稻瘟病抗性基因Pi1及其应用的制作方法

专利名称：稻瘟病抗性基因Pi1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pil的克隆及 其应用。
背景技术：
植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略 以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物 的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，对抗 病基因产物结构进行分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于其病害的预防和控制 也具有重要的指导意义。迄今为止，已经从植物中分离了 80多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和 产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所对应的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差 异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列 (leucine-rich repeat, LRR), N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper, LZ)，卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC)，跨膜结构域 (transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蝇 Toll 蛋白及哺乳 动物白介素-1受体(Toll andinterleukin-1 receptor,TIR)等。根据它们所编码蛋白的 结构特征，可将抗病基因分为 7 类(Hammond-Kosack & Jones，1997 ；Dangl & Jones 2001 ； Iyer McCouch 2004)。第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hml，它是第1个被克隆的植物 抗病基因，它控制对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hml编码的解毒酶能钝化 病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C. carbonum小种1产生的致病因子，它决定该 病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。它们编 码的蛋白近N端为NBS,而近C端则由LRR组成。如RPS2 (Bent et al.，1994) ,RPMl (Grant etal.，1995)、12(Simon et al.，1998) ；RPP5 (Parker et al.，1997)、N(Doddet al.,2001)> L6(Lawrence et al.，1995)、Mlal(Zhou et al.，2001)、Mla6(Halterman et al. ,2001) ；/K 稻的抗病基因如 Xal (Yoshimura et al.，1998)、Pib (Wang et al.，1999)、Pita (Bryan et al.，2000)等。第三类，PK类抗病基因。如番茄Pto基因，其产物是一种位于细胞内的丝氨 酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martin et al.，1993)。第四类，LRR-TM类抗病基 因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2 (Dixon et al.，1996)、Cf_4 (Thomas et al.， 1997)、Cf-5 (Dixon et al.，1998)、Cf-9 (Jones et al.，1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基 因Hslpra-1 (Cai et al. , 1997)等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因 Xa2KSong et al. , 1995)为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有 完整的CC和NBS结构域(Xiao et al.，2001)。第七类，以水稻的xa5基因为代表，其编码 的蛋白为一个转录因子(TFIIAy) (Iyer& McCouch，2004)。编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR和 CC-NBS-LRR(Meyers et al. ,2002 ；Pan et al. ,2000 ；Cannon et al. ,2002 ；Richly et al.，2002)。TIR-NBS-LRR类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没有在单子叶植物 基因组中发现(Bai et al. ,2002 ；Meyerset al.，2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的 抗病基因主要编码CC-NBS-LRR类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CC-NBS-LRR类抗 病基因，相对而言，单子叶植物中的CC-NBS-LRR类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样 (Cannon et al.，2002)o研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack&Jones 1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有结 合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反 应下游的信号传导(Jones et al.，1994)。最近的证据表明，亚麻的L族多样性选择也发生 在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck et al.，2000)。LRR结 构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones & Jones，1996 ；Kajava et al.，1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互 作用的部位(Bent，1996 ;Baker et al.，1997)。Jia et al. (2000)通过酵母双杂交证明 AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小种特异性的激发子， 传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita介导的防卫 反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita176不能与LRD结合，因而表现感病。这一结 果直接证明了 LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作第一次从分 子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病 原真菌Magnapothe oryzae (无性态=Pyricularia oryzae)引起的稻癌病是对水稻生产危 害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观 点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体 的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的了 解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品 种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应 用于抗病育种计划中，已成为农业科研中优先解决的重要问题。随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经 被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟 病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的 染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。目前， 在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式报道的已有13个抗性基因，Pib (Wang et al., 1999), Pita (Bryan et al. ,2000), Pi9 (Qu et al.，2006)，Pid2(Chen et al.,2006), Piz-t 和 Pi2(Zhou et al.，2006b)，Pi36 (Liu et al.，2007a)，Pi37 (Lin et al. ,2007), Pik-m(Ashikawa et al.，2008)，Pit (Hayashi et al.，2009)，Pi5 (Lee et al. ,2009), Pid3(Shang et al.，2009)和pi21 (Fukuoka et al. ,2009) 克隆抗病基因是对水稻抗性机理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理 可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因进行修饰和改造，可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和 改良技术所不能达到的。

发明内容
本发明的目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的 DNA片段。本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。本发明的另 一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。本发明的另一个目的是提供上述载体的宿 主细胞。本发明的另一个目的是提供上述基因在制备转基因植物中的应用。本发明的进一 步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的 应用。本发明从水稻品种C101LAC中分离得到Pil基因，包括2个编码NBS-LRR类蛋 白的基因Pil-I和Pil-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示，它们分别 编码SEQ ID NO. 3以及SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，结构如图6和图7所示。它们 的蛋白都包含2个主要的结构域NBS和LRR区域，其中Pil-I NBS结构域含有保守的 kinase la :GLPGGGKTTVAR, kinase2 =NKKYLIVIDDIff, kinase3a=DLGGRIIMTTRLNSI, GLPL EDSPCYDIV 匪 CYGMPLALI ；Pil-2 NBS 结构域含有保守的 kinase la :VLSIVGFGGVGKTTIA, kinase2 =LEQLLAEKSYILLIDDIff, kinase3a=GGRIIVTTRFQAV, GLPL :EQVPEEIWKICGGLPLAIV, RNBS-D :CLLYLSIFPKGWK,MHDV :KTFQVHDMVLEH。而 Pi 1-1 蛋白的 C-末端为 16 个不完整的 LRR重复，其亮氨酸含量为14. 0 % (图6) ；Pi 1-2蛋白的C-末端为13个不完整的LRR重 复，其亮氨酸含量为17.0% (图7)。应当理解，在不影响蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员 可对SEQ ID NO. 3或SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或 几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编 码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码 上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替 换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。 本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的 克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的 植物细胞和转基因植物。本发明同样包括将Pil抗性基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列 所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。这种基因可 以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启 动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜 花叶病毒的35S启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或 发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启 动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达。同样地，也可以将该 基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境 条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。本发明还进一步克隆得到所述基因的启动子，包含调控该基因的启动子的DNA片段分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。根据本发明提供的Pil基因序列信息(SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，本领域技 术人员可以通过以下方法容易地获得与Pil等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2) 以Pil基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pil 基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和 cDNA中获取；(4)在Pil基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方 法获得该基因。本发明提供的稻瘟病抗性基因Pil具有重要的应用价值，其赋予植物对稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。其适用于对所有对该病原菌 敏感的植物，这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。应用之一是将所述的Pil基因序列 连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将Pil抗病基因导入水稻或其他植物 细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到 植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列作适当的修饰，也可以在其转录起始密码 子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分 子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切 酶长度多态)、CAPS (切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型， 用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。本发明具有明显的优点和效果。将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生 新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种 技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克 隆是克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。本发明能够进一步提供或应用基于上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相 应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种 子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株中。


图1.水稻稻瘟病抗性基因Pil的图位克隆技术路线图。图2. Pil与Pik簇等位基因对8个稻瘟病菌群体抗谱的比较。图中纵坐标为抗性 频率，横坐标为8个稻瘟病菌群体(⑶，广东；FJ，福建；HN，湖南；YN，云南；GZ，贵州；SC,四 川；JS，江苏；LN，辽宁；几，吉林；HLJ，黑龙江)。5个Pik簇等位基因(C101LAC，Pil ；C039, pil ；K60, Pik-p ；Kusabue, Pik ；Tsuyuake, Pik-m)。由此可以看出，Pil 对除了辽宁和吉林 之外的8个稻瘟病菌群体表现高度的抗性。图3A. Pil基因位点的连锁标记图。横线上面的数字为标记之间的遗传距离[用 厘摩(cM)表示]；括号内的数字为该标记检测出的重组体/配子体。图3B. Pil基因位点在日本晴类型基因组上存在的具有NBS-LRR保守结构的6个 抗病候选基因。图3C.Pil基因位点在CIOILAC/Tsuyuake类型基因组上存在的具有抗病保守结构 的6个候选基因，其中2个编码典型的NBS-LRR蛋白。由此可以看出，在Pil基因位点存
6在两种类型的基因组，彼此之间存在很大的缺失/插入；Pil基因有6个候选基因(Pil-1， Pil-2, Pil-3, Pil-4, Pil-5, Pi 1-6)。图4.水稻稻瘟病抗性基因Pil (由Pil-I和Pil-2组成)之遗传互补Ttl植株的 抗性鉴定实物图。图中实线箭头所指的是抗病植株，虚线箭头所指的是感病植株，说明抗性 基因Pil由Pil-I和Pil-2组成表现出抗病功能。图5.水稻稻瘟病抗性基因Pil遗传互补的部分Ttl转化体的选择标记HPT基因 的PCR检测图。图中由左至右，泳道1及泳道15 分子量标记DL2000 ；泳道2 :Pil克隆 (Vector)，阳性对照；泳道3 受体品种Q1063,阴性对照；泳道4 =H2O,阴性对照；泳道5-14 T0转化体。结果表明，所有抗病的转化体都检测到了选择标记HPT基因的PCR扩增产物，而 感病的转化体则没有检测到，说明抗病的转化体是由于转化构建体已经整合到了高感的受 体品种中获得了表达而恢复了抗性。R 高抗；MR 中抗；MS 中感；S 感病。图6A.水稻稻瘟病抗性基因Pil之组成基因Pil-I的基因结构图。图中带斜线方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外显子；线条表示内含子；该基 因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及各个区域的大小(bp)亦标示于其中。图6B.水稻稻瘟病抗性基因Pil之组成基因Pil-I编码的氨基酸多肽序列及结构 图。图中CC结构域中的斜体字表示形成CC motif的氨基酸，NBS区域带下划线的黑体 字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域；带下 划线的黑体字表示形成LRR区域的xLDL保守基序；LRR区域后面还带有一段CNL (C端非LRR 区域)氨基酸序列。双下线标示的氨基酸序列为Pil特异的氨基酸替换[substitution，与 Pik 簇的其它等位基因(Pik，Pik-s, Pik-p, Pik-h，Pik-m)相比]。图7A.水稻稻瘟病抗性基因Pil之另一组成基因Pil-2的基因结构图。图中带斜线方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外显子；线条表示内含子；该基 因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及各个区域的大小(bp)亦标示于其中。图7B.水稻稻瘟病抗性基因Pil之另一组成基因Pil-2编码的氨基酸多肽序列及 结构图。图中CC结构域中的色斜体字表示形成CC结构的氨基酸，NBS区域带下划线的黑体 字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域；带下 划线的黑体字表示形成LRR区域的xLDL保守基序。双下线标示的1个氨基酸序列为等位 基因特异的氨基酸替换(substitution，与Pik簇的等位基因(Pik, Pik-s, Pik-p, Pik-h, Pik-m)相比)。图8.水稻稻瘟病抗性基因Pil表达特性的定量RT-PCR检测图。左图为组成基因 Pil-I在不同的接种时间点(0h，12h，24h，72h，120h)的相对表达水平。由此可以看出，该基 因在12h和24表达水平较高，72h最低；总体表达水平比Pil-2的低。右图为另一个组成 基因Pil-2在不同的接种时间点的相对表达水平。由此可以看出，该基因的表达水平逐步 上调，于72h最低，然后又上调。2个组成基因都表现为组成型表达，因为接种之前和之后都 能检测到2个基因的表达。图9.利用水稻稻瘟病抗性基因Pil特异性分子标记的基因型鉴定图。由此可以 看出，利用该分子标记可以把抗性品种C101LAC的基因型(Pil/Pil)；感病品种Q1063的基 因型(pil/pil)；含有与Pil等位的抗性品种Tsuyuake的基因型(Pik-m/Pik_m)；抗性品种K3的基因型(Pik-h/Pik-h)；抗性品种Kusabue的基因型(Pik/Pik)；抗性品种K60的基因 型(Pikp/Pikp)；以及以感病品种Q1063为受体的Ttl转化子的基因型鉴别出来。图中，R: 高抗；S 感病。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在 本发明的实施例部分，我们阐述了 Pil基因的分离过程(图1)和该基因的特点，分离的Pil 基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。实施例1抗性基因Pil的抗性特征首先，为了比较和明确在Pil位点上5个等位基因(Pi 1，Pik-p, Pik, Pik_m，pil) 的抗谱，利用从广东(GD, 60个菌株)，福建(FJ，40个)，湖南(HN, 40个)，云南(YN, 43个)， 贵州(GZ，60个)，四川(SC，66个)，江苏(JS，72个)，辽宁(LN，108个)，吉林(几，60个)，黑 龙江(HLJ，63个)，收集的总计612个菌株对上述5个等位基因所持品种(分别是C101LAC， K60，Kusabue,Tsuyuake和C039)进行了抗谱比较分析。结果表明，Pil对除了辽宁和吉林的 8个稻瘟病菌群体表现高度的抗性。由此说明该基因可在上述地区使用。水稻品种C101LAC 禾口 C039 己在文■ (Inukai et al. Allelism of blastresistance genes in near-isogenic lines of rice. Phytopathology, 1994,84 1278-1283)中公开。其余水稻品种已在文献 (Wang et al. Characterization of riceblast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus. Phytopathology, 2009,99 900-905)中公开。实施例2水稻稻瘟病抗性基因Pil的定位及电子物理作图本发明对由籼稻抗病品种C101LAC与粳稻感病品种Kl的杂交组合由来的 F2群体，接种对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株CHL930 (Wang et al.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster andfine mapping of the Pik-p locus· Phytopathology，2009，99 :900_905) 。明，i亥
中抗病植株与感病植株的分离比符合3 1。由此推断，C101LAC所表现的抗性是由一对显 性基因控制的。因此，构建了由230个体组成的一个作图群体(相当于460个配子体)。前期的遗传分析表明Pil基因与Pik簇基因是紧密连锁的(Inukai et al. 1994， Phytopathology, 84 1278-1283)，而申请人所在的研究室已经对Pik_m基因进行了精细定 位(Li et al. 2007,Molecular Breeding，20 179-188)。因此，申请人利用 Li et al (2007) 开发的分子标记进行了连锁分析。结果表明，在标记K37和K28分别检测出了 5个和1个 重组体(图3)。为了缩小Pil位点的染色体区域并找到与之共分离的标记(没有重组体 的标记)，进一步在K37——K28区域内，从Li et al (2007)开发的标记中获得了 1个多态 性标记(K33)，并根据参考序列开发了 3个CRG标记(CRG11-5, CRGl 1-6, CRGl 1-7)并对上 述6个不同的重组体进行了连锁分析。结果表明，标记CRG11-7检测出了 3个重组体，K33， CRGl 1-5，CRGl 1-6与Pil位点表现完全的共分离。因此，Pil位点最终被界定于CRGl 1-7—— K28之间的区域内，其中3个标记与之完全共分离。为了构建Pil位点的电子物理图，把与之连锁的标记通过生物信息学方法着陆于水稻品种日本晴(Nipponbare)的参考序列上，并由此构建了该基因位点的重叠群。由参考 序列可以推测Pil位点被界定于侧翼标记CRGl 1-7和K28之间约500kb的范围内。实施例3水稻稻瘟病抗性基因Pil候选基因的注释及序列分析为了确定Pil的候选基因，申请人利用日本晴的参考序列，通过3种基因预测软 件 RiceGAAS (http //ricegaas. dna. affrc. go. jp)、Gramene (http //143. 48. 220. 116/ resources/)禾口 Softberry 的 FGENESH(http://www. softberry. com)对目的基因区域进行 了基因预测及注释分析，初步确定了 Pil的候选抗性基因为6个核苷酸结合位点和富亮氨 酸重复(nucleotidebinding site-leucine-rich repeat,NBS-LRR)的候选基因(Pil-IN， Ρ 1-2Ν, Ρ 1-3Ν, Ρ 1-4Ν, Pil_5N，和 Ρ 1-6Ν)。对6个候选基因进行基于基因特异性标记的存在/缺失(presence/absence， Ρ/Α)分析，结果表明，在日本晴参考序列存在的4个候选基因(Pil-ΙΝ，Ρ 1-2Ν, Ρ 1-3Ν 和 Ρ 1-4Ν)在 C101LAC 中是不存在的。根据 Ashikawa et al. (2008，Genetics, 180 2267-2276)所提供的信息，Pil目的基因区域包含了所插入的70kb序列，对新的目的基 因区域进行了基因预测及注释分析。结果表明，该区域预测到了 6个具有抗病结构的基因 (Pi 1-1，Pi 1-2，Pi 1-3，Pi 1-4，Pi 1-5 和 Pi 1-6)，其中 Pil-I 和 Pi 1-2 编码典型的 NBS-LRR 蛋白(图3)。然后，开发候选基因特异的SNP (单一核苷酸多态性)标记，对6个候选基因 进行了基因型分析。结果表明，除了 Pil-I和Pil-2之外，其余4个候选基因的SNP基因型 与抗病基因的基因型(Pil+或PiD不能完全对应(表1)。由此说明，Pil的候选抗性基因 只有Pil-I和Pil-2。这些结果说明，Pil与Pik簇基因是等位的(Ashikawaet al. 2008， Genetics，180 :2267-2276)，因此，下一步将参考 Ashikawa et al. (Genetics, 2008,180 2267-2276)的实验方案，直接将2个候选基因串联起来进行遗传互补实验，以确定其功能。表1基于Pil候选基因特异性SNP标记号的基因型分析
9 aPi I+表示含有Pi 1基因；Pi Γ表示不含有Pi 1基因。bI :Pil+类型的SNP基因型；2 :Pil_类型的SNP基因型；H 杂合的SNP基因型；- 缺失的SNP基因型；候选基因Pi 1-12的Pi 1基因型与SNP基因型完全一致，因此，推测只有 Pi 1-12为Pil的候选基因。实施例4水稻稻瘟病抗性基因Pil的遗传互补实验及转化子的抗性鉴定首先，利用高保真酶phusion结合长片段PCR(long-range PCR, LR-PCR)技术，以
10C101LAC 的总 DNA 为模板，根据或参考 Liu et al. (Genetics, 2007,176 2541-2549)和 Lin et al. (Genetics，2007，177 :1871-1880)描述的实验方法和程序，扩增、克隆了 Pil-Ι和 Pil-2。扩增、克隆Pil-I的引物为正向引物TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA；反向引物TTTTGGCGCGCCGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTC)扩增、克隆Pil-2的引物为正向引物TTTTGGCGCGCCGCAAGATCAGTACCATCACGAGTAATAGCA ；反向引物TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG)。然后，通过扩增的2个候选基因重叠区域合适的内切酶，将上述2个候选基因拼接 为一个完整的基因。最后，利用双元转化载体PCAMBIA1300进行遗传互补实验。结果获得 了功能互补的转化体，见表2和图4。利用转化载体中的潮霉素基因(HPT)标记对转化体进 行了 PCR检测。检测结果证明目的基因片段已经导入抗病转化体中，而没有导入感病转化 体中，见图5。表2. Pil基因的遗传互补实验 aT0植株接种了对Pil为非亲和性，而对受体品种为亲和性的菌株CHL346。R，抗 病；MR，中抗；MS，中感；S，感病。b 功能互补成功率(0A)为 R+MR/R+MR+MS+S*100。上述遗传互补的实验结果表明，抗性基因Pil与Pik簇的等位基因一样，由2个基 因Pil-I和Pil-2组成才能表现其功能。水稻品种Q1063以及生物材料载体pCAMBIA1300 已在文献(Lin et al. , The blast resistance gene Pi37encodes an NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on ricechromosome 1. Genetics,2007, 177 1871-1880)中公开。实施例5 Pil基因的结构采用移步法对Pil的DNA序列进行了测定。利用RACE技术，获得了 Pil的全长 cDNA序列并对其进行了测序。Pil基因DNA长度为17. 7kb (包含Pil-I和Pil_2)，其中， Pil-I的全长cDNA序列为3761bp，含有一个3432bp的开放读码框，5，和3，非翻译区分别 为IlObp和193bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有2个 内含子和3个外显子(图6A)。另一个组成基因Pil-2的全长cDNA为3652bp，含有一个 3066bp的开放读码框，5，和3，非翻译区分别为245bp和284bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有1个内含子和2个外显子(图7A)。实施例6 Pi 1抗性蛋白的结构Pil基因包含的2个组成基因编码的蛋白序列如序列表中Pil-I SEQ IDNo. 3 和Pil-2SEQ ID No.4所示。Pil-I基因编码1个由1143个氨基酸残基组成的蛋白多肽， 分子量为126.60KD，等电点为6.46。利用COIL分析表明该蛋白多肽有CC(coiled-coil) 结构域。Pil-I蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase Ia(GLPGGGKTTVAR) 位于该多肽的第290个氨基酸残基；kinase 2 (NKKYLIVIDDIff)位于该多肽的第376 个氨基酸残基；kinase3a(DLGGRIIMTTRLNSI)位于该多肽的第402个氨基酸残基， GLPL (EDSPCYDIVNMCYGMPLALI)位于该蛋白多肽461个氨基酸残基。而该蛋白的C-端的 610-960个氨基酸残基为16个不完整LRR重复，其亮氨酸含量为14. 0 %，其C末端还有个非 LRR结构(CNL)的氨基酸序列(图6B)。图中双下线标示的氨基酸序列为Pil基因特异的 氨基酸替换(substitution)，由此可以鉴别Pil基因与其他等位基因(Pik，Pik-m，Pik-p，) 的不同。Pil-2基因编码1个由1021个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为114. 57KD， 等电点为8. 64。利用COIL分析表明该蛋白多肽没有CC(COil-COil)结构域，但是利用更 为强大的预测工具Paircoil2分析发现有CC结构域。Pil_2蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS 结构域中保守的kinase Ia(GFGGVGKTTIA)位于该多肽的第211个氨基酸残基；kinase 2 (KSYILLIDDIff)位于该多肽的第330个氨基酸残基；kinase 3a (GGRIIVTTRFQAV)位于该多 肽的第358个氨基酸残基，GLPL (EQVPEEIWKICGGLPLAIV)位于该多肽的第415个氨基酸残 基，RNBS-D (CLLYLSIFPKGWK)位于该多肽的第488个氨基酸残基，MHDV (KTFQVHDMVLEYI)位 于该多肽的第553个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的610-960个氨基酸残基为13个不 完整LRR重复，其亮氨酸含量为17.0% (图7B)。实施例7 Pil基因的表达特性分析利用定量RT-PCR技术对Pil基因的表达模式进行了分析。在抗病品种C101LAC接 种后不同的时间点(0h，12h，24h，72h，120h)上采集叶片并提取其总RNA，利用反转录试剂 盒 superscript Reverse Transcriptase II 进行反转录 cDNA 第一条链的合成。RT-PCR 的引物为，RRT5F GAAGCTCTGATCAACGGTATTCC,RRT5R TCTTTGATCATCTTCGGGATACG ；RRT17F TGAACTTCCACGATTGGATCCAC,RRT17R :ACATGGTTCTTGAATACATCATGTC。实时定量RT-PCR 使用 CFX96Real_time PCR 检测系统和 SYBR Premix ExTaq 试剂 盒(宝生物公司)，操作按照试剂盒说明进行。图8(左)为组成基因Pil-I在不同的接种时 间点的相对表达水平。该基因在12h和24表达水平较高，72h最低；总体表达水平比Pil-2 的低。图8(右)为另一个组成基因Pikh-2在不同的接种时间点的相对表达水平。右图为 另一个组成基因Pil-2在不同的接种时间点的相对表达水平，由此可以看出，该基因的表 达水平逐步上调，于72h最低，然后又上调。此外，2个组成基因在接种对照(H2O)和病原菌 接种之间表现明显不同的诱导型表达。2个组成基因都表现为组成型表达，因为接种之前和 之后都能检测到2个基因的表达。图8左、右图纵坐标都为相对表达水平，横坐标都表示时
12间，单位为小时(h)，斜纹框图为对照(接种之前)，黑框图为接种对照(H2O),空白框图为病 原菌接种。实施例8转化Pil基因产生的抗性植株的应用将Pil基因克隆到植物转化载体pCAMBIA1300，导入农杆菌菌株EHA105中，用于转 化感病的水稻品种Q1063，获得了 177株转化植株，其中25株表现抗性反应，见表2和图4。 这说明可以用Pil基因转化水稻感病品种，经过自交、纯化选择等一系列育种程序之后，即 可产生抗病品种而应用于生产。实施例9 Pil基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用利用本发明提供的Pil基因序列信息可开发基因特异性的分子标记 (Pil-ISNP-F =CGC CGGTGACCTAAGAATCGA ；Pi 1-1SNP-R CCGTTATCTCCTTCACATC,扩增产物 用限制性内切酶Cla I进行酶切)，既可用于鉴别Pil基因与其他等位基因(Pik，Pik-h， Pik-p, Pik-m)的不同(条带位置不同)，也可在转基因植株中用于鉴定Pil位点上的各种 基因型，即Pil/pil和pil/pil的植株，这些信息可在分子标记辅助选择育种过程中加以应 用，以提高育种的目的性和效率(图8)。序列说明SEQ ID NO. 1 & 2 是 Pil-Ι 和 Pil_2 的核苷酸序列；SEQ ID NO. 3 & 4 是 SEQ ID NO. 1 & 2的编码产物；SEQ ID NO. 5 & 6是带有启动子的Pil-I和Pil_2核苷酸序列。SEQ ID NO. 7 & 8禾口 SEQ ID N0. 9 & 10是分别用来扩增Pil-Ι 和Pil_2 的引物对；SEQ ID NO. 11 & 12 禾口 SEQ ID N0. 13 & 14 分别是引物对 RRT5F、RRT5R 和 RRT17F、RRT17R ;SEQ ID NO. 15 & 16 是引物对 Pil-ISNP-F 和 Pil-ISNP-R ;SEQ ID Ν0· 17 26 分别是 Pil-I 的 kinase la、kinase2、kinase 3a、GLPL 序列以及 Pi 1-2 的 kinase la、kinase 2、kinase 3a> GLPL> RNBS-D、MHD 序列。
权利要求
一种水稻稻瘟病抗性基因Pi1，从水稻品种C101IAC中分离得到，包含基因Pi1 1和Pi1 2，Pi1 1的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，Pi1 2的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pil编码的蛋白，其特征在于所述基因Pil-I 编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；所述基因Pil-2编码的蛋白的氨基酸序列 如 SEQ ID NO 4 所示。
3.权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pil的cDNA序列。
4.一种表达盒，其特征在于所述表达盒由权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pil或 权利要求3所述cDNA与启动子构建。
5.一种表达载体，其特征在于所述表达载体含有权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因 Pil或权利要求3所述cDNA。
6.一种分子标记，其特征在于所述分子标记由权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因 Pil产生。
7.权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pil在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pil在提高水稻抗稻瘟病中的应用。
9.权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pil的应用，其特征在于所述水稻稻瘟病抗性 基因Pil产生分子标记，用于水稻抗稻瘟病的辅助育种。
全文摘要
本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Pi1的克隆及其应用。本发明水稻稻瘟病抗性基因Pi1包含基因Pi1-1或Pi1-2，或者为Pi1-1和Pi1-2的串联序列，Pi1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，Pi1-2的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，串联序列的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。2个基因Pi1-1和Pi1-2都属于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成员，且皆为组成型表达的基因。本发明水稻稻瘟病抗性基因Pi1可以赋予植物对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应，适用于所有对该病原菌敏感的植物。通过将本发明Pi1基因序列连接到植物转化载体并导入植物细胞中，可以获得转基因抗病品种应用于农业生产。
文档编号C12N15/29GK101906427SQ201010212200
公开日2010年12月8日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者潘庆华 申请人:华南农业大学