赋予植物黄萎病抗性的lrk1基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一个赋予植物黄萎病抗性的LRK1基因及其应用，涉及植物基因克隆 以及功能分析，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其 他有益生产性状。 二、
【背景技术】
[0002] 目前，生产上黄萎病危害十分严重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病 害，造成减产甚至绝收，尚无有效的防治措施。黄萎病的病原主要为大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae)，以微菌核(microsclerotia)形式长期存在于土壤中。黄萎病菌 在寄主植物上会表现出致病性差异，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响 下，常产生生理分化，出现新的致病类型。张天真等用RAro指纹图谱聚类分析将我国棉花黄 萎病菌株划分为8类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病菌致病机制十 分复杂(张天真，2000)。另外，由转座子和DNA水平转移等引起的黄萎病菌遗传变异也限制 了棉花抗黄萎病育种(Amyotte SG，et al.，2012;de Jonge，et al.，2012)。因此，克隆抗性 基因、解析抗病机制对棉花抗黄萎病育种意义重大而迫切。
[0003] 然而，目前对黄萎病菌具有抗性的基因较少，尤其对棉花黄萎病具有稳定广谱高 抗的基因未见报道。Fradin等(2011)将番茄中Vel转化拟南芥，获得了对黄萎病菌的抗性， 而该基因转化烟草和棉花后，不具有黄萎病抗性，表明该基因在植物上的应用具有物种特 异性(刘琳琳等，棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Vel，中国科学:生命科学，2014(44)卷 第8期：803-814)。从抗黄萎病海岛棉品种H7124中克隆了与番茄Vel基因 （Fradin et al.， 2009)和棉花GbVe基因 （Zhang et al .,2011)部分同源的Gbvel基因，该基因也具有典型的 植物抗病蛋白结构域，利用VIGS沉默Gbve 1基因可使海岛棉H7124对黄萎病的抗性丧失;并 且，Gbvel基因转化拟南芥和陆地棉的结果都表明Gbvel基因对强致病力的落叶型和非落叶 型黄萎病菌都具有抗性(Zhang et al.，2012a)，但是并未获得高抗黄萎病品种。除了Ve基 因外，一些下游防卫相关基因也用于抗黄萎病防治研究。过量表达AtNPRl基因的转基因棉 花对非落叶型黄萎病具有抗性，但是对落叶型黄萎病不具有抗性(Parkhi et al.2010)。另 外，水稻黄单胞菌harpin蛋白、几丁质酶基因、脂质转移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽、 防御素（Q _Defensins)(Miao et al.，2010;Munis，2010;Ni M et al.，2013)也对黄萎病表 现出一定的抗性，但是由于防卫基因的过量表达对植物生长发育带来一些不利影响、以及 抗性效果未达到预期目标等，从而限制了这些基因在生产上的应用。
[0004] 本研究通过陆地棉高抗黄萎病品种奥3503的转录组进行分析，发现一个高抗黄萎 病基因 LRK1，该基因与雷蒙德氏棉几丁质类受体激酶基因 l(Chitin elicitor receptor kinasel-like，登录号XM_012617234)相似度99%，以该基因的序列为模板设计引物将LRK1 基因克隆，并将该基因转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株对落叶型以及非落叶型菌系 均具有较高的抗性。棉花黄萎病抗性基因 LRK1的分离可以进一步丰富抗性基因资源，对其 功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。 三、
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的目的是:提供了一个赋予植物黄萎病抗性LRK1基因及其应用，该基因编 码一个表面受体蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可以显著提高 受体植物对落叶黄萎病病原菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗性。可以利用本发明基 因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。
[0007] 技术方案
[0008]本发明涉及一个赋予植物黄萎病抗性的LRK1基因，其序列为SEQ ID N0.1。该基因 来源于陆地棉品种奥35031RK1基因完整编码框长度为1860个碱基，编码蛋白含619个氨基 酸，分子量为67.3KD，等电点为5.LLRK1的功能研究揭示其表达调控机理以及作用机制，可 应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。
[0009] 本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片 段的引物。
[0010] 所述LRK1基因可在赋予植物黄萎病抗性中的应用。尤其是在赋予拟南芥植物黄萎 病抗性中的应用。
[0011]本发明赋予植物黄萎病抗性的LRK1基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991 的诱导后表达量增加，将LRK1构建到植物表达载体pCambia2301载体(上海北诺生物科技有 限公司）上转化拟南芥，结果转基因植株对棉花黄萎病强致病力落叶型菌株V991以及非落 叶型菌株BP2均具有较高抗性。可以利用本发明的基因构建成各种植物表达载体，应用于农 业生物技术育种以提高相关寄主植物对黄萎病的抗病性或用在棉花黄萎病抗性改良中。 [00 12]其应用包括：
[0013] 1)LRK1基因的克隆以及植物表达载体的构建
[0014]以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物
[0015] PI:5 '-TGCTCTAGAATGCTGAAATTAATCTCGATTC-3 '，
[0016] P2:5 '-CGCGGATCCTTATCTTCCGGACATAAGGT-3 '
[0017] 扩增得到1860bp片段，将该片段命名为LRK1，PCR产物纯化后用Xbal/BamM酶切， 连接到pCambia2301载体，测序后成功构建的质粒命名为pCambia2301 :LRK1;
[0018] 2)转基因植株的获得
[0019] 将步骤1)中构建好的Pcambia2301: LRK1质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，用蘸 花法转化拟南芥，当代的拟南芥植株为T0代，收获的种子为T1代；
[0020] T1代种子在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植 株，分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达；
[0021] 用引物
[0022] P3:5 '-CTGGGAATGTTTTTGGAAG-3 '
[0023] P4:5 '-ACTCGGTCGTAGCTGAGGA-3 '
[0024]扩增获得920bp大小片段的T1植株则为成功转化LRK1的阳性转基因植株，收获的 种子为T2代。T2代阳性转基因植株在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上生长，且具有 黄萎病抗性。
[0025] 有益效果
[0026] 本研究通过陆地棉高抗黄萎病品种奥3503接种黄萎菌后的转录组进行分析，发现 一个基因受黄萎菌诱导表达，该基因与雷蒙德氏棉几丁质类受体激酶基因 l(Chitin elicitor receptor kinasel-like，登录号XM_012617234)相似度99%，以该基因的序列为 模板设计引物将该基因克隆，命名为LRK1，并将该基因转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植 株对落叶型以及非落叶型菌系均具有较高的抗性。棉花黄萎病抗性基因 LRK1的分离可以进 一步丰富抗性基因资源，对其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。具有如下的优 点和效果：
[0027 ] 1.本发明获得了 一个全新的赋予植物黄萎病抗性的LRK1基因。本发明获得的LRK1 基因来源于陆地棉品种奥3503,该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量明显上升。将 LRK1与构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因在转基因植株中表达后对落叶型强致病 力黄萎病菌V991和非落叶型强致病力黄萎病菌BP2均具有较强的抗性，发病率分别为 9.9%、8.2%，而对照野生型发病率分别为61.2%，56.3% IRKl的分离可以进一步丰富抗 性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。
[0028] 2.本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。LRK1的克隆为进一步了解病原 菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。可以利用该基因转基因植株进行进一步 分析LRK1是怎样传递抗性信号以及与了哪些信号传导过程，从而获得抗性信号传导通路。 LRK1的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。
[0029] 3.本发明应用于黄萎病抗性育种。LRK 1抗性效果良好，对测试的落叶型黄萎病菌 系V991和非落叶型黄萎病菌系BP2,发病率均低于10%，显著低于对照野生型大于50%的发 病率，大幅提高了对黄萎病的抗性，在育种中有较大的应用价值。 四、
【附图说明】
[0030]图1落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2处理陆地棉品种奥3503后LRK1的 表达。
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