专利名称：一种微生物抗稻瘟病剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物抗稻瘟病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
根据联合国粮农组织(FAO)的统计，全球每年被病虫害夺去的谷物占收成的20％-30％，由此造成的经济损失达1200亿美元。我国是一个农业大国，每年由农作物病虫害造成的经济损失巨大。世界各国为了对付日益复杂的病虫害，每年要生产各种化学农药200多万吨，现在农药已广泛应用于农业生产的全过程，是农业生产不可缺少的生产资料。但是，随着化学农药的长期大量使用，人畜中毒事件频频发生，生态环境遭到了严重破坏，环境污染日趋严重。农药的急性、慢性毒性、对环境的不良影响和防治对象的抗药性现象日趋突出，随着我国加入WTO和人们对环境生态保护的日趋重视，我国农药业正面临着严峻的形势。生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在植物病虫害的防治中起着主导作用。大力发展生物农药对我国具有非常重要的现实意义。微生物源农药是新农药创制的重要源头，具有研究周期短、投入低、易于工业化和商品化开发的优势，且对人畜安全，易于分解，与环境相容，自上个世纪90年代以来，微生物农药每年以20％的速度递增，已成为农业生物技术产业中的研究开发热点之一。
由稻瘟病病原菌[Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.]引起的稻瘟病广泛分布于世界各稻区，是世界水稻生产最具毁灭性的病害之一。我国微生物资源丰富，发展微生物农药具有充分的优势。在微生物中放线菌是一类很重要的农用抗生素产生菌，70％以上的农用抗生素均为放线菌产生，在植物病原真菌病害的生物防治中起着非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的是通过对筛选到的一株具有防治稻瘟病活性的链霉菌进行研究，开发微生物抗稻瘟病剂。
本发明筛选到一株对稻瘟病具有很好防治作用的公牛链霉菌Streptomyces tauricusECO 00008，ECO 00008菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京；保藏日期2006年4月17日；保藏登记入册编号为CGMCC No.1682。
本发明Streptomyces tauricus ECO 00008菌株形态特征为菌落白色，圆形，表面毛绒状，边缘有较多菌丝生长，菌落中部突起，菌落不均匀突起，呈现出4瓣以上的花瓣状；基内菌丝和气生菌丝为丝状，不规则分支，一般不断裂；气生菌丝上形成长孢链，直形或波形或螺旋，孢子圆形、椭圆形至杆状。
本发明是这样实现的制备微生物抗稻瘟病剂1、试管种培养将菌株ECO 00008接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH 7.2，于28℃下培养6天，获得试管种。(复合维生素组成为维生素B11.0mg/L，维生素B61.0mg/L，核黄素1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，苯丙氨酸1.0mg/L，生物素1.0mg/L，丙氨酸0.3mg/L，下同)2、液体种子培养采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天。
3、制备微生物抗稻瘟病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10ml上述方法2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗稻瘟病剂。
将上述方法制备得到的微生物抗稻瘟病剂，采用室内毒力测定(抑制孢子萌发法、平板抑菌试验法)及活体药效试验(温室盆栽活体试验)相结合的方法，试验该制剂对稻瘟病的防治作用。
室内毒力测定结果表明用上述方法制备得到的菌株ECO 00008抗稻瘟病剂在抑制孢子萌发法试验中，对稻瘟病病原菌孢子萌发的抑制率为100％；在平板抑菌试验中，对稻瘟病病原菌的抑菌圈直径平均为15.1mm(3次重复)，两项试验表明该制剂对稻瘟病病原菌具有较强的抑制活性。
温室盆栽活体试验结果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病剂对盆栽水稻苗表现出了较好的防治效果，其对稻瘟病的防治效果经计算为94％。
利用本发明生产的制剂对稻瘟病具有较好的离体及活体防治效果，可用于稻瘟病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
具体实施例方式实施例一抑制孢子萌发法试验1、制备试验用抗稻瘟病剂本发明的微生物抗稻瘟病剂，由生产菌株(Streptomyces tauricus)ECO 00008菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。
2、制备稻瘟病病原菌将公知的稻瘟病病原菌(Pyricularia grisea)接种到试管固体培养基斜面上25℃下培养6-8天，培养基配方为每1000ml水中含燕麦片50.0g；蔗糖15g；琼脂粉15g；pH 7.2。待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，于400nm日光灯照射下培养产孢，2-3天后用蒸馏水洗下孢子，并加入0.02％Tween-20溶液，用蒸馏水稀释成浓度为在10×10低倍显微镜下，每个视野30-40个孢子的稻瘟病病原菌孢子悬浮液备用。
3、抑制孢子萌发试验方法将抗稻瘟病剂供试样品与配制好的稻瘟病病原菌孢子悬浮液等体积混合，平铺于水琼脂培养基上，培养基配方为葡萄糖10g，琼脂10g，水1000ml，pH自然，每处理3个重复，同时设清水为空白对照。在25℃下保湿培养18小时后察看空白对照孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发。当空白对照孢子的萌发率达到95％以上时，察看抗稻瘟病剂供试样品对稻瘟病病原菌孢子萌发的抑制情况。
按以下公式计算孢子萌发抑制率孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/(对照孢子萌发率)×100实验结果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病剂供试样品对稻瘟病病原菌孢子的萌发抑制率为100％。
实施例二平板抑菌试验本发明的微生物抗稻瘟病剂，由生产菌株(Streptomyces tauricus)ECO 00008菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，稻瘟病病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。
平板抑菌试验将培养好的稻瘟病病原菌取0.5cm2大的试管种斜面与10ml燕麦片培养基(制法同抑制孢子萌发法中的方法)混合均匀，倒入内径为9cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌实验采用常规的滤纸片法，即在每个带菌平板上放置滤纸片，在滤纸片上滴加制备好的微生物抗稻瘟病剂供试样品15μl，以无菌清水为空白对照，每处理3个重复，置25℃恒温箱中培养72小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。
表1.微生物抗稻瘟病剂对稻瘟病病原菌的抑菌结果
实验结果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病剂供试样品对稻瘟病病原菌的抑菌圈直径平均值为15.1mm。
实施例三温室盆栽活体试验本发明的微生物抗稻瘟病剂，由生产菌株(Streptomyces tauricus)ECO 00008菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，稻瘟病病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。具体试验步骤为a.供试水稻苗本实验采用的水稻品种为蒙古稻。
蒙古稻种子浸泡催芽后，播于装有秧田土的长宽为5×15cm，深10cm的塑料育苗盒内，每盒50苗，在温度为25-28℃的温室内育苗，按0.2克/盒追施尿素，共2-3次。试验用药前一天选择25-3.5叶期长势一致的盆栽水稻苗，按序排放，供试验用。
b.活体药效试验将菌株ECO 00008抗稻瘟病剂供试样品喷施在盆栽水稻苗上，同时设清水为空白对照，以50％的三环唑可湿性粉剂为阳性对照在温度为25-28℃的温室内放置24小时后喷雾接种稻瘟病病原菌孢子悬浮液(制法同抑制孢子萌发法中的方法)，在25℃保湿培养箱中黑暗条件下培养20h，取出放入温度为25-28℃的温室内培育5-7天后，观察发病情况，待空白对照叶片充分发病时，采用十字测量法测量每个病斑直径，以病斑大小作为病害分级标准。病斑分级标准0级无病斑；1级病斑直径0.1-5mm；3级病斑直径51-7.0mm；5级病斑直径71-90mm；7级病斑直径9.1-11.0mm；9级病斑直径111mm以上。
抗稻瘟病防效的计算采用下列两公式病情指数＝[〔∑(各级病叶数×相对级数值)〕/(调查总叶数×最高级值)]×100防治效果(％)＝[(空白对照施药后病情指数-药剂处理施药后病情指数)/空白对照施药后病情指数]×100％温室盆栽活体试验结果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病剂供试样品在盆栽活体水稻苗上表现出了较好的防治效果，其对稻瘟病的防效经计算为94％。
权利要求
1.一种微生物抗稻瘟病剂，其特征在于该制剂的生产菌株为公牛链霉菌Streptomycestauricus ECO 00008，ECO 00008菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1682。
2.权利要求1所述微生物抗稻瘟病剂的制备方法，其特征在于(1)试管种培养为将菌株ECO 00008接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH 7.2，于28℃下培养6天，获得试管种；(2)液体种子培养为采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天；(3)制备微生物抗稻瘟病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10ml上述方法(2)中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗稻瘟病剂。
3.权利要求1所述的微生物抗稻瘟病剂，其特征在于该制剂对稻瘟病具有较好的离体及活体防治效果，可用于水稻稻瘟病的防治。
全文摘要
本发明涉及一种微生物抗稻瘟病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。该制剂的制备工序包括微生物菌株试管种培养、菌株液体种子培养、菌株液体发酵培养。本发明的生产菌株为公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)ECO 00008，该菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1682。利用本发明生产的制剂对稻瘟病具有较好的离体及活体防效，可用于水稻稻瘟病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
文档编号C12R1/465GK1926994SQ20061004866
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月6日 优先权日2006年9月6日
发明者李铭刚, 杨佩文, 文孟良, 刘树芳, 李一青, 李家瑞, 崔晓龙, 尚慧 申请人:云南大学