专利名称：培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域中一种培育高抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载 体。
背景技术：
病害一直是农业生产上不可忽视的重要问题。据估计，目前病害造成的损失一般 为农作物产量的10%以上，一些病害，如水稻白叶枯病、小麦赤霉病和棉花黄萎病，是我国 稻、麦和棉区的主要病害，发病后一般使作物减产10-30%，严重时减产50%甚至更多，同 时还可导致农产品质量下降，给生产造成重大的损失。同时，目前农业生产上成片的单一种 植，直接降低了植物在遗传上的多样性，增加了时空上的连续性，为病原物的侵染和传播提 供了方便。长期以来，人们已经对植物抗病的机理及其在生产上的应用等方面做了大量的 工作，积累了相当多的资料，但由于对植物抗病机制仍缺乏深入的认识，抗病育种一直是农 业生产上的重大难题之一。随着分子生物学、植物病理学和基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提 高植物的抗病性，为抗病育种开辟了一条全新的途径。天麻抗真菌蛋白(Gastrodia Antifungal Protein，以下简称GAFP)是从红天麻 中独立分离和鉴定的抗真菌蛋白(胡忠，杨增明，王钧，1988，天麻球茎中一种抗真菌蛋白 的分离和部分特性，云南植物研究，10 373-380 ；胡忠，黄清藻，刘小烛，1999，天麻抗真菌 蛋白GAFP-I的一级结构和cDNA克隆，云南植物研究，21 (2) :131_138 ；王义琴、李文彬、Lam Honming，张秀海，陈潜，郭顺星，孙勇如，2000，天麻抗真菌蛋白(GAFP)的N端序列测定及 cDNA基因克隆，高技术通讯，10 (1) 10-14)，它对许多植物致病菌包括小麦赤霉病菌、水稻 纹枯病和黄萎病菌离体具有很强的抑制作用，在植物抗真菌基因工程中具有巨大的应用潜 力(Sa Q-L (萨其拉)，Wang Y (王义琴),Li ff(李文彬)，Zhang L (张利明)，Sun Y (孙勇 如)，Isolation of a genomic DNA for GastrodiaAntfungal Protein and analyses of its promoter in transgenic tobacco, Acta Bot Sin2003a, 45 (2) :229_233 ;Sa Q-L (萨其 拉)，Wang 丫(王义琴)，!^ W(李文彬)，Zhang L(张利明)，Sun Y(孙勇如)，The promoter of an antifungal protein gene from Gastrodiaelata confers tissue-specific and fungus-indueible expression patterns and responds to bothsalicylic acid and jasmonic acid, Plant Cell Rep 2003b ；22 79-84) 因此，获得含有天麻抗真菌蛋白GAFP的转基因植物对植物抗真菌病基因工程育 种具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育高抗黄萎病转基因植物的方法及其专用表达载体。本发明提供的培育转基因植物的方法，是将含有信号肽(Signal P印tide，简称 SP)的GAFPi蛋白(SPGAFPD的编码基因SPGAFPi导入目的植物得到黄萎病抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述SPGAFP1蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列2。所述SPGAFP1蛋白的编码基因的序列可为序列表中序列1。序列表中的序列1由540个核苷酸构成，自5 ‘末端第1-84位为编码信号肽的基 因，自5 ‘末端第85-537位为编码成熟肽的基因。
序列表中的序列2由179个氨基酸构成，自氨基末端第1-28位为信号肽，自氨基 末端第29-178位为成熟肽。上述SPGAFP1蛋白为天麻抗真菌蛋白信号肽SP及成熟肽GAFP1。 所述目的植物和所述转基因植物均可为双子叶植物，所述双子叶植物可为棉花，尤其优选 为陆地棉“中棉所24”。所述黄萎病可由下述致病菌引起大丽花轮枝孢(Verticilliu dahliae Kleb.)。所述SPGAFP1蛋白的编码基因通过下述表达载体导入所述目的植物中该表达载 体含有筛选标记基因、启动子和连接在所述启动子下游的SPGAFP1蛋白的编码基因。所述启动子可为组成型、维管组织特异表达或真菌诱导型启动子，所述组成型启 动子优选为35S启动子。所述筛选标记基因可为NPTII，即为卡那霉素抗性基因NPTII ；也可为除草剂 Bastar抗性基因Bar。优选卡那霉素抗性基因NPTII。所述载体为pCambiaZSOO-SSS-SPGAFP” 所述 pCambia2300-35S-SPGAFP1 为在 pCambia2300的HindIII和SacI位点间插入35S-SPGAFP:得到的载体；所述35S-SPGAFP:是 用 HindIII 和 SacI 酶切 PBI35S-SPGAFP:得到的小片段，所述 PBI35S-SPGAFP:是在 pBI221 的35S启动子下游的XbaI和SacI识别位点间插入SPGAFP1基因替换掉⑶S基因得到重组 载体。所述表达载体可采用花粉管通道法、基因枪或农杆菌介导法导入目的植物。上述表达载体、含有上述表达载体的重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范 围。实验证明将含有SPGAFP1的表达载体导入棉花获得的转SPGAFP1棉花，可以高效 地抵抗黄萎病菌的侵染，与转成熟肽基因GAFP1棉花相比，转SPGAFP1棉花具有稳定的、明显 增强的抗黄萎病能力，其病指数显著降低，说明转SPGAFP1棉花表达的天麻抗真菌蛋白能够 在信号肽的引导下将成熟肽GAFP1准确定位于胞外，从而有效增强了转基因植物对真菌病 源物侵染的抗性，进一步说明信号肽的存在明显增强了转基因植物的抗病性。
图1为转SPGAFP1陆地棉株系的PCR鉴定结果。图2为转SPGAFP1陆地棉株系的Southern杂交鉴定结果。
图3为转SPGAFP1陆地棉株系的RT-PCR电泳图。图4为转SPGAFP1棉花在病圃中的抗病效果。图5为转SPGAFP1陆地棉株系的剖杆实验结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1表达载体的构建一、含有SPGAFP1的高效表达载体的构建人工合成SPGAFP1基因，SPGAFP1的核苷酸序列为序列表中的序列1。将SPGAFP1 连接到PUCm-T (购自上海生工生物工程有限公司)上，构建载体PUCm-SPGAFP1。用XbaI 和 SacI 分别酶切 PUCm-SPGAFP1 *pBI221(购自 Clontech Laboratories, Inc.)，将酶切后的SPGAFP1片段连接到用同样的酶切去1. 9Kb⑶S片段的pBI221载体上， 得到中间载体pBI35S-SPGAFPlt)用HindIII 和 SacI 酶切中间载体 PBI35S-SPGAFP:得到 35S-SPGAFP:片段，再用 同样的酶酶切pCambia2300 (购自Cambia Laboratories公司)，将二者连接得到表达载体 pCambia2300-35S-SPGAFPlo该表达载体的细菌和植物抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr+ 和NPTII筛选标记基因。 实施例2将含有SPGAFP1的高效表达载体导入棉花获得转SPGAFP1棉花用农杆菌介导法获得转SPGAFP1棉花1)将实施例1中获得的表达载体pCambidSOOjSS-SPGAFPi转化到根癌农杆菌 LBA4404(购自Invitrogen公司)中，构建含有SPGAFP1表达载体的根癌农杆菌LBA4404/ pCambia2300-35S-SPGAFPlo挑取LBAAAOVpCambiaZSOO-SSS-SPGAFPi 的农杆菌单菌落，接种于 20ml 含 50mg/L 卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28°C、280rpm过夜培养至0D600 为0.7 0.8。然后5000rpm离心，弃上清，沉淀用MS液体培养基重新悬浮。最后将陆地 棉“中棉所24”(于规、刘传亮、马峙英、李付广、李凤莲、王玉芬、武芝霞、张朝军，陆地棉中 棉所24胚性愈伤组织的诱导及植株再生，西北植物学报，2004，24 (2) :306_310，公众可从 中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)的棉花愈伤组织在悬浮液中浸泡10分钟。2)将愈伤组织用无菌吸水纸吸干，放置于MS培养基上，暗培养2 3天后，用无菌 水将外植体洗净，转到含有100μ g/ml头孢霉素，75μ g/ml卡那霉素的分化培养基中，在12 小时光照，12小时黑暗的条件下，继续培养至分化出小芽。3)待芽长到1 2cm后，用无菌剪刀和镊子将分化的芽剪下，插到生根培养基中， 继续培养4周左右，移栽到土壤中，得到210株棉花转化苗。所述分化培养基的配方为每IOOOmL水中含有下述物质KN032g，NH4NO3Ig, MgSO4Ig, KH2P045g, CaCl2 · H2Olg, FeSO4 · 7H200. 3g, MnSO4 · 4H200. 055g, ΚΙ0. Olg, CuSO4O. 00005g、CoCl2O. 00005g、HBO3O. 008g,吲哚乙酸 IAA 0. 003mg,激动素 KT 0. 05mg,葡 萄糖 25g，琼脂 15g，pH6. 5。所述生根培养基的配方为每IOOOmL水中含有下述物质KN032g，NH4NO3Ig, MgSO4Ig, KH2P045g, CaCl2 · H2Olg, FeSO4 · 7H200. 3g, MnSO4 · 4H20 0. 055g, ΚΙ0. Olg, CuSO4O. 00005g、CoCl2O. 00005g、HBO3O. 008g,萘乙酸 NAA 5mg,激动素 KT lmg,谷氨酰胺 0. 6g，葡萄糖25g，琼脂15g，pH值为6. 5。采用上述方法，克隆GAFP1基因并构建得到重组载体pCambiaZSOO-SSS-GAFPp将 该重组载体导入陆地棉"中棉所24"中获得含有该基因的TO代转GAFP1棉花。 实施例3转pCambidSOO-SSS-SPGAFPi棉花后代的筛选及黄萎病抗性检测一、利用卡那霉素初步筛选转SPGAFP1棉花后代
在由实施例2中获得的棉花转化苗长出3 4片真叶时，利用卡那霉素涂抹叶片 进行转SPGAFPi棉花的初筛实验，具体步骤如下将浓度为1. 0%的卡那霉素，涂抹在幼苗 叶片表面，5天后进行观察，结果显示，部分转SPGAFPi棉花单株叶片的涂抹点变黄，这些叶 片变黄的单株为显症单株。淘汰这些显症单株，将余下的单株再继续第二轮筛选、淘汰，如 此连续涂抹三次，选出三次不显症36株TO代转SPGAFPi棉花单株。二、利用分子检测技术筛选转SPGAFPi棉花后代1、提取总 DNA采摘上述初筛选出的不显症TO代转SPGAFPi棉花单株的新鲜幼嫩叶片，用CTAB法 提取总DNA。2、分子检测1)PCR 检测以步骤1获得的各单株叶片的总DNA为模板，以实施例1中获得的质粒 pCambia2300-35S-SPGAFP1为阳性对照，以非转基因的棉花总DNA为阴性对照，以SGAFP^F 引物5，-CAG CCA TGG CAG CAT CCG CAA GCA C_3’ 禾口 GAFP「R 弓|物5，_GCG TCG ACC TAT TCT CTT AGA CCG T_3’作为上下游引物进行PCR扩增。PCR反应的总体积为20 yl，程序 为先 94°C 3min;然后 94°C 40s，55°C 30s，72°C 40s，30 个循环后；72°C延伸 lOmin。反 应结束后，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果如图1所示泳道1为Marker，泳道12为 阳性对照，泳道13为阴性对照，泳道2-11为不同的TO代转SPGAFh棉花株系。从图1可 以看出，与阳性对照相比，泳道2-7和9-11在537bp处均有特异条带，且条带的大小与阳性 对照扩增的片段大小一致，说明这些泳道为TO代转SPGAFPi棉花。2) Southern 杂交取步骤1获得的各单株叶片的总DNA约10ii g，用Hindlll+SacI在37°C双酶切 过夜，阴性对照为非转基因的棉花总DNA ；阳性对照为是经Hindlll+SacI双酶切的质粒 pCambia2300-35S-SPGAFP1琼脂糖凝胶电泳检测后，将核酸电转移到尼龙膜上(BioRad公司 Mini-3cells)，操作方法按照BioRad公司使用说明。同样用a -32P_dCTP标记SPGAFP:基 因为探针进行点杂交。经电泳检测，结果如图2所示，1为阴性对照，2-6为T0代转SPGAFPi 棉花的不同株系，7为经Hindlll+SacI双酶切的质粒pCambiaZSOCKBSS-SPGAFPi，从图2中 看出，T0代转SPGAFPi棉花株的SPGAFPi基因整合进了棉花基因组中。3)RT_PCR 检测为了检测Southern阳性植株中SPGAFPi基因是否得到了表达，进一步进行RT-PCR 检测。用CTAB法提取上述Southern杂交检测的阳性植株的总RNA，1. 5%琼脂糖凝胶电 泳检测后，使用Access RT-PCR试剂盒(购自Promega公司)进行一步法RT-PCR，操作的 详细步骤参见试剂盒说明书。阳性对照分别为实施例2获得的pCambidSOCKBSS-GAFPi 和 pCambiaZSOO-SSS-SPGAFPi，RT-PCR 中除阳性对照 pCambiaZSOO-SSS-GAFPi 的引物为 GAFPfF :5，-TTC CAT GGT TAG CGA TCG GTTGAA TTC G_3，和GAFP「R :5，_GCG TCG ACC TAT TCT CTT AGA CCG T_3，外，其余均采用上游引物 SPGAFPfF 为:5，-CAG CCA TGG CAG CAT CCG CM GCA C-3，;下游引物GAFP「R为:5，_GCG TCG ACC TAT TCT CTTAGA CCG T_3，。经电 泳，结果如图3所示，M为Marker，NC为阴性对照，PCI为阳性对照pCambiaZSOCKBSS-GAFPi， PC2为阳性对照pCambiaZSOO-SSS-SPGAFPi，1-7为不同的T0代转SPGAFP:棉花株系。从图3中可以看出，与阳性对照PC2相比，泳道1-7在537bp处均有特异条带，且条带的大小与 阳性对照扩增的片段大小一致，说明这些泳道为TO代转SPGAFPi棉花。表明该转基因样品 中，SPGAFPi基因得到了正确的表达。三、病圃筛选和剖杆实验进行转SPGAFPi棉花后代的黄萎病抗性检测1、病圃筛选进行转SPGAFPi棉花后代的黄萎病抗性检测1)培养棉花黄萎病的病原菌大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)(购自中国 科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号3. 3758)棉花黄萎病菌大丽轮枝菌培养物采用棉籽或麦粒砂，先将棉籽或麦粒用水煮涨为 止，浙干水分后，装入广口瓶，高压湿热灭菌2h;在超净台上将已培养好的黄萎病菌平板或 斜面接入其中，随后置于25°C恒温箱培养(10 15) d。2)病圃的建立按每公顷(450 750)Kg的接种量，将培养好的棉花黄萎病的病原菌菌种均勻地 施入田间，再翻耕(2 3)遍，使病菌与土壤混均勻。3)标准对照选取实施例3中经卡那霉素初筛、PCR、S0uthern检测和RT-PCR分子鉴定筛选出的 稳定表达SPGAFPi的TO代转SPGAFPi棉花中的4株，培育得到4个纯合的T2代转SPGAFPi 棉花株系。将实施例2获得的含有GAFPi基因的TO代转GAFPi棉花培育得到4个纯合的T2 代转GAFPi棉花株系。以受体材料陆地棉“中棉所24”、感病对照冀棉11号(房卫平、许守明、孙玉堂、唐 中杰、王家典，棉花抗黄萎病的RAPD标记，河南农业科学，2001，9 :11_12，公众可从中国科 学院遗传与发育生物学研究所获得)、实施例2获得的T2代转GAFPi棉花四个株系为对照， 经过上述步骤二的三种分子检测均为阳性的T2代转SPGAFPi棉花的四个株系为鉴定植株， 将对照植株和鉴定植株在人工病圃中随机分布，按棉花正常的播种时间和田间管理方式进 行种植，保持田间的适当湿度，以利于黄萎病的发生。4)发病检测进行病圃筛选，对铃期(8月中下旬)的棉花逐株进行三次病情调查，观察T2代转 SPGAFPi棉花后代的抗病情况。采用成株期鉴定法，单株划分黄萎病的病情级别，发病程度采用5级(0、1、2、3、 4)分级法调查，用发病程度值的大小作为衡量抗病程度的一个指标，筛选出抗病的单株。0 级健株；1级病株叶片有25%以下表现病状，叶片主脉间产生淡黄色或黄色不规则病斑； 2级病株叶片有25% 50%表现病状，病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘略有 卷枯；3级病株叶片有50% 75%表现病状，病斑颜色大部分成黄褐色，叶片边缘卷枯，有 少数叶片凋落；4级全株叶片发病，多为褐色掌状枯斑，以致植株死亡。按照下列公式计算病情指数病情指数=(E各级病级X相应病级发病株数)/ 调查总株数X4X100经鉴定，该黄萎病是由大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)病原菌引起。图4为T2代转SPGAFPi棉花在病圃中的抗病效果，1为陆地棉“中棉所24”、2为 转SPGAFh棉花，3为转GAFPi棉花，从图中可以看出转SPGAFP:棉花抗病效果良好，其具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力。经过病圃筛选，结果如表1所示，其中HR代表高抗、R代表抗病、T代表耐病、S代表 感病，受体材料为“中棉所24”(病圃编号Hn8336-10)、感病对照为“冀棉11号”(病圃编号 Hn8336-9)，病圃 Hn8336_l 至 Hn8336_4 为 TO 代转 GAFP:棉花，病圃 Hn8336_5 至 Hn8336_8 为TO代转SPGAFPi棉花，从表1中可以看出TO代转SPGAFPi棉花的感染率、病指数均明显 高于TO代转GAFPi棉花，TO代转SPGAFPi棉花多为高抗，TO代转GAFPi棉花仅为抗病型，说 明TO代转GAFPi棉花具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力，抗黄萎病效果显著。表1转SPGAFPi/GAFPi陆地棉株系铃期的病圃鉴定结果 进行剖杆实验检测，结果如图5所示，1为“中棉所24”，2为转GAF&的棉花，3为转 SPGAFPi棉花，其中“中棉所24”棉花杆横截面中有较多的褐色黄萎病菌侵染斑点，转GAFPi 棉花杆横截面就相比于对照好很多，但也见少量褐点，转SPGAFPi棉花的杆横截面最为干 净，说明受黄萎病菌的侵染最少，这个实验也说明转SPGAFPi的转基因植株抗黄萎病的能力 明显好于转GAFPi棉花。从上述的抗病效果、病圃筛选和剖杆实验均可看出，与转GAFPi棉花相比，转 SPGAFPi棉花具有稳定的、明显增强的抗黄萎病能力，其病指数显著降低，说明转SPGAFPi棉 花中表达的天麻抗真菌蛋白能够在信号肽(SP)的引导下将成熟肽GAFPi准确定位于胞外， 从而有效增强了转基因植物对真菌病源物侵染的抗性，进一步说明信号肽的存在明显增强 了转基因植物的抗病性。
权利要求
一种培育转基因植物的方法，是将SPGAFP1蛋白的编码基因导入目的植物得到黄萎病抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述SPGAFP1蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述SPGAFPi蛋白的编码基因的序列为序 列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物和所述转基因植物均 为双子叶植物，所述双子叶植物为棉花，尤其优选为陆地棉“中棉所24”。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述黄萎病由下述致病菌引起大 丽花轮枝孢(Verticilliu dahliae Kleb.)。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述SPGAFPi蛋白的编码基因通 过下述权利要求6-10中任一所述的表达载体导入所述目的植物中。
6.一种表达载体，含有筛选标记基因、启动子和连接在所述启动子下游的SPGAFPi蛋白 的编码基因。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于所述启动子为组成型、维管组织特异表达 或真菌诱导型启动子，所述组成型启动子优选为35S启动子。
8.根据权利要求6或7所述的载体，其特征在于所述筛选标记基因为NPTII。
9.根据权利要求6-8中任一所述载体，其特征在于所述载体为 pCambia2300-35S-SPGAFP1,所述 pCambiaZSOO-SSS-SPGAFPi 为在 pCambia2300 的 Hindlll 和SacI位点间插入35S-SPGAFP!得到的载体；所述35S-SPGAFP:是用Hindlll和SacI酶 切pBUSS-SPGAFPi得到的小片段，所述pBUSS-SPGAFPi是在pBI221的35S启动子下游的 Xbal和SacI识别位点间插入SPGAFPi基因替换掉⑶S基因得到重组载体。
10.含有权利要求6-9中任一所述表达载体的重组菌或转基因细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种培育抗黄萎病转基因棉花的方法及其专用表达载体。本发明的培育抗黄萎病转基因植物的方法，是将SPGAFP1蛋白的编码基因导入目的植物得到黄萎病抗性高于所述目的植物的转基因植物；所述SPGAFP1蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列2。所述SPGAFP1蛋白的编码基因的序列可为序列表中序列1。所述目的植物和所述转基因植物均可为双子叶植物，所述双子叶植物可为棉花，尤其优选为陆地棉″中棉所24″。实验证明将含有SPGAFP1的表达载体导入棉花获得的转SPGAFP1棉花，可以高效地抵抗引发黄萎病的真菌，说明信号肽的存在明显增强了转基因植物的抗病性。
文档编号A01H5/00GK101870977SQ201010146639
公开日2010年10月27日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者储成才, 孙勇如, 王义琴, 陈晨 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所