaMYB-KW-P25-L:5'-CTAAATCTGAGACAAACT-3'。
[0137] PCR 反应程序：先 94°C 预变性 3min;然后 94°C30s，56°C30s，72°Clmin，15 个循环；94 °C 30s，58 °C 30s，72 °C Imin，20 个循环；最后 72 °C lOmin 补平末端。
[013引 2、回收PCR扩增产物TaMYB-KW-P。
[0139] 3、用限制性内切酶Spe I酶切TaMYB-KW-P回收产物，回收酶切产物中约737bp的片 段。
[0140] 4、用限制性内切酶Spel和EcoICRI (与SacI识别酶切序列一致的同裂酶，但 EcoICRI酶切后产生平末端)酶切单子叶植物转基因表达载体PAHC25,回收载体骨架。
[0141] 5、将步骤3回收的DNA片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到连接产物。
[0142] 6、将步骤5获得的连接产物进行测序，测序结果表明骨架载体为单子叶植物表达 载体PAHC25的一部分，在Spel和EcoICRI识别位点之间插入了沈Q ID No.2的第99-830位所 示的TaMYB-KW蛋白的编码基因，将该重组载体命名为pA25-TaMYB-KWDpA25-TaMYB-KW为将 PAHC25载体的Spe I和Eco ICRI识别位点（与Sac I识别酶切序列一致为同裂酶，但Eco ICRI酶 切后产生平末端)酶切位点之间插入了序列表中序列1的5/末端的第99位至第830位核巧酸 所示的TaMYB-KW基因；TaMYB-KW基因受Ub i qu i t in启动子控制；质粒还具有1个受Ub i qu i t i η 启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨麟(Biala地os)筛选转化 再生植株提供抗性标记。
[0143] 二、转基因植物的获得
[0144] 1、将1736块扬麦16的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒 pA25-TaMYB-KW轰击到愈伤组织。
[0145] 2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。
[0146] 3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加 VBi Img/L， 天冬口酷胺150mg/L，2，4-D 2mg/U上，恢复培养2周(26 °C，暗培养）。
[0147] 4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中（1/2MS培养基+糞乙酸Img/ L+激动素 lmg/L+双丙氨麟2-5mg/L)，24-26°C光照培养14d;将愈伤组织分化小苗后转移到 生长筛选培养基中（1/2MS培养基+双丙氨麟2-3mg/L)，24-26°C光照培养;获得了44株再生 植株。
[014引 5、将再生植株转移到壮苗培养基（1/2MS培养基+0.5mg/L糞乙酸)上，将苗高7-8cm 且根系发达的转化苗移栽到花盆，在移栽到溫室3周W后，有44株植株成活。
[0149] 6、分子鉴定
[0150] PCR 检测
[0151] 在4叶期，将步骤5得到的44株植株每株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作 为模板，利用TaMYB-KW基因0RF序列特异的一段序列作为