一种具有拮抗活性的甘蔗内生菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种具有拮抗活性的甘蔗内生菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 内生菌是寄居于植物体内，对植物没有危害的一类菌，对于植物的生长发育有着 积极的影响，能够促进寄主植物的生长发育，增强植物的抗病性等。大量的研宄表明拮抗内 生囷能够有效地防治病害。
[0003] 金线莲又名鸟人参、金线草、金丝线、金线蕨龙等，兰科开唇兰多年生草本植物。金 线莲是我国传统的珍稀药用植物，在民间素有"药王"美称，具有较高的药用和保健价值。近 年来，随着市场需求的不断增强，金线莲人工栽培面积急剧增大，同时金线莲病害问题也是 日渐凸显。金线莲灰霉病作为其主要病害之一，具有发病迅速，发病面积大，危害大等特点， 给生产造成严重损失。该病害由半知菌亚门灰葡萄孢属（Botrytis cinerea)的真菌引侵 染所致，不仅对金线莲危害严重，也是蔬菜类如番茄、黄瓜、茄子、西萌芦、生菜、韭菜等蔬菜 的主要病害。目前主要的防治方法主要采用农药防治。农药防治虽然效果显著，但是化学 农药的使用不仅会使病原菌产生抗药性，减弱施用效果，另外农药残留也是生产者和消费 者极其关注的问题，对于作为药用和保健产品的金线莲来说，农药残留严重影响其品质，对 于人体的也具有大的危害。那么寻找一种无毒且有效的病害防治方法是目前解决金线莲病 害问题的迫切需要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种具有拮抗活性的 甘蔗内生菌。该菌株对金线莲灰霉病病原菌抑菌率达到69. 7%，具有强的抑菌效果。对减 少和代替农药的使用具有重要的意义。
[0005] 本发明的另一目的在于提供所述的具有拮抗活性的甘蔗内生菌的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有拮抗活性的甘蔗内生菌，命名为 伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.)SC63-l，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期 为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC No. M2015185,保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0007] 所述的具有拮抗活性的甘蔗内生菌可以应用于防治金线莲灰霉病病原菌。
[0008] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明中的具有拮抗活性的甘蔗 内生菌对金线莲灰霉病病原菌抑菌率达到69. 7%，具有强的抑菌效果。对减少和代替农药 的使用具有重要的意义。所获得的菌株可以应用于防治金线莲灰霉病病原菌。与传统的农 药防治方法相比较，利用内生菌防治具有无毒性残留的优点。
【附图说明】
[0009] 图1是实施例中内生菌与病原菌拮抗效果图；
[0010] 图2是实施例中不同用量的SC63-1发酵液对灰霉病病原菌的抑制效果图；
[0011] 图3是实施例中不同用量的SC63-1发酵液对灰霉病病原菌的抑制曲线图；
[0012] 图4是实施例中受抑制菌丝生长状态的显微镜观察图，其中：a、b为生长正常菌丝 的显微镜观察图；b、d为生长受抑制菌丝的显微镜观察图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0014] 实施例
[0015] 内生菌的分离：
[0016] 从某省农业科学院白云基地甘蔗苗圃采集两年宿根的成熟甘蔗3-4根，利用牛肉 膏蛋白胨培养基进行分离，并进行2-3次纯化后，共分离到细菌60株不同的细菌菌株；然后 进行平板拮抗实验，得到一株对金线莲灰霉病病原菌具有强的拮抗作用的菌株。通过扩增 其16S rDNA测序验证属于伯克霍尔德氏菌。
[0017] 分离步骤：
[0018] 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（NA)
[0019] 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，酵母浸出液，琼脂粉 13g，H2O 1000ml，PH 7. 0-7. 2、121°C 高压灭菌20min。
[0020] NA液体培养基：NA固体培养基不加琼脂粉即可。
[0021] 引物序列：27F(Seq ID No. I) :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG ;
[0022] 1492R(Seq ID No. 2) ：TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；
[0023] 表面消毒方法：75%酒精浸泡30s，灭菌水清洗2-3次，0. 1%升汞浸泡5min，期间 不间断摇晃，灭菌水冲洗5-6次。
[0024] 蔗汁提取步骤：
[0025] (1)取甘蔗茎部用清水冲洗干净；
[0026] (2)切取甘蔗茎部近基部3-5节一段进行表面消毒；
[0027] (3)去掉甘蔗表皮及两端，用灭菌研钵挤压蔗汁；
[0028] (4)用2ml离心管收集Iml蔗汁。
[0029] 内生菌分离：
[0030] (1)将上述Iml蔗汁以10'ΚΓ2……KT7依次稀释，分别取100 y 1稀释液均匀涂 布于NA培养基上，各3个重复。
[0031] (2) 30°C培养2-3d后根据菌落大小、形态、色泽等挑取不同的菌株进行再次纯化。 每个菌株纯化2-3次。
[0032] 拮抗实验：
[0033] 切取0. 5cmX0. 5cm大小培养3-5d的灰霉病病原菌菌块于NA培养基中部28°C培 养l-2d后，取10 μ 1过夜培养的内生菌菌液滴于培养基的边缘一侧，每个培养皿3种内生 菌，进行对峙培养，每个重复3次。再次培养3-5d后进行结果观察，获得一株对金线莲灰霉 病病原菌具有强拮抗作用的内生菌（SC63-1)。经16S rDNA测序比对，该菌与伯克霍尔德氏 菌（Burkholderia)相似性为 99. 99%。
[0034] 其中 SC63-116S RDNA 序列（Seq ID No. 3)如下：
[0036] SC63-1抑菌效果测定：
[0037] 为了进一步验证SC63-1的拮抗作用，再次将SC63-1与灰霉病菌进行两点对峙培 养，具体操作如下：切取培养3-4d的灰霉病病原菌菌丝块置于PDA平板中部，28°C培养2d， 再在PDA培养基距离边缘Icm处滴10 μ 1过夜培养的SC63-1菌液，置于28°C恒温培养箱内 培养5-6d后观察结果并计算抑菌率。5个重复（抑菌率=(菌饼半径-抑菌半径）/菌饼 半径X 100% )。结果显示，SC63-1对金线莲灰霉病病原菌的抑菌率平均达到69. 7%，最高 为73. 3 %，属于强抑制（见表1，图1)。
[0038] SC63-1发酵液对金线莲灰霉病的抑菌效果：
[0039] 用NA培养基培养拮抗菌SC63-1约30个小时左右，OD值达到0. 7左右。12000rpm 离心10min，吸取上清液，用0. 2 μ m细菌过滤器过滤上清液。在PDA培养基上分别均匀涂布 200 μ 1，400 μ 1，600 μ 1，800 μ 1，1000 μ 1的上清液，在超净工作台吹干后切0· 5cmX0. 5cm 大小的培养了 2-3d的菌丝块于培养皿中部，置于28°C培养箱内培养，每天定时测定菌落直 径，结果如图3所示，第3天时显示与对照相比，发酵液对金线莲灰霉病菌落的生长有明显 的抑制作用。
[0040] 表1内生菌对病原菌的抑制率
[0041]
[0042] 注：抑菌率=(菌饼半径-抑菌半径）/菌饼半径X 100%
[0043] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0044]
[0045]
【主权项】
1. 一种具有拮抗活性的甘蔗内生菌，其特征在于：命名为伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiasp. )SC63-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年4月1 日，保藏编号为CCTCCNo.M2015185,保藏地址为中国武汉武汉大学。2. 权利要求1所述的具有拮抗活性的甘蔗内生菌应用于防治金线莲灰霉病病原菌。
【专利摘要】本发明公开了一种具有拮抗活性的甘蔗内生菌及其应用，属于生物技术领域。所述的具有拮抗活性的甘蔗内生菌，命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)SC63-1，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC No.M2015185，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明中的具有拮抗活性的甘蔗内生菌对金线莲灰霉病病原菌抑菌率达到69.7％，具有强的抑菌效果。对减少和代替农药的使用具有重要的意义。所获得的菌株可以应用于防治金线莲灰霉病病原菌。与传统的农药防治方法相比较，利用内生菌防治具有无毒性残留的优点。CCTCC NO:M201518520150401
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, A01P3/00
【公开号】CN104928211
【申请号】CN201510282213
【发明人】王丽, 曹干, 王继华
【申请人】广东省农业科学院作物研究所
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月27日