一种棉花黄萎病抗病性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于棉花抗病性检测技术领域，具体涉及一种棉花黄萎病抗病性的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 黄萎病是一种毁灭性土传维管束病害，可侵染多种草本作物、木本作物、花丼及木 本观赏植物。棉花黄萎病是世界性的棉花重要病害之一，一般在幼苗期几乎不会出现，生 长中后期棉花现蕾后田间大量发病，容易导致整个植株枯死或萎蔫。棉花黄萎病的病原为 大丽花轮枝菌和黑白轮枝菌，由于其致病因子种类繁多，变异较快，抗病遗传规律又尚未 明确，因此选育抗病品种是防治棉花黄萎病最经济有效的措施之一，棉花黄萎病抗病品种 (系）对棉花品种的产量和品质具有很大的影响。在棉花黄萎病研宄及选育抗病品种的过 程中，黄萎病抗性鉴定是病原菌致病性分化、寄主抗性遗传、抗病机制抗病种质筛选、抗病 品种（系）选育等研宄工作的重要基础，
[0003] 目前，较常用的棉花黄萎病抗病性的检测鉴定方法主要是人工病圃或自然重病田 进行成株期鉴定，该方法主要依赖于植株发病情况进行鉴定，接近生产实际，可对棉花黄萎 病进行全程检测，是棉花品种从区域试验走向生产、对黄萎病抗性进行把关鉴定的最准确 有效的方法。但是，棉花成株期检测鉴定所需时间长和占据空间多，不适合大批量材料的抗 黄萎病筛选工作，且受到土壤菌量、温度、湿度等多种环境条件的影响和季节的限制，稳定 性和重复性较差。如何在快速、准确的对棉花黄萎病抗病性进行苗期检测鉴定，是急需解决 的问题；通过对棉花黄萎病抗病性的检测，可进行科学快速的棉花育种，进而获得对黄萎病 具有高抗病性的棉花新品种。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速、准确的棉花黄萎病抗病性的检测方法，无需等待 棉苗发病，即可判断棉花黄萎病抗病性。
[0005] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0006] -种棉花黄萎病抗病性的检测方法，包括将黄萎病病菌接种至棉苗，检测接种后 棉苗叶片中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性，并根据棉苗中几丁质酶活性和/或葡聚 糖酶活性判断棉花黄萎病抗病性。
[0007] 根据棉苗中几丁质酶（CHI)活性和/或葡聚糖酶（GLU)活性判断棉花黄萎病抗病 性是指根据几丁质酶酶活力单位和/或葡聚糖酶酶活力单位的量判断棉花黄萎病抗病性。
[0008] 所述几丁质酶酶活力单位，是以样品中每毫克蛋白中lmin内由CHI(几丁质酶， chitinase)催化反应生成的N-乙酰氨基葡萄糖量（N-乙酰葡萄糖胺）定义为一个酶活力 单位。所述葡聚糖酶酶活力单位，是以每分钟水解0 -葡聚糖产生1Umol还原糖（以葡萄 糖计）所需的酶量，定义为一个酶活力单位。
[0009] 所述棉花黄萎病抗病性的判断标准为：
[0010] 几丁质酶酶活力单位>36. 1，和/或葡聚糖酶酶活力单位>90. 8,为免疫材料；
[0011] 几丁质酶酶活力单位为32. 2~36. 1，和/或葡聚糖酶酶活力单位为78. 3~90. 8， 为尚抗材料；
[0012] 几丁质酶酶活力单位为28. 7~32. 1，和/或葡聚糖酶酶活力单位为67. 3~78. 2， 为抗病材料；
[0013] 几丁质酶酶活力单位为25. 9~28. 6,和/或葡聚糖酶酶活力单位为58. 0~67. 2， 为耐病材料；
[0014] 几丁质酶酶活力单位为24. 7~25. 8,和/或葡聚糖酶酶活力单位为53. 9~57. 9， 为易感材料；
[0015] 几丁质酶酶活力单位为〈24. 7,和/或葡聚糖酶酶活力单位为〈53. 9,为感病材料。
[0016] 所述酶活力单位的结果数值保留一位小数。
[0017] 所述免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料、易感材料、感病材料的棉花黄萎病 抗病性依次降低。除感病材料以外，所述免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料、易感材 料在生产上可以应用；但用于品种选育时，选择划分为耐病材料及以上的指标范围（免疫 材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料）。
[0018] 所述的判断标准中，为减少操作和节约成本，可单独检测几丁质酶活性或葡聚糖 酶活性进行初步判断，检测结果达耐病等级以下指标时，不再进行另一指标检测；检测结果 达抗性水平以上时，再增加另一检测指标，优选两项指标同时达标才最终判定其相应等级。
[0019] 对于同一种检测对象，当几丁质酶活性与葡聚糖酶活性的检测结果对应不同的材 料等级时，以相对较低的等级作为该材料的对应等级。即两项指标的检测结果出现冲突时， 本着从严从重的原则，以相对较低等级判定所检测材料的对应等级。
[0020] 优选的，所述检测方法中，检测接种后棉苗叶片中的几丁质酶活性和葡聚糖酶活 性，并根据棉苗中几丁质酶活性和葡聚糖酶活性判断棉花黄萎病抗病性。
[0021] 所述接种方法为伤根蘸菌液法，包括将棉苗主根剪掉1~3cm后，将棉苗的剪切伤 口浸入黄萎病病菌菌液中7~10s进行接种。
[0022] 所述伤根蘸菌液法在室内进行，对棉苗无损害，植株成活率高，接种方便快捷；后 期黄萎病发病较快速、稳定和明显。
[0023] 所述接种是当棉苗长至两片真叶完全展开时进行接种。
[0024] 所述棉苗是由以下方法制备的：取棉籽，在育苗穴盘内进行单粒播种后，覆盖灭菌 后的基质至基质层厚lcm，再盖土至土层厚为2cm;出苗期间保证水分充足；出苗后，控制环 境昼夜温度为25~30 °C。
[0025] 育苗所用的棉籽，选择颗粒饱满均匀、适宜当地的自然条件、质量达到国家标准的 优良种子。
[0026] 接种时，将育苗穴盘取出，从穴盘下面直接将外露的主根剪切l-3cm再进行接种 操作。
[0027] 所述育苗穴盘中单穴直径3cm、高3cm。
[0028] 所述基质为草炭土。使用草炭土便于棉苗的健壮生长，和接种后方便带土移栽 (容易抱团）；草炭土高压灭菌后备用。
[0029] 所述黄萎病病菌为中等致病力黄萎病病原菌。
[0030] 所述黄萎病病菌为黄萎病病菌VD-1。
[0031] 所述黄萎病病菌菌液中，黄萎病病菌孢子的浓度为107个/ml。
[0032] 所述黄萎病病菌菌液是由以下方法制备的：将黄萎病病菌接种至PDA固体培养 基，培养3~7天后转入PDA液体培养基中培养，至菌液中黄萎病病菌孢子的浓度为107个 /ml，4°C冷藏备用。
[0033] 所述PDA固体培养基中，马铃薯、葡萄糖、琼脂与水的质量比为200:10~20:17~ 20:1000。
[0034] 所述PDA液体培养基中，马铃薯、葡萄糖与水的质量比为200:10~20:1000。
[0035] PDA培养基对于棉花黄萎病病菌VD-1菌种的生长和孢子的繁殖具有十分快速有 效的作用。
[0036] 接种后的棉苗继续育苗，接种后72h时进行几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性检 测。
[0037] 所述检测是检测棉苗叶片中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性。
[0038] 所述几丁质酶活性的检测方法为Reissing法。
[0039] 所述Reissing法包括下列步骤：
[0040] a)酶样制备：取