水稻稻瘟病抗性基因Pike及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水稻抗病育种领域，涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pike的克隆及其 编码蛋白与应用，还涉及根据该基因产生的功能性分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国乃至全世界的重要粮食作物，几乎是我国一半人口的主食，水稻在实 现全球粮食安全中起着非常重要的作用。水稻产量受多种病虫害的影响，常见的水稻病害 有细菌性条斑病、稻瘟病、胡麻叶斑病、纹枯病、黄矮病、白叶枯病和恶苗病等，其中稻瘟病、 白叶枯病和纹枯病被称为水稻的三大重要病害。由水稻稻瘟病菌Magnaportheoryzae引 起的水稻稻瘟病是一种真菌性病害，可以在水稻的各部位以及生育期的各阶段发病，具有 爆发频率高、发生范围广、传播速度快、危害严重等特点，在我国乃至全世界各稻区常年均 有发生，导致水稻各稻区大面积减产甚至绝收。利用水稻的抗病基因识别病原物、并启动自 身的防御应答系统，是水稻防止稻瘟病菌侵袭的重要策略之一。因此，抗病基因的定位与克 隆、抗病基因产物的结构分析与研宄，对水稻病虫害的预防和控制具有指导意义。
[0003] 目前，随着分子生物学的快速发展，至少有100多个水稻抗稻瘟病主效抗性基因 已经被报道，除了水稻第3染色体外，其余11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点， 并且在水稻第6、11、12染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，并且抗性基因在Pita、Pi9和 Pik基因位点成簇存在。迄今，至少有Pi37、Pit、Pi35、Pish、Pib、pi21、Pi36、Pi9、Pi2、 Piz-t、Pi-d2、Pi-d3、Pi5、Pik、Pikm、Pik-p、Pbl、Pil、Pikh、Pia、PiC039、Pi-ta*Pi54# 23个抗稻瘟病基因已经被克隆。
[0004] 通过对已克隆的抗病基因研宄发现，编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植 物抗病基因中最大的一类抗病基因，此类抗病基因的蛋白类似于胞内受体，蛋白质N-端 为核酸结合位点（nucleotidebindingsite，NBS)，蛋白质C-端为富含亮氨酸重复区 (leucine-richrepeat，LRR)。根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，该类基因 分为TIR(ToIl/IL-l受体）-NBS-LRR类型和CC-NBS-LRR类型。目前，TIR(ToIl/IL-l受 体）-NBS-LRR类抗病基因只在双子叶植物中发现。植物中已定位的抗病基因多数属于 CC-NBS-LRR类抗性基因，此类基因在单子叶植物和在双子叶植物中均有存在。
[0005] 在NBS-LRR类抗病蛋白中，NBS结构域比较保守，LRR结构域变异较丰富。NBS结 构域包含3个高度保守的功能基序（激酶la、激酶2a和激酶3a基序），它们与ATP或GTP 结合后获得能量用于抵抗病原菌。不同抗病基因的LRR结构域在重复序列的长度、数目和 位置上有较大差别。Kajava认为LRR结构域与稻瘟病菌的识别有关，LRR被推测为抗病基 因产物直接或间接与病原菌无毒基因编码产物相互作用的部位。Jia等证明了Avr-Pita 蛋白与Pita蛋白的LRR结构域能特异性结合。近期研宄证明，马铃薯的Rx基因的CC结构 域和NBS结构域决定其抗病特异性。马铃薯的Rb基因的CC结构域参与病原菌的特异性识 另lj。Kanzaki等证明了Avr-Pik蛋白与Pik-1蛋白的CC结构域能特异性结合，Zhai等报道 了Pikh-1蛋白的CC结构域可以与Pikh-2蛋白和无毒基因蛋白AvrPik-h直接进行互作， 说明Pikh-1蛋白的CC结构域参与了对病原菌的特异性识别。因此，在不同的抗病基因中， 对病原菌特异性识别起决定性的作用结构域可能不同。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于提供水稻稻瘟病抗性基因Pike-1和Pike-2。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述水稻稻瘟病抗性基因Pike-1和Pike-2编码的蛋 白。
[0008] 本发明的再一目的在于提供根据上述基因Pike-1和Pike-2的DNA序列开发的功 能性分子标记。
[0009] 本发明的目的还在于提供上述基因、蛋白或分子标记的应用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 本发明从水稻品种湘早143中分离得到Pike基因的DNA片段，该片段赋予植物 对稻瘟病菌（Magnaportheoryzae)所引起的病害产生特异性（专化性）的抗病反应，适 用于所有对该病原菌敏感的植物（包括单子叶植物和双子叶植物）。Pike基因包括2个 编码CC-NBS-LRR类蛋白的基因Pike-1和Pike-2,其基因组核苷酸序列如SEQIDNO. 1和 SEQIDNO. 2所示，其全长cDNA序列如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示，它们分别编码 氨基酸序列如SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所示的蛋白，结构如图8和图9所示。Pike-1 和Pike-2蛋白都包含3个主要的结构域：CC、NBS和LRR结构域。其中，Pike-1蛋白的NBS 结构域含有 4 个保守的基序，分别是kinasela:GLPGGGKITIAR，kinase2a:NKKYLIVIDDIW， 的C端区域为16个不规则的LRR重复，紧随其后存在一个103碱基长度的C末端非LRR区域（CtNL)(图8) ;Pike-2蛋白的NBS结构域含有6个保守的基序，分别是kinasela: VLSIVGFGGVGKTTIA,kinase2a：LEQLLAEKSYILLIDDIff,kinase3a：GGRIIVTTRFQAV,motif 3 (GLPI) :EQVPEEIWKICGGLPLAIV，RNBS-D:CLLYLSIFPKGWK，MHDV:KTFQVHDMVLEYI，在Pike-2 蛋白的C端区域为13个不完善的LRR重复（图9)。Pike-1和Pike-2基因的DNA片段在 水稻的叶片组织呈组成型表达。
[0012] 根据本发明提供的Pike基因序列信息（SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2)，可以通过 下列方法获得与Pike等同的基因：根据Pike基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增 的方法从水稻的基因组、mRNA和cDNA中获取。
[0013] 本发明提供的稻瘟病抗性基因Pike基因具有重要的应用价值，Pike基因对稻瘟 病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。应用之一是将所述的Pike基因序列连接到任 何一种植物表达载体，通过农杆菌转化方法将Pike基因导入水稻细胞，从而获得表达所述 基因的转基因抗病品种，进而应用与生产。将本发明所述的Pike基因构建到植物表达载体 中，可以对所述基因或其调控序列进行适当的修饰，或者使用其他启动子取代所述基因原 有的启动子，达到增强或拓宽该基因的转基因植物对病原菌的抗性。
[0014] 在本发明中，发明人根据所述基因序列信息产生特异性的SNP位点设计dCAPS分 子标记，对水稻所提取的DNA进行PCR扩增，并通过酶切反应，检测是否具有Pike基因，能 将Pike基因与等位基因Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pil相区分，其检测的准确性高，可 以用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。其中，根据Pike-1基因产生的 dCAPS分子标记设计的引物序列如SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8所示。根据Pike-2基因产 生的dCAPS分子标记设计的引物序列如SEQIDNO. 9和SEQIDNO. 10所示。这2对dCAPS 分子标记可以将Pike与Pik基因位点上已鉴定的6个等位基因区分开，证明Pike是Pik 基因位点上的一个新等位基因。
[0015] 本发明具有如下优点及效果：将克隆的抗病基因Pike转入感病的植物，有助于培 育出新的抗病植物，特别是可以用转化技术将多个抗病基因转入同一植物中，可以克服传 统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间。抗 病基因的克隆可以克服传统育种中不能在不同物种间转移抗病基因的问题。
[0016] 另外本发明可以进一步提供或利用含有Pike基因的抗病转基因植株和相应的种 子，并且可以通过有性杂交的方式将Pike基因转入其他的植株中。同时，本发明的Pike功 能性分子标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够快捷、直接、方 便地实现在水稻种植资源中以及育种后代中的鉴定，避免了传统育种中人为因素及环境因 素的影响，降低劳动成本，并能提高育种工作的效率。因此，Pike功能性分子标记能够得到 广泛的使用。
【附图说明】
[0017] 图1是水稻稻瘟病抗性基因Pike的图位克隆技术路线图。
[0018] 图2是水稻稻瘟病抗性基因Pike遗传图谱和电子物理图谱的构建及候选基因的 预测。其中，图2A:Pike基因位点的遗传图谱。长横线表示染色体，横线上面的数字为标记 之间的遗传距离（用厘摩cM表示），括号内的数字是用该标记检测出的重组配子数/总配 子数。图2B:Pike基因位点的物理图谱。短横线表示BAC克隆，长横线表示染色体，标记间 的数字表示物理距离（用kb表示）。Pike基因被定位在分子标记ID1159与ID6726之间， 存在4个BAC克隆。图2C :Pike基因位点在日本晴基因组上存在6个具有NBS-LRR保守结 构的候选基因。图2D :Pike基因位点最可能的2个候选基因。
[0019] 图3是候选基因在日本晴与湘早143基因组中的检测。其中，图3A:候选基因在日 本晴与湘早143基因组中的扩增流程图。两对引物ElaF/R和ElbF/R用来扩增日本晴与 湘早143中的候选基因Pikel-N;两对引物E2aF/R和E2bF/R用来扩增日本晴与湘早143 中的候选基因Pike2-N;两对引物E3aF/R和E3bF/R用来扩增日本晴与湘早143中的候 选基因Pike3-N;两对引物E4aF/R和E4bF/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因 Pike4-N;两对引物E5aF/R和E5bF/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike5-N; 两对引物E6aF/R和E6bF/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike6-N。图3B:候 选基因在日本晴（Nip)与湘早143(XZ143)基因组中的扩增图。候选基因Pikel-N、Pike2-N、 Pike3-N和Pike4-N的目标片段在日本晴中被扩增，在湘早143中无法被扩增；候选基因 Pike5_N和Pike6_N在日本晴和湘早143中均能被扩增。推测候选基因候选基因Pikel-N、 Pike2-N、Pike3-N和Pike4-N可能在湘早143中缺失，候选基因Pike5-N和Pike6-N为可 能的候选基因，并用于进行后续的分析，被重新命名为Pike-1和Pike-2 (如图2D)。
[0020] 图4是Pike和Pik基因位点上的等位基因之间的抗病频率及抗谱比较结果图。 其中，图4A:Pike和Pik基因位点上的等位基因之间对来自中国主要稻区的215个稻瘟病 菌测试菌株的抗病频率比较。纵坐标为7个Pik基因位点上的等位基因（IRBLks-S，Piks; IRBLk-Ka，Pik;IRBLkh-K3,Pikh;IRBLkm-Ts，Pikm;IRBLkp-K60,Pikp;C101LAC，Pil;湘早 143,Pike)，横坐标为抗病基因对于215个稻瘟病菌测试菌株的抗病频率。图4B:Pike和 Pik基因位点上的其他6个等位基因对来自中国主要稻区的215个稻瘟病菌测试菌株的抗 谱比较，Pike的抗谱大于