一株防治棉花黄萎病的木霉菌及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)的保藏编号为CGMCC No.9727。本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂的活性成分包含如上所述的木霉菌、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和摩加夫芽胞杆菌(Bacillus mojavensis)。本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的微生物菌剂在棉花黄萎病防治中的应用。通过上述技术方案，本发明能够有效地防治棉花黄萎病的发生。CGMCC No.972720140925
【专利说明】一株防治棉花黄萎病的木霉菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物应用领域，具体地，涉及一种木霉菌（Trichoderma Iongibrachiatum)，含有该木霉菌的微生物菌剂以及它们在棉花黄萎病防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是危害棉花生产的主要病害之一，黄萎病对棉花的产量和品质影响很 大，一般减产10 %?30 %，发生严重的地块减产可达80 %以上，甚至绝收。棉花黄萎病能在 棉花整个生长期间侵染为害。黄萎病一般在播种1个月以后出现病株，由于受棉花品种抗 病性、病原菌致病力及环境条件的影响，黄萎病呈现不同症状类型。
[0003] 棉花黄萎病的病原为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.)。该菌在不同地 区，不同品种上致病力有差异。我国分为3个生理型，生理型1号致病力最强，以陕西泾阳 菌系为代表；生理型2号致病力弱，以新疆和田菌系为代表；生理型3号在江苏发现，引起 的症状是顶叶向下卷曲褪绿，迅速脱落，后顶端枯死。棉花病株各部位的组织均可带菌，病 叶作为病残体存在于土壤中是该病传播重要菌源。棉籽带菌率很低，却是远距离传播重要 途径。病菌在土壤中直接侵染根系，病菌穿过皮层细胞进入导管并在其中繁殖，产生的分生 孢子及菌丝体堵塞导管，此外病菌产生的轮枝毒素也是致病重要因子，毒素是一种酸性糖 蛋白，具有很强的致萎作用。在温度适宜范围内，湿度、雨日、雨量是决定该病消长的重要因 素。地温高、日照时数多、雨日天数少发病轻，反之则发病重。在田间温度适宜，雨水多且均 匀，月降雨量大于100mm，雨日12天左右，相对湿度80%以上发病重。一般蕾期零星发生， 花期进入发病高峰期。连作棉田、施用未腐熟的带菌有机肥及缺少磷、钾肥的棉田易发病， 大水漫灌常造成病区扩大。
[0004] 目前，棉花黄萎病的主要防治手段包括选用抗病棉花品种、轮作倒茬和加强棉田 管理；加强棉田管理包括清洁棉田，减少土壤菌源，及时清沟排水，降低棉田湿度，使其不利 于病菌滋生和侵染，平衡施肥，氮、磷、钾合理配比使用，切忌过量使用氮肥，重施有机肥，侧 重施磷、钾肥，以利棉株健壮生长，增强自身的抗逆能力，整个生长期喷施黄腐酸钾3-4次 可减少黄萎病的发病几率。
[0005] 棉花黄萎病的主要防治手段还包括药剂处理，例如在棉花种植前用五氯硝基苯、 清壤或立本净等土壤消毒剂同肥料一同撒施深翻施入土壤进行土壤消毒；棉花苗期喷施 70 %代森锰锌500-600倍液、乙蒜素1000倍液或菌毒克1000倍液，棉花花铃期在病害发生 轻的棉田，对病株及病株周边的健康棉株用乙蒜素1000倍液或五氯硝基苯1000倍液均匀 喷施，同时每株用配好的药液0. 25-0. 5公斤药液灌根；对较重病株，重复喷灌2-3次。防效 与其它防治方法相比，药剂处理具有操作简单、规模大、起效快、效果明显等特点，但是长期 使用化学农药也存在污染环境、易产生抗药性等问题。
[0006] 生物防治是防治棉花黄萎病的一条极具潜力的防治途径。生物防治具有无污染、 无残留、难以产生抗药性等特点，对于棉花病害的防治具有极大的潜力。利用对棉花黄萎病 病原真菌的拮抗作用筛选生防微生物，是棉花黄萎病防治的有效途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明人分离了一株木霉菌，发现其能够显著的抑制棉花黄萎病菌的生 长，有效防治棉花黄萎病的发生，由此得到了本发明。
[0008] 本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌（Trichoderma Iongibrachiatum)的保藏编 号为 CGMCC No. 9727。
[0009] 本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂活性成分包含如上 所述的木霉菌、商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus)和商品号为ACCC 01174 的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis) 〇
[0010] 本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂在棉花黄萎病 防治中的用途。
[0011] 通过上述技术方案，本发明提供的木霉菌或复合微生物菌剂对于棉花黄萎病具有 较高的防效，并且具有绿色环保的优点。
[0012] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0013] 生物材料保藏
[0014] 本发明的木霉菌（Trichoderma Iongibrachiatum)是本发明的发明人从新疆棉田 采集获得，其保藏编号为CGMCC No. 9727,保藏日期为2014年9月25日，保藏单位为中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分 类命名为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum) 〇
【具体实施方式】
[0015] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0016] 本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌（Trichoderma longibrachiatum)的保藏编 号为 CGMCC No. 9727。
[0017] 本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂活性成分包含如上 所述的木霉菌、商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus)和商品号为 ACCC 01174 的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis)。
[0018] 其中，相对于Ig的微生物菌剂，所述木霉菌的含量可以为IO5-IO9CFU,优选为 IO 6-IO8CFU0
[0019] 其中，所述木霉菌、所述蜡状芽胞杆菌和所述摩加夫芽胞杆菌的CFU比优选为1 : (10-20) : (10-20)〇
[0020] 其中，该微生物菌剂可以通过包括如下步骤的制备方法制备得到：
[0021] (1)将如上所述的木霉菌、商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌和商品号为ACCC 01174的摩加夫芽胞杆菌菌种分别在活化培养基中接种并培养得到各自的活化菌种；
[0022] (2)将木霉菌的活化菌种在木霉菌液体发酵培养基中培养，将蜡状芽胞杆菌和摩 加夫芽胞杆菌各自的活化菌种分别接种到液体培养基中并进行发酵，得到各自的发酵后的 菌液；
[0023] (3)将步骤（2)得到的三种菌液分别经惰性载体吸附、烘干和粉碎，得到各个菌种 的菌粉；
[0024] (4)将木霉菌、蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆菌的菌粉混合，得到复合微生物菌 剂。
[0025] 其中，步骤（1)中，菌种的活化培养条件及培养后菌种状态没有特别的限制，可 以为木霉菌、蜡状芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌培养过程中常用条件，例如培养温度可以为 28-37?，培养时间可以为1-5天。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如显微镜观察 确定活化菌种的状态。
[0026] 其中，步骤（2)中，发酵的条件和发酵后的物料中的活菌浓度没有特别的要求， 可以为木霉菌、蜡状芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌发酵过程中常用的条件和浓度，作为本 发明优选的一种实施方式，步骤（2)中，发酵的条件使得发酵后的物料中的活菌浓度为 (5-500) X 108CFU/mL，在该优选实施方式中的活菌浓度下，获得的发酵后的菌液作为微生 物菌剂制备的原料使用。例如发酵的时间可以为30-200小时，温度可以为28-36°C。
[0027] 其中，所述活化培养基可以为常规的各种能够培养木霉菌、蜡状芽胞杆菌、摩加夫 芽胞杆菌的培养基，例如包括但不限于PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB 培养基中的至少一种。
[0028] 其中，所述木霉菌液体发酵培养基可以为常规的各种能够发酵扩大木霉菌数目的 液体培养基，例如所述液体培养基可以含有淀粉，酵母粉，玉米浆的至少一种；且所述液体 培养基还可以含有〇. 01-0. 02重量％的ZnSOjP 0. 01-0. 03重量％的MgSO 4，以补充木霉菌 快速生长时所需的无机盐。
[0029] 其中，所述蜡状芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌液体发酵培养基可以为常规的各种能 够发酵扩大蜡状芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌数目的液体培养基，例如所述液体培养基可以 含有玉米淀粉、花生饼粉的至少一种；且所述液体培养基还可以含有〇. 2-0. 5重量％硫酸 铵、0. 02-0. 05重量％硫酸镁和0. 01-0. 05重量％氯化钠，以补充蜡状芽胞杆菌、摩加夫芽 胞杆菌快速生长时所需的无机盐。
[0030] 其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，以所述木霉菌液体发酵培养基的总 重量为基准，以重量比计算，所述木霉菌液体发酵培养基含有2. 0-3. 5%淀粉，1. 0-2. 0%酵 母粉，4. 0-8. 0%玉米浆，0· 1-0. 5% 的 CaCO3,0· 01-0. 02% 的 ZnSO4和 0· 01-0. 03% 的 MgS04。 其中，该培养基还可以含有余量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让木霉 菌在发酵过程中快速生长，产生足够数量的厚垣孢子，另一方面获得的发酵后的物料作为 微生物菌剂使用，能够更好地在棉花黄萎病防治中应用。
[0031] 其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，以重量比计算，所述蜡状芽胞杆菌、 摩加夫芽胞杆菌液体发酵培养基含有1-1. 5%玉米淀粉、1. 0-1. 5%花生饼粉、0. 2-0. 5%硫 酸铵、0. 1-0. 4%碳酸钙、0. 02-0. 05%硫酸镁和0. 01-0. 05%氯化钠。其中，该培养基还可以 含有余量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让蜡状芽胞杆菌或摩加夫芽 胞杆菌在发酵过程中快速生长，产生足够数量的芽胞，另一方面获得的发酵后的物料作为 微生物菌剂使用，能够更好地在棉花黄萎病防治中应用。
[0032] 其中，发酵后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，也可以通过包括载体吸附、烘 干、粉碎和/或造粒等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。惰性载 体的用量可以使得木霉菌菌粉中活菌含量达到（2-5) X 108CFU/g，三种菌粉中活菌含量各 自达到（5-20) X 108CFU/g。蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆菌的菌粉中活菌含量分别达到 (2-10) X 109CFU/g。将木霉菌、蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆菌的菌粉混合；使得所述木霉 菌、所述蜡状芽胞杆菌和所述摩加夫芽胞杆菌的CFU比为1 : (10-20) : (10-20)。该复合微 生物菌剂制备中三种菌剂的配制并不限于上述比例，可以为其它比例的混合。
[0033] 其中，所述惰性载体可以包括碳酸钙、黄土、硅藻土、膨润土、滑石粉、云母粉、高岭 土和方解石粉中的至少一种。
[0034] 本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂在棉花病害防 治中的用途。
[0035] 其中，在本发明的一种优选的实施方式中，将如上所述的木霉菌或如上所述的复 合微生物菌剂在棉花黄萎病防治中应用。
[0036] 其中，在本发明特别优选的一种实施方式中，在栽种棉花的农田施用木霉菌或如 上所述的复合微生物菌剂；其中，栽种棉花前将木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂与细 土混匀，施入种植土壤中；或者在棉花苗期或花铃期，将木霉菌或如上所述的复合微生物菌 剂与细土混匀，施入种植土壤中。
[0037] 以下通过实施例进一步详细说明本发明：
[0038] 实施例1
[0039] 本实施例用于说明本发明的木霉菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0040] 将保藏编号为 CGMCC No. 9727 的木霉菌（Trichoderma Iongibrachiatum)接种到 活化培养基PDA培养基（取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，将汁与2g葡萄糖、I. 5g 琼脂和水配成l〇〇ml，pH6. 8-7. 0,装入2个茄子瓶，每个50ml，灭菌后制斜面）上，在30°C培 养6天。将活化好的斜面木霉菌菌种接种至灭菌的液体发酵培养基（以重量计，含有2. 5% 淀粉，1.5%酵母粉，5.0%玉米浆，0.4%的0&0)3,0.01%的21^0 4、0.03%的]\%504)，28°〇培 养132小时，至90%菌丝都形成厚垣孢子，得到木霉菌液。
[0041] 将5000mL上述木霉菌液进行离心，收集湿菌体，与适量载体娃藻土充分混合。将 混合均匀的物料置于50°C烘箱中，烘烤4-7个小时，使其含水量小于5%。利用平板培养 计数法检测菌粉中活菌数量，然后使用硅藻土调节直至每克菌剂中含有的木霉活菌数为5 亿，所得到的物料即为本实施例的木霉菌微生物菌剂。
[0042] 实施例2
[0043] 本实施例用于说明本发明的复合微生物菌剂的制备。
[0044] 将商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus)接种到LB培养基 (含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和15g/L琼脂）斜面上，在36°C 培养15小时，得到活化的菌种。将活化好的菌种接种至灭菌的液体发酵培养基（以重量计， 含有1 %玉米淀粉、1. 5 %花生饼粉、0. 5 %硫酸铵、0. 4 %碳酸钙、0. 03 %硫酸镁、0. 02 %氯化 钠）中，于35°C培养至活菌浓度为5-10X 109CFU/mL，得到蜡状芽胞杆菌菌液。
[0045] 将商品号为ACCC 01174的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis)接种到LB培 养基（含l〇g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和15/L琼脂）斜面上，在 35°C培养12小时，得到活化的菌种。将活化好的菌种接种至灭菌的液体发酵培养基（以 重量计，含有1. 2 %玉米淀粉、1. 5 %花生饼粉、0. 4 %硫酸铵、0. 5 %碳酸钙、0. 03 %硫酸镁、 0.02%氯化钠）中，于37°〇培养至活菌浓度为5-10\1(^^"1^，得到摩加夫芽胞杆菌菌 液。
[0046] 分别将5000mL上述蜡状芽胞杆菌或摩加夫芽胞杆菌菌液进行离心或抽滤，收集 湿菌体，然后与适量载体硅藻土混合。将充分混合均匀的物料置于60°C烘箱中，烘烤4-7个 小时，使其含水量低于5%。利用平板培养计数法检测菌粉中活菌数量，然后使用硅藻土调 节直至每克菌剂中含有的蜡状芽胞杆菌或摩加夫芽胞杆菌活菌数为20亿。
[0047] 将实施例1得到的木霉菌菌粉、以及本实施例得到蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆 菌菌粉按重量比1 :3 :3混合，所得到的物料即为本实施例的复合微生物菌剂。
[0048] 对比例1
[0049] 按照实施例2的方法制备复合微生物菌剂，不同的是，木霉菌使用的是文献（孟娜 等，4种木霉菌对棉花黄萎病菌抑制作用的测定，《生物学杂志》，2007年04期）中的V。绿 色木霉（Trichoderma viride) 〇
[0050] 对比例2
[0051] 按照实施例2的方法制备复合微生物菌剂，不同的是，用商品号为ACCC03221的枯 草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)和商品号为ACCC 10166的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)分别替换商品号为ACCC 11109的赌状芽胞杆菌（Bacillus cereus) 和商品号为ACCC 01174的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis)。
[0052] 测试实施例I
[0053] 本测试实施例在田间试验中测定本发明的微生物菌剂在防治棉花黄萎病中的效 果。
[0054] 试验田位于山东省济宁市。将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎，用等重量的水 浸泡48小时，过滤得到含有黄萎病致病菌的浸种液。将军棉1号的棉花种子浸泡于上述 含有黄萎病致病菌的浸种液中24小时，浸种液的用量足以淹没棉花种子，得到浸泡后的种 子。
[0055] 将浸泡后的种子播种于棉田中，设置实施例1制备得到的木霉菌剂、实施例2和对 比例1、2制备得到的复合微生物菌剂以及空白对照五个处理，各设3次重复，共15个小区， 随机排列。在棉苗2叶期，分别将实施例1制备得到的木霉菌剂、实施例2和对比例1制备 得到的复合菌剂与灭菌细土充分混合，使细土中活菌数含量达到2X10 6CFU/g，同处理，每 平方米IOOg细土均匀施入棉田，以同等重量硅藻土进行相同掺土处理作为对照。田间管理 常规。在盛蕾期调查棉花黄萎病发病情况。棉花黄萎病病情分为5个级别，棉叶发病严重度 按受害枯黄面积占整个叶片面积百分数不同分为5级，S卩：正常（b0) :0% ;轻度（bl) :0? 25% ;中度（b2) :25%?50% ;严重（b3) :50%?75% ;极严重（b4) :75%?100%。病情 指数=Σ (发病级别代表值X该级的株数）八发病最重级别代表值X总株数）X 100 ;防 治效果=(对照病情指数-处理情指数）/对照病情指数X100%。结果如表1所示。
[0056] 表 1
[0057]
【权利要求】
1. 一种木霉菌，其特征在于：该木霉菌为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)， 其保藏编号为CGMCC No. 9727。
2. -种复合微生物菌剂，其特征在于：所述的复合微生物菌剂活性成分含有权利要求 1所述的木霉菌、商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus)和商品号为 ACCC 01174 的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis)。
3. 根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于：相对于lg的微生物菌剂，所 述木霉菌的含量为105-109CFU，优选为106-108CFU。
4. 根据权利要求2或3所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述木霉菌、所述蜡状芽 胞杆菌和所述摩加夫芽胞杆菌的CFU比为1 : (10-20) : (10-20)。
5. 根据权利要求2或3所述的复合微生物菌剂，其特征在于：该微生物菌剂通过包括 如下步骤的制备方法制备得到： (1) 将权利要求1所述的木霉菌、商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌和商品号为 ACCC 01174的摩加夫芽胞杆菌菌种分别在活化培养基中接种并培养得到各自的活化菌 种； (2) 将木霉菌的活化菌种在木霉菌液体发酵培养基中培养，将蜡状芽胞杆菌和摩加夫 芽胞杆菌各自的活化菌种分别接种到液体培养基中并进行发酵，得到各自的发酵后的菌 液； (3) 将步骤（2)得到的三种菌液分别经惰性载体吸附、烘干和粉碎，得到各个菌种的菌 粉； (4) 将木霉菌、蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆菌的菌粉混合，得到复合微生物菌剂。
6. 根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于：惰性载体的用量使得木霉菌 菌粉中活菌含量达到（2-5) X108CFU/g，蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆菌的菌粉中活菌含 量达到（5-10) X109CFU/g，将木霉菌、蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽胞杆菌的菌粉混合；使得所 述木霉菌、所述枯草芽胞杆菌和所述解淀粉芽胞杆菌的CFU比为1 : (10-20) : (10-20)。
7. 根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述惰性载体包括碳酸钙、黄 土、硅藻土、膨润土、滑石粉、云母粉、高岭土和方解石粉中的至少一种。
8. 根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于：以所述木霉菌液体发酵培养 基的总重量为基准，以重量计，所述木霉菌液体发酵培养基含有2. 0-3. 5%淀粉、1. 0-2. 0% 酵母粉、4. 0-8. 0 % 玉米浆、0? 1-0. 5 % 的 CaC03、0. 01-0. 02 % 的 ZnSOjP 0? 01-0. 03 % 的 MgS04〇
9. 根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于，以蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽 胞杆菌发酵所用的液体发酵培养基的总重量为基准，以重量计，蜡状芽胞杆菌和摩加夫芽 胞杆菌发酵所用的液体发酵培养基含有1-1. 5%玉米淀粉、1. 0-1. 5%花生饼粉、0. 2-0. 5% 硫酸铵、0. 1-0. 4%碳酸钙、0. 02-0. 05 %硫酸镁和0. 01-0. 05 %氯化钠。
10. 权利要求1所述的木霉菌或权利要求2-9中任意一项所述的微生物菌剂在棉花黄 萎病防治中的用途。
【文档编号】C12R1/07GK104480023SQ201410743008
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】李梅, 蒋细良, 刘政, 孙艳 申请人:中国农业科学院植物保护研究所