一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法，属于生物菌制品的生产领域。所述冻干粉包括分离乳清蛋白，山梨醇，菊粉，抗坏血酸钠和植物乳杆菌，WPI的含量为50g/L～150g/L，山梨醇的含量为20g/L～60g/L，菊粉的含量为20g/L～60g/L，抗坏血酸钠的含量为10g/L～30g/L。本发明的冻干保护剂较常规保护剂显著提高了植物乳杆菌的存活率，其制备的植物乳杆菌冻干粉中，植物乳杆菌CCFM 8610、植物乳杆菌CCFM 8661等植物乳杆菌的冻干存活率达到100％。
【专利说明】
-种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法，属于生物菌制品的生产领域。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌因其优越的发酵性能和多样的功能性，得到广泛的关注，并被深入研 究和开发。目前，植物乳杆菌已被广泛地应用到营养保健、发酵食品、生物医药、饲料、畜牧 养殖等行业中。泡菜直投式发酵剂、乳酸菌片剂、活性乳酸菌饮料等植物乳杆菌制品深受广 大消费者的喜爱。但是植物乳杆菌对外界环境抗性低，国内生产技术不完善导致菌粉细胞 存活率低，确保植物乳杆菌无损失是提高植物乳杆菌活性制品生产的关键技术。
[0003] 菌粉便于储藏和运输，并有利于后期产品的加工，乳酸菌的生产多W菌粉的形式 呈现。目前真空冷冻干燥是生产菌粉最有效的干燥技术，其可W很好的保持菌体的生理生 化特性和生物活性。乳酸菌预冻成固体后，水分不经过液相，在真空和低溫条件下直接升 华。但是不加任何保护的菌体直接冻干，必然引起机械损伤，细胞膜的流动性和通透性变 化，动态平衡的破坏，细胞会被杀死。因此，冻干乳酸菌时会添加冻干保护剂提高菌体的存 活率。目前冻干保护剂主要包括蛋白质，有机聚合物(聚薦糖、径乙基纤维素、菊粉等），糖类 (乳糖、薦糖、海藻糖等)和其他成分(如糖醇、维生素 C、谷氨酸钢、甘油等）。其中蛋白质或聚 合物能够在冷冻过程形成无定形结构，可W减少化学损伤。但是不同的蛋白因其性质不同， 保护效果亦不同，筛选保护效果好的蛋白质是提高冻干存活率的先决条件。糖类被认为具 有通过氨键替代稳定脂质膜和蛋白的效果，同时也可W通过玻璃化过程形成无定形的非晶 结构。脱脂乳、薦糖和海藻糖因其较好的保护效果，是经常被使用的冻干保护剂。
[0004] 虽然目前广泛使用的保护剂在冻干乳酸菌时已具有较好效果，但是在冻干植物乳 杆菌时存活率均较低。大量研究也表明不同的菌株需要的保护剂不同，保护剂的使用量也 不同。运与菌株的特异性和菌体的大小有关系。因此一种更有效的保护植物乳杆菌的的保 护剂配方及制备策略是提高植物乳杆菌生产的关键技术。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有保护剂对植物乳杆菌较差的冻干保护效 果，提供一种适合于植物乳杆菌的保护剂配方及制备策略。
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种冻干保护剂，成分包括WPI，山梨醇，菊粉，抗坏 血酸钢;所述WPI的含量为50g/L~150g/L，山梨醇的含量为20g/L~60g/L，菊粉的含量为 20g/L~60g/L，抗坏血酸钢的含量为lOg/L~30g/L。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述的乳酸菌的冻干保护剂的组成为:WPI 60g/L， 山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗坏血酸钢20g/L。
[000引本发明的第二个目的是提供一种植物乳杆菌冻干粉，是由所述冻干保护剂和植物 乳杆菌活性成分制成。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌包括:植物乳杆菌CCFM 8610,植物乳杆 菌CCFM 8661，植物乳杆菌ATCC 14917中的至少一种。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CCFM 8610已于2012年5月3日在北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、保藏，其保藏号为CGMCC No. 6077，并在申请号为201210046323.5，【公开日】 为2012年12月19日的专利中公开;所述植物乳杆菌CCFM 8661已于2011年11月29日在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中屯、保藏，其保藏号为CGMCC No. 5494，并 于2012年07月18日在申请号为201210046323.5的专利中公开。
[0011] 本发明的第=个目的是提供所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法，包括收集菌体、 配制保护剂、冻干和菌体的收集和保藏。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述收集菌体是收集培养至对数生长期末期的植物 乳杆菌，离屯、获得菌泥。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述配制保护剂是配制成浓度为lOOg/L~300g/L的 WPI溶液，浓度均为80g/L~240g/L的菊粉和山梨醇混合溶液，浓度为40g/L~120g/L的抗坏 血酸溶液，灭菌后将上述保护剂溶液W2:1:1的体积比在无菌环境下混匀，制备成冻干保护 剂。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述冻干是将收集的植物乳杆菌菌泥与冻干保护剂 溶液充分混匀，预冻、一次干燥，再二次干燥。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述菌粉的收集和保藏是收集菌粉至无菌真空包装 袋，然后用真空包装机进行真空封装
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法为：
[0017] (1)收集菌体:收集培养至对数生长期末期的乳酸菌，在4°C条件离屯、10~20分钟， 离屯、条件为3000~8000g。弃上清液，加入无菌水或无菌生理盐水，震荡混匀洗涂菌体，然后 在相同的条件下离屯、，得到菌泥。将菌泥置于4°C环境下，用于冻干菌粉的制备。
[0018] (2)配制保护剂:称取一定质量的WPI，完全溶解于一定量的纯化水中，配制成浓度 为lOOg/L~300g/L的WPI溶液，己氏杀菌;然后称取一定质量的菊粉和山梨醇，配制成两者 浓度均为80g/L~240g/L的混合溶液，115°C高溫灭菌20分钟;40g/L~120g/L的抗坏血酸钢 膜滤除菌;灭菌后将将上述保护剂溶液W2:1:1的体积比在无菌环境下混匀，制成此发明的 冻干保护剂。
[0019] (3)冻干:将收集的植物乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液充分混匀，菌悬液倒入冻干 托盘(或培养皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷冻干燥机冻干箱，按照W 下冻干工艺进行真空冷冻干燥：
[0020] (a)预冻:将产品溫度降至4°C，保持30~60分钟，再降溫至-40°C，保持4~6小时。
[0021] (b) -次干燥:预冻完成后，将冷阱溫度降至-40°CW下，开真空累，在冻干箱压力 低于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率将产品溫度升至-20°C，保持20~30小 时。
[0022] (C)二次干燥:一次干燥完成后，W冻干机最快升溫速率将产品溫度升至20°C，保 持10~20小时，产品无水分挥发后结束冻干过程。
[0023] (4)菌粉的收集和保藏:冻干结束后，收集菌粉至无菌真空包装袋，然后用真空包 装机进行真空封装;真空包装后的菌粉可根据需要保存在溫度不超过2(TC的任意环境中， 低溫保藏效果更好。
[0024] 有益效果:本发明的冻干保护剂较常规保护剂能够显著提高植物乳杆菌的冻干存 活率，制备的植物乳杆菌冻干粉中，植物乳杆菌的冻干存活率达到100%。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1冻干保护剂的制备
[00%]称取一定质量的WPI，完全溶解于一定量的纯化水中，配制成浓度为lOOg/L~ 300g/L的WPI溶液，己氏杀菌；然后称取一定质量的菊粉和山梨醇，配制成两者浓度均为 80g/L~240g/L的溶液，115°C高溫灭菌20分钟;40g/L~120g/L的抗坏血酸钢膜滤除菌。灭 菌后将各保护剂溶液W2:1:1的体积比在无菌环境下混匀，获得冻干保护剂。
[0027] 实施例2植物乳杆菌CCFM 8610冻干菌粉的制备
[00%] (1)冻干保护剂组成:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗坏血酸钢20g/l;常 规冻干保护剂组成:脱脂乳120g/L，薦糖20g/L，海藻糖20g/L。
[0029] (2川欠集菌体:菌株培养至对数生长期末期后，8000g离屯、，弃上清液，用pH 7.0的 生理盐水洗涂两次，最后离屯、弃上清液得到湿菌体。
[0030] (3)冻干:取湿菌体0.5旨，1.0旨，1.5旨，2.0旨分别加入10血本发明保护剂和常规保护 剂，充分混匀后，进行真空冷冻干燥，冷冻干燥步骤为：
[0031] 将收集的植物乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液充分混匀，菌悬液倒入冻干托盘(或 培养皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷冻干燥机冻干箱，按照W下冻干 工艺进行真空冷冻干燥：
[0032] a)预冻:将产品溫度降至4°C，保持30~60分钟，再降溫至-40°C，保持4~6小时。
[0033] b)-次干燥:预冻完成后，将冷阱溫度降至-40°CW下，开真空累，在冻干箱压力低 于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率将产品溫度升至-20°C，保持20~30小时。
[0034] C)二次干燥:一次干燥完成后，W冻干机最快升溫速率将产品溫度升至20°C，保持 10~20小时，产品无水分挥发后结束冻干过程。
[0035] (4)冻干完成后，冻干菌粉用无菌蒸馈水复溶至冻干前体积，测定活菌浓度，计算 冻干存活率，结果如表1所示。
[0036] 表1植物乳杆菌CCFM 8610在两种保护剂中的冻干存活率
[nm7l
[0038]冻干完成后，常规保护剂的保护效果显著低于本发明保护剂，植物乳杆菌CCFM 8610在常规保护剂的中冻干存活率均低于70%，在菌泥比例增加时，存活率更低。而本发明 保护剂显著提高冻干存活率，菌泥添加量低于1.5g/10mL保护剂时，冻干存活率达到100%， 植物乳杆菌CCFM 8610冻干菌粉的活菌含量达到2.0~4.5 X l〇iic化/g。
[0039] 实施例2植物乳杆菌CCFM 8661冻干菌粉的制备
[0040] (1)冻干保护剂组成:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗坏血酸钢20g/l;常 规冻干保护剂组成:脱脂乳120g/L，薦糖20g/L，海藻糖20g/L。
[0041 ] (2川欠集菌体:菌株培养至对数生长期末期后，8000g离屯、，弃上清液，用pH 7.0的 生理盐水洗涂两次，最后离屯、弃上清液得到湿菌体。
[0042] (3)冻干:取湿菌体0.5邑，1.0邑，1.5邑，2.0邑分别加入10血本发明保护剂和常规保护 剂，充分混匀后，进行真空冷冻干燥，冷冻干燥步骤为：
[0043] 将收集的植物乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液充分混匀，菌悬液倒入冻干托盘(或 培养皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷冻干燥机冻干箱，按照W下冻干 工艺进行真空冷冻干燥：
[0044] a)预冻:将产品溫度降至4°C，保持30~60分钟，再降溫至-40°C，保持4~6小时。
[0045] b)-次干燥:预冻完成后，将冷阱溫度降至-40°CW下，开真空累，在冻干箱压力低 于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率将产品溫度升至-20°C，保持20~30小时。
[0046] C)二次干燥:一次干燥完成后，W冻干机最快升溫速率将产品溫度升至20°C，保持 10~20小时，产品无水分挥发后结束冻干过程。
[0047] (4)冻干完成后，冻干菌粉用无菌蒸馈水复溶至冻干前体积，立即测定pH值和活菌 浓度，计算冻干存活率，结果如表2所示。
[004引表2植物乳杆菌CCFM 8661在两种保护剂中的冻干存活率
[0049]
[0050] 冻干完成后，常规保护剂的保护效果显著低于本发明保护剂，植物乳杆菌CCFM 8661在常规保护剂的中冻干存活率均低于60%，在菌泥比例增加时，存活率更低。而本发明 保护剂显著提高冻干存活率，菌泥添加量低于2 . Og/lOmL保护剂时，冻干存活率均可达到 100%，植物乳杆菌CCFM 8661冻干菌粉的活菌含量达到2.0~5.5Xl〇iic化/g。
[0051 ]实施例3植物乳杆菌ATCC 14917冻干菌粉的制备
[0052] (1)本发明的冻干保护剂组成:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗坏血酸钢 20g/l;常规冻干保护剂组成:脱脂乳120g/L，薦糖20g/L，海藻糖20g/L。
[0053] (2)菌株培养至对数生长期末期后，8000g离屯、，弃上清液，用抑7.0的生理盐水洗 涂两次，最后离屯、弃上清液得到湿菌体。
[0054] (3)冻干:取湿菌体0.5g，1. Og，1.5g，2. Og分别加入lOmL本发明保护剂和常规保护 剂，充分混匀后，进行真空冷冻干燥，冷冻干燥步骤为：
[0055] 将收集的植物乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液充分混匀，菌悬液倒入冻干托盘(或 培养皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷冻干燥机冻干箱，按照W下冻干 工艺进行真空冷冻干燥：
[0化6] a)预冻:将产品溫度降至4°C，保持30~60分钟，再降溫至-40°C，保持4~6小时。
[0057] b)-次干燥:预冻完成后，将冷阱溫度降至-40°CW下，开真空累，在冻干箱压力低 于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率将产品溫度升至-20°C，保持20~30小时。
[0058] (4)冻干完成后，冻干菌粉用无菌蒸馈水复溶至冻干前体积，测定活菌浓度，计算 冻干存活率，结果如表3所示。
[0059] 表3植物乳杆菌ATCC 14917在两种保护剂中的冻干存活率
[0060]
[0061] 冻干完成后，常规保护剂的保护效果显著低于本发明保护剂，植物乳杆菌CCFM 8610在常规保护剂的中冻干存活率均低于70%，在菌泥比例增加时，存活率更低。而本发明 保护剂显著提高冻干存活率，菌泥添加量为0.1~1.5g/10mL保护剂时，冻干存活率达到 100%，植物乳杆菌CCFM 8610冻干菌粉的活菌含量达到2.0~4.5Xl〇iicfu/g;菌泥添加量 为1.5~3g/mL保护剂时，冻干粉中植物乳杆菌存活率达70% W上。
[0062] 采用组成为乳清分离蛋白WPI 50g/L~150g/L，山梨醇20g/L~60g/L，菊粉20g/L ~60g/L，抗坏血酸钢lOg/L~30g/L的冻干保护剂按上述方法制备的植物乳杆菌冻干粉冻 干存活率均为70 % W上。
[0063] 虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种植物乳杆菌冻干保护剂，其特征在于，成分包括乳清分离蛋白，山梨醇，菊粉，抗 坏血酸钠;含量分别为乳清分离蛋白WPI 50g/L~150g/L，山梨醇20g//L~60g/L，菊粉20g/L ~60g/L，抗坏血酸钠10g/L~30g/L。2. 根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述的植物乳杆菌冻干保护剂的组 成为:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗坏血酸钠20g/L。3. -种植物乳杆菌冻干粉，其特征在于，由权利要求1或2所述冻干保护剂和植物乳杆 菌活性成分制成。4. 根据权利要求3所述的冻干保护剂，其特征在于，含有植物乳杆菌CCFM 8610，植物乳 杆菌CCFM 8661，植物乳杆菌ATCC 14917中的至少一种。5. 权利要求3所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括收集湿菌体、配制 保护剂、冻干和菌体的收集和保藏。6. 根据权利要求3所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，收集湿菌体是收集 培养至对数生长期末期的植物乳杆菌，离心获得菌泥。7. 根据权利要求3所述的植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述配制保护剂 是配制浓度为l〇〇g/L~300g/L的WPI溶液，浓度均为80g/L~240g/L的菊粉和山梨醇混合溶 液，浓度为40 g//L~120g/L的抗坏血酸溶液，灭菌后将上述保护剂溶液以2:1:1的体积比在 无菌环境下混匀，制备成冻干保护剂。8. 根据权利要求3所述的植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干是将收 集的湿菌体与冻干保护剂溶液以0.1~3g: 10mL的比例充分混匀，预冻，一次干燥，二次干 燥。9. 根据权利要求3所述的植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述菌体的收集 和保藏是收集菌粉至无菌真空包装袋，然后用真空包装机进行真空封装。10. 根据权利要求3所述的植物乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，具体步骤为： (1) 收集湿菌体：收集培养至对数生长期末期的乳酸菌，在4°C，3000~8000g离心5-lOmin;加入无菌水或无菌生理盐水洗涤菌体，离心，得到菌泥;将菌泥置于4°C环境下，用于 冻干菌粉的制备； (2) 配制保护剂:称取WPI，配制成浓度为100g/L~300g/L的WPI溶液;称取菊粉和山梨 醇，配制成浓度均为80g/L~240g/L的混合溶液;配制40g/L~120g/L的抗坏血酸钠溶液;将 各保护剂溶液分别灭菌后在无菌环境下混匀，制成冻干保护剂； (3) 冻干:将收集的植物乳杆菌菌泥与冻干保护剂溶液充分混匀，倒入冻干容器，液面 厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷冻干燥机冻干箱，按照以下冻干工艺进行真空冷冻干燥： (a)预冻:将产品温度降至4°C，保持30~60min，再降温至-40°C，保持4~6h;(b)-次干燥： 预冻完成后，将冷肼温度降至_40°C以下，打开真空栗，在冻干箱压力低于26.6Pa后，以0.3 °C/min的升温速率将产品温度升至-20°C，保持20~30h;(c)二次干燥:一次干燥完成后，以 冻干机最快升温速率将产品温度升至20°C，保持10~20h，至产品无水分挥发； (4) 菌粉的收集和保藏：冻干结束后，收集菌粉至无菌真空包装袋，然后用真空包装机 进行真空封装;真空包装后的菌粉可根据需要保存在温度不超过20°C的任意环境中，低温 保藏效果更好。
【文档编号】C12N1/20GK106047709SQ201610666406
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月12日 公开号201610666406.2, CN 106047709 A, CN 106047709A, CN 201610666406, CN-A-106047709, CN106047709 A, CN106047709A, CN201610666406, CN201610666406.2
【发明人】陈卫, 崔树茂, 翟齐啸, 赵建新, 田丰伟, 王刚, 张灏
【申请人】江南大学