一种具有缓解pfos毒害功能的植物乳杆菌及其应用
【专利说明】一种具有缓解PFOS毒害功能的植物乳杆菌及其应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种具有缓解PF0S毒害功能 的植物乳杆菌及其应用，本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途。 【【背景技术】】
[0002] 全氟辛烧磺酸(Perfluorooctanesulphonate，PF0S)是众多全氟化合物家族中的 代表性物质之一，因其具有良好的理化特性，自从20世纪50年代工业化生产以来，它被广泛 用于皮棉制品、地毯防污剂、机械润滑剂、液压油、涂料、制冷剂、表面活性剂、纸制品、表面 处理剂、泡沫灭火剂、农药和杀虫剂、医药品和化妆品等生产过程，还大量使用于半导体等 电子产品生产过程和化学镀膜领域。数百种全氟化工产品在环境中或在生物体内的最终降 解产物之一为PF0S。由于具有稳定的化学性质，PF0S在环境中很难被降解，从而造成其长期 的稳定存在，而一旦进入生物体，这些化合物的就很难被排出或者分解。研究表明，PF0S在 人体内的半衰期为5.4年。PF0S除了具有疏水性之外还具有疏油的特性。因此，其进入生物 体内，不易在脂肪中富集，而是更易与蛋白结合存在于血液、肝脏等组织器官中。与此同时， PF0S的高稳定性使得其在生物体内不断积累，具有生物富集性及其沿食物链的生物放大效 应。因其在生物体内的高浓度分布，PF0S对动物和人类健康的潜在影响引起了人们的广泛 关注，目前己有许多毒理学实验表明，该类化合物暴露水生生物和哺乳动物将导致多系统 的毒性效应，包括肝脏毒性、免疫毒性、生殖和发育毒性以及神经毒性等，甚至有可能诱发 肝脏、翠丸、胰脏和乳腺癌变等。已有调查表明PF0S污染已经几乎遍及全球。2001年，PF0S被 美国环保署列入持久性污染物黑名单；2009年5月，PF0S被正式被列入《关于持久性有机污 染物的斯德哥尔摩公约》。我国属PF0S生产和销售历史较短的国家，但在近些年里发展势头 迅猛，许多很具规模的全氟化合物生产企业发展迅速，目前还没有有机氟化合物的替代产 品。
[0003] 作为一种新兴污染物，PF0S的相关研究尚处在起步阶段，目前研究主要集中在环 境介质中污染状况的调查分析及毒性研究，关于PF0S的治理研究主要集中在吸附和降解2 种方式。而对于由PF0S中毒引起的各种生理病症，目前主要研究其毒性机理，尚没有开发有 效的药物来治疗其带来的毒性损伤。但是PF0S的蓄积毒性和中毒症状引起了越来越多的关 注，因此寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发 酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青 贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少 的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有:防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌 群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、抗氧化作用、保护肝 脏并增强肝脏的解毒等功能。乳酸菌作为一种食品级的微生物，不像螯合剂有严重的毒副 作用，且已有诸多报道表明其在体外、体内对重金属等污染物具有较好的吸附作用，很有潜 力成为具有吸附PF0S，保护机体避免PF0S造成损伤的新型保健食品。因此，筛选出一种对 PF0S具备优良耐受和吸附能力以及具有强抗氧化能力的乳酸菌，并且证明它们在动物模型 中具有良好的缓解PFOS毒性损伤作用，同时研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。 本发明试图进一步地挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策 略缓解由PF0S导致的中毒效应开辟出新的途径和解决方案。 【
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM737。
[0005] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0006]本发明涉及一种乳酸菌，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特 性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM737，该菌株已于2015年 10月8日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 11472。
[0007] 所述的植物乳杆菌CCFM737具有下述性质：
[0008]⑴具有耐酸性，在PH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
[0009]⑵在体外含有PF0S的培养基中培养，对PF0S有良好的耐受能力；
[0010]⑶在体外含有PF0S的水溶液中孵育，对PF0S有良好的吸附能力；
[0011]⑷具有缓解PF0S暴露小鼠中毒症状，改善PF0S暴露小鼠肝损伤程度的作用。
[0012]所述的植物乳杆菌CCFM737在制备缓解PF0S中毒的药物组合物与/或发酵剂中的 应用也属于本发明要求保护的范围。
[0013]根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM737菌 剂与在药学上可接受的载体组成的。
[0014] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌CCFM737菌剂是将含有所 述植物乳杆菌CCFM737的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它方法制备所得到的粉剂， 它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM737。
[0015] 根据本发明的另一种优选实施方式，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在 药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
[0016]根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、 丸剂或口服液剂型。
[0017]根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：
[0018] A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7 %水将10 %酶水解脱脂乳、 0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨与0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8,这样得到所述的 培养基；
[0019] B、保护剂的制备:使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/ L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠的保护剂；
[0020] C、将植物乳杆菌CCFM737菌种按照以所述培养基的重量计1-5%接种量接种到在 温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，在温度37°C下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓 冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度101()CFU/ml;接着，让该悬浮液在温度37°C下预 培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。
[0021 ]下面将更详细地描述本发明。
[0022] 本发明涉及一种植物乳杆菌（Lactobaci llus plantarum)CCFM737，该菌株已于 2015年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类学命名为植 物乳杆菌Lactobacillusplantarum，其保藏号为CGMCCNo· 11472,保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号。
[0023]本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例 如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737具有下述性 质：
[0024]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
[0025]⑵在体外含有PF0S的培养基中培养，对PF0S有较好的耐受能力；
[0026]⑶在体外含有PF0S的水溶液中孵育，对PF0S有良好的吸附能力；
[0027]⑷具有缓解PF0S暴露小鼠中毒症状，改善PF0S暴露小鼠肝损伤程度的作用。
[0028]下面将详细描述这些实验与分析认证结果。
[0029] 1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好 [0030]将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM737接种于MRS培养基(例如青岛海博生物技 术有限公司的产品）中，在温度37°C下培养18h，再经MRS培养液传代培养2~3次后，以1 %的 接种量分别接种于不同pH值(3.0-9.0)的MRS液体培养基中，在温度37°C下培养18h，测定初 始和培养结束后的〇D6QQ值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的 生长情况。OD600值是采用分光光度法在波长600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用 于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。
[0031] 试验结果证明植物乳杆菌CCFM737在PH3.0-9.0的环境中生长良好，因此得以进行 后续实验。采用与前面所述的同样培养方式，用l.OmLpH7.2PBS(磷酸盐缓冲液)清洗菌体 两次，再用l.OmLpH7.2磷酸盐缓冲液重悬，其重悬乳杆菌菌体与9.OmLpH2.5人工胃液混 合，然后在温度37°C下进行培养，分别在开始(Oh)和3h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养 进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在第3h时的活菌 数对数值与在第〇h时活菌数对数值之比，以％表示。本发明筛选存活率在80 %以上的菌株 进行后续研究。
[0032] 实验结果表明，植物乳杆菌CCFM737在pH2.5的人工胃液环境中的存活率在90%以 上。由此可见，植物乳杆菌CCFM737具有耐酸性，在pH2.5的环境下存活良好。
[0033] 2、在体外含PF0S的培养基中培养，对PF0S具有良好的耐受能力
[0034] 植物乳杆菌CCFM737对PF0S耐受能力通过最低抑制浓度（MIC)方法测定。配制 100mg/L的PF0S溶液作为PF0S的母液，然后用孔径大小为0.22μπι的无菌过滤器进行过滤。将 除菌后的PF0S母液按比例添加于MRS琼脂培养基中混匀，使其终浓度分别为1.0，2.0，5.0， 10,20,30,50!^/1，并分别浇注平板。将每个琼脂平板划分为四等份，各在每个分区各滴加 10yL植物乳杆菌CCFM737菌悬液，每个PF0S