专利名称：：由烟曲霉产生的一种新的几丁质酶的制作方法几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的第二大碳源，在开发利用纤维素、几丁质的研究上，人类已作出了巨大的努力，虽然取得了一些进展，但仍未能真正有效利用。几丁质不仅是可资利用的丰富碳源，而且在生物体内及生物间相互作用中担负着重要功能。在真菌中是细胞壁成分、在无脊椎动物中构成外骨骼，这些生物本身又都产生几丁质酶，酶对几丁质的降解又在形态发生和营养摄取方面有重要生理意义；在植物与病原性真菌及害虫的相互作用中几丁质也扮演了非常重要的角色，如在植物的抗病机制中，植物在受到微生物感染或诱发物(elicitor)处理后就会合成并积累抗微生物的植物防御素(phytoalexins)。真菌的细胞壁和无脊椎动物的外骨骼中所含结构组分几丁质和脱乙酰几丁质(chitosan)被几丁质酶降解成寡糖片断后能在多种植物中诱发抗病反应。近年来又发现脱乙酰几丁寡糖具有抗肿瘤、抗高血压、抗乳腺炎、降低胆固醇、治疗化脓性外伤、关节炎止痛等方面都有明显疗效。因此脱乙酰几丁寡糖可作为功能性寡糖产品用于医药临床、功效食品、外伤、止痛等，对脱乙酰几丁寡糖的研究也因此受到各国学者关注。脱乙酰几丁寡糖是由几丁质酶将脱乙酰几丁质水解而来的，功能性脱乙酰几丁寡糖的聚合度为2-10。目前是控制酶反应条件来得到有合适聚合度的降解产物，但在实际应用中却非常难以控制条件产生具生物活性的寡糖片断。多种几丁质酶已从不同生物中分离研究。真菌几丁质酶在真菌的形态发生和营养摄取方面有着重要的生理功能，此外，真菌几丁质酶还可应用于生物防治含几丁质的害虫及开发利用几丁质。近年来已从真菌中分离并研究了几种几丁质酶，这些酶主要是从寄生性真菌和昆虫致病真菌中分离的，一些腐生性的曲霉也能非常有效地降解几丁质。然而，对曲霉产生的几丁质酶的结构及性质却知之甚少。从已报道的几种真菌几丁质酶看，未发现有转糖基活性的酶，而且在所有不同生物种来源的几丁质酶的研究中也仅发现一个来源于细菌的外切几丁质酶具有转糖基活性，未见有内切几丁质酶具转糖基活性的报道。本发明的目的在于从真菌资源中寻找具转糖基活性的内切几丁质酶以及产生这种酶的微生物。我们从土壤中分离到Aspergillusfumigatus具有产生几丁质酶的能力，其中一株AspergillusfumigatusYJ-407最好，该菌保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，登记入册编号为CGMCCNO.0386。并由该菌株的发酵液中纯化了一种新内切几丁质酶chiM，该酶可将几丁质水解为几丁二糖和几丁三糖，此外，还有显著的转糖基活性，可将几丁二糖转到几丁三糖上形成几丁五糖。该性质可用于生物活性几丁寡糖的酶促制备。本发明为开发生物活性几丁寡糖应用于临床治疗提供了可能。实现本发明的具体技术方案为1.AspergillusfumigatusYJ-407的培养方法AspergillusfumigatusYJ-407保存在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上。土豆葡萄糖琼脂培养基的组成份为土豆200克加水1升，煮沸10分钟后纱布过泸，在泸液中加入葡萄糖20克，琼脂20克，在本培养基中不添加琼脂，可作为土豆葡萄糖液体培养基。用0.1％Tween-20将孢子收集后接种于装有200ml土豆葡萄糖培养基的500ml三角瓶中(接种量为5×106孢子/ml)，在摇床上以200r/min的转速，35℃培养24小时。培养后过滤收集菌丝体，并以无菌水冲洗后悬浮在200ml几丁质酶发酵培养基中几丁质发酵培养基的组份为细粉几丁质1％，蛋白胨0.05％，酵母膏0.05％，葡萄糖0.1％，KH2PO40.07％，K2HPO40.07％，MgSO4·7H2O0.05％，FeSO4·7H2O0.001％，ZnSO40.0001％，pH5.0，于32℃培养96小时后离心收集发酵上清液用于酶的纯化。2.AspergillusfumigatusYJ-407几丁质酶chiM粗酶的制备酶的纯化在4℃下进行。1升发酵上清液用中空纤维柱超滤浓缩，中空纤维柱超滤的排阻分子量可以在5000-20000范围内，一般采用的排阻分子量在10000左右为宜。经超滤浓缩后可以加入30％-70％饱和度的硫酸铵沉淀蛋白，收集30％-60％饱和度的沉淀蛋白并溶于去离子水中，然后在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中透析即为粗酶样品。3.AspergillusfumigatusYJ-407几丁质酶chiM的DEAE-52柱纯化粗酶以50mMTris-HCl(pH8.0)预平衡的DEAE-52柱(3×30cm)纯化。以600ml梯度为0.15-0.5MNaCl作线性洗脱(流速为15ml/h)，收集含几丁质酶chiM活性的部分，浓缩后对50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液透析。4.AspergillusfumigatusYJ-407几丁质酶chiM的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化透析的酶(2mg)用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳(100×120×30mm，7.5％gel，pH8.9)纯化，几丁质酶chiM在电泳胶上的迁移率Rf为0.43，将几丁质酶chiM带从胶上切下，用50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)将酶洗脱出来，洗脱液在去离子水中透析，最后，将酶液冻干保存于-20℃。用制备型高压液相色谱进行酶的最后纯化也可得到相同的结果。5.酶活测定方法在含0.4ml0.5％胶体几丁质和0.5ml100mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)的反应体系中加入100μl几丁质酶液，60℃反应15分钟，在沸水浴中煮沸5分钟终止反应。测定反应混合物中的还原糖含量。几丁质酶的酶活定义为在上述条件下每分钟催化产生相当于1μmolN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为1个单位。6.蛋白测定方法蛋白浓度的测定按Lowry法测定。7.电泳5％和12％聚丙烯酰胺电泳按Davis的方法进行，SDS-PAGE电泳按Laemmli的方法进行，IEF-SDS-2-D电泳按Hames等的方法进行。8.其它分析方法N-端氨基酸序列用477AProteinSequencer(ABI)测定，氨基酸组分用Beckman121MBAminoAcidAnalyzer分析。酶反应产物用硅胶薄层层析分析，展开剂为正丁醇∶醋酸∶水(2∶1∶1)。实施例用0.1％Tween-20将保存在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上AspergillusfumigatusYJ-407孢子收集后接种于装有200ml土豆葡萄糖培养基的500ml三角瓶中(接种量为5×106孢子/ml)，在摇床上以200r/min的转速，35℃培养24小时。培养后过滤收集菌丝体，并以无菌水冲洗后悬浮在200ml几丁质酶发酵培养基中，于32℃培养96小时后离心收集发酵上清液用于酶的纯化。酶的纯化在4℃下进行。将1升发酵上清液用中空纤维柱超滤浓缩，中空纤维柱超滤的排阻分子量为6000。经超滤浓缩后加入硫酸铵沉淀蛋白，收集30％-60％饱和度的沉淀蛋白并溶于去离子水中，然后在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中透析即为粗酶样品。粗酶以50mMTris-HCl(pH8.0)预平衡的DEAE-52柱(3×30cm)纯化。以600ml梯度为0.15-0.5MNaCl作线性洗脱(流速为15ml/h)，收集含几丁质酶chiM活性的部分，浓缩后对50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液透析。透析的酶(2mg)用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳(100×120×30mm，7.5％gel，pH8.9)纯化，几丁质酶chiM在电泳胶上的迁移率Rf为0.43，将几丁质酶chiM带从胶上切下，用50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)将酶洗脱出来，洗脱液在去离子水中透析，最后，将酶液冻干保存于-20℃。用制备型高压液相色谱进行酶的最后纯化也可得到相同结果。按上述步骤，从AspergillusfumigatusYJ-407中纯化几丁质酶chiM，得到PAGE和IEF-SDS-2D电泳均一的纯酶。从AspergillusfumigatusYJ-407纯化的几丁质酶chiM具有如下特征纯酶分子量为46KDa，等电点为pH5.6。酶在278nm波长和252nm波长分别表现出最大和最小吸收的典型吸收光谱，最大荧光激发波长为342nm。酶蛋白N-末端氨基酸序列为A-S-S-G-Y-R-S-V-V-Y-F-V。酶的最适pH为5.0，酶在pH4.0-7.0的范围内稳定，其中pH为5.0时最稳定。酶的最适反应温度为60℃；将酶溶于50mM醋酸缓冲液(pH5.0)中，在不同温度下保温30分钟后测定酶活，结果显示酶在低于45℃时稳定，在温度为65℃时酶完全失活。Fe2+，Zn2+，Mn2+，Ag+，pb2+，Hg2+强烈抑制酶活，同时，EDTA对酶活无影响。该酶对6-O-羟乙烷基几丁质和脱乙酰几丁质(80％deacylated)的水解能力高于对几丁质粉和胶体几丁质，提示酶水解这些底物能力的差异在于底物溶解度的不同。该酶不作用于纤维素及CMC纤维素，因此，该酶是特异水解直线型多聚N-乙酰氨基葡萄糖的几丁质酶。酶水解胶体几丁质的Km值为0.9mg/ml。羧基和色氨酸残基是酶活所必需的，而巯基和组氨酸残基对酶活性中心的贡献较小。在含0.5ml100mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)的反应体系中加入胶体几丁质和几丁质酶液，60℃反应15分钟，在沸水浴中煮沸5分钟终止反应。用硅胶薄板层析分析其产物，结果表明该酶可将胶体几丁质水解成为几丁二糖、几丁三糖和N-乙酰氨基葡萄糖，其中几丁二糖为主要降解产物。在含0.5ml100mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)的反应体系中加入几丁三糖和几丁质酶液，60℃保温过夜后，可产生几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖。在含0.5ml100mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)的反应体系中加入几丁六糖和几丁质酶液，60℃反应，可在1小时内产生从几丁二糖到几丁五糖的产物。文献查新检索结果1.FrosterAB，andWebberJ.(1960)Chitin，Adv.Carbohydr.Chem.，15，371.2.Ruiz-HerreraJ，eds.(1991)FungalcellwallStucture，synthesis，andassembly.BocaratonCRCPress，89.3.Ruiz-HerreraJ，eds.(1991)FungalcellwallStucture，synthesis，andassembly.BocaratonCRCPress，91.4.Deshpande，MV.(1986)Enzymaticdegradationofchitinanditsbiologicalapplication.，J.Sci.ndustr.Res，45，273-281.5.JeuniauxC.(1971)inComphrehensivebiochemistry.editedbyFlorkinMandStotzFH，ElsevierPublishingCo，Amsterdam，595.6.MuzarelliRAA，(1977)Chitin.PergamonPress，Oxford，.7.Calvo-MendezCandRuiz-HerreraJ.(1987)BiosynthesisofchitosaninmembranefractionsfromMucorrouxiibytheconcertedactionofchitinsynthetaseandaparticulatedeacetylase.，Exp.Mycol.，11，128.8.BadeML，StinsonA，andMoneamN(1988)Chitinstructureandchitinaseactivityisolationofstructurallyintactchitins.ConnectiveTissueRes17，137-151.9.FlachJ，PiletP.-E，JollesP.(1992)Whatisnewinchitinaseresearch？Experientia，48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