70%酒精洗沉淀1次并将沉淀转运至一新的离 心管中；
[0064] (7) 12000rpm离心20min，弃乙醇溶液，沉淀抽干20min;
[0065] (8)加 200u 1无 RNas e的水溶解沉淀，加 1倍体积的水饱和酚/氯仿=1:1充分混匀， 静置5min;
[0066] (9)12000rpm离心20min，将上清转运至另一新的离心管中，再加 1倍体积的水饱和 酚/氯仿=1:1重复抽提一次；
[0067] (10)12000rpm离心20min，上清加 1倍体积的氯仿抽提一次；
[0068] (ll)12000rpm离心20min，上清加 1/2体积8M LiCl溶液，冰浴过夜（12h以上）；
[0069] (12)12000印111离心2〇111；[11，沉淀用70%酒精洗一次。抽干后溶于100_200ul无 RNase 的水中。取2ul检测质量。
[0070] 2.CDNA 的合成
[0071 ]将提取的RNA用DNasel 37°C纯化处理30min后备用。用TransScript Reverse Transcriptase试剂盒(Transgen公司）合成第一链cDNA。体系如下： RNA 模板 6_:0μ1_ 引.物(500μΓηοΙμ1<4) Ι.ΟμL dNTPilOmmo^L1) Ι.ΟμL
[0072] 5xRT buffer 4.0μL Ribonuclease inhibitor(RI) 0.5μΙ_ Transcript RT Ι,ΟμL DEPCddH20 补至 20.0μΙ_
[0073] 421€4511^11，851€511^11。于-20。(：保存。
[0074] LRK1 基因，其序列为SEQ ID N0.1:
[0075] ATGCTGAAATTAATCTCGATTCTGTTGCTATTAATCTCGATTTCATCAATTTCAGTTGAATCAAGGTGCAGCAGAGG CTGTGACTTGGCTTTAGCATCGTACTACGTTTGGCAAGGATCAAACTTGACCTTCATATCTCAGATTCTTAACTCAA GCCTCGTACCGTACTCAACTACTAATTTCGATTCGATCCTTGCTTATAACCCACAAGTTGCGAACAAAGACAGTGTC GAAGCTTTTAGCAGGCTTAACATCCCTTTCCCTTGTGATTGCATCAATAACGATTTCCTTGGCCATGTTTTCACCTA CTCGGTTCAACCGGGCGATACTTACGATAAAATCGCTGGTTATTATTCCGATTTGACGACGGTTGCTTGGTTGCGGC CGTTTAATAGCTATCCTGAGACCAATATACCCGATAGTGGGGTGGTTAATGTGGTGGTCAATTGTTCGTGTGGAGAT TCTGCTATTTCCAAGGATTACGGTTTGTTTGTTACGTATCCGCTCCGGGAAAATGAGACTTTGGATACTGTGTTGAC TCAGGCGAATTTGTCATCGGATTTATCGGGGTTGGTGCGGCTTTACAACCCGGGGGCAAATTTCAGCTCAGGGTCTG GCTTGGTGTATATTCCGGGACGAGATGCTGAAAATAGTTTTCGTCCCCTCAAATCAAGCAAAGGAATTTCAGGTGGA GTTATCGCCGGGATAGCTATAGCAGCCGTAGTGGTATCACTATTGCTGGCATTTGGTATTTATGCTAAATTTTTCCG AAAGAAGTCAAAGACAACATCATTGCTTTCGACGGTTTCCCATGACGTATCGGCTGAAGCTGGGAATGTTTTTGGAA GCAAAGCAGCAGAATCAACTGGAACTGTTGCTGCTTCTCCCGGCCTTACCGGCATTACTGTAGACAAATCAGTTGAG TTCTCATATGAAGAACTTGCCCAAGCGACTGATTATTTCAGTATGGCTAACAAGATTGGTGAAGGTGGCTTCGGGGC TGTTTACTATGCAAATTTGAGAGGCGAGGAAGCTGCAATCAAGAAGATGGATATGCAGGCATCCAAAGAATTTCTGG CTGAATTGAAGGTTTTGACACGTGTTCATCACCTGAACCTGGTGCGTTTAATTGGATACTGTGTTGAAGGCTCTCTT TTCCTAGTTTACGAATACATCGAGAATGGCAATCTAAGCCAGCATTTGCGAGGATCAAGCAGGGAGCCACTTCCTTG GTCTACTCGCGTGCAAATTGCCCTTGACTCAGCCAGAGGTCTTGAATATATCCATGAGCATACGGTCCCTGTTTACA TTCACCGTGACATTAAATCAGCTAATATATTGATAGACAAAAAGTTCCGTGCGAAGGTTGCCGATTTTGGATTAACG AAACTGACAGAAGTCGGAAGTGCATCACTACCCACACGTCTTGTTGGGACATTTGGATACATGCCACCAGAATATGC TCAATATGGTGATGTTTCTCCTAAAATAGATGTATATGCCTTCGGGGTTGTGCTCTATGAGCTTATTTCCGCTAAAG AAGCTATTGTCAAGGCAAATGGTTCTCTCGCTGAATCAAAAGGTCTTGTTGCCCTGTTTGACGATGCTCTTGATGAG CCTGATCCTAAAGAAGGCCTTTGCAGACTTATCGATGCAAGGCTCGGAGATAATTACCCACTAGACGCTGTATTCAA GATGGCTCAGCTTGCGAAAGCATGCACAAAAGAAAATCCTCAGCTACGACCGAGTATGAGATCCATAGTAGTTGCTT TAATGACCCTTTCATCGTCAACAGAGGATTGGGATGTTGGTTCTTTCTATGAAAATCAAGCTCTCGTCAACCTTATG TCCGGAAGATAAo
【主权项】
1. 赋予植物黄萎病抗性的LRK1基因，其序列为SEQ ID NO.l。2. 权利要求1所述LRK1基因的应用。3. 权利要求1所述LRK1基因的在赋予植物黄萎病抗性中的应用。4. 权利要求1所述LRK1基因的在赋予拟南芥植物黄萎病抗性中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，包括： 1. LRK1基因的克隆以及植物表达载体的构建 以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物 PI:5 '-TGCTCTAGAATGCTGAAATTAATCTCGATTC-3 '， P2:5 '-CGCGGATCCTTATCTTCCGGACATAAGGT-3 ' 扩增得到1860bp片段，将该片段命名为LRK1，PCR产物纯化后用Xbal/BamHI酶切，连接 到pCambia2301载体，测序后成功构建的质粒命名为pCambia2301 :LRK1; 2) 转基因植株的获得 将步骤1)中构建好的pCambia2301: LRK1质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，用蘸花法 转化拟南芥，当代的拟南芥植株为T0代，收获的种子为T1代； T1代种子在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植株，分 别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达； 用引物 P3:5 '-CTGGGAATGTTTTTGGAAG-3 ' P4:5，-ACTCGGTCGTAGCTGAGGA-3 ' 扩增获得920bp大小片段的T1植株则为成功转化LRK1的阳性转基因植株。6. 权利要求5所述应用中构建的重组载体pCambia2301 :LRK1。
【专利摘要】本发明涉及赋予植物黄萎病抗性的<i>LRK1</i>基因及应用，属于生物技术领域。<i>LRK1</i>基因是从陆地棉品种奥3503品种中获得的一个表面受体蛋白基因，<i>LRK1</i>完整编码框长度为1860个碱基，编码蛋白含619个氨基酸，分子量为67.3KD，等电点为5.4。<i>LRK1</i>转基因拟南芥对落叶型黄萎病菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗病性明显增强，转基因拟南芥发病率均低于10%，而对照野生型发病率达50%以上。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29, C12N15/84
【公开号】CN105567703
【申请号】CN201610111963
【发明人】刘廷利, 顾周航, 周雪平, 张保龙, 杨郁文, 陈天子, 凌溪铁, 王金彦
【申请人】江苏省农业科学院, 浙江理工大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月29日