一株植物乳杆菌的筛选及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株植物乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 食品安全问题是世界范围内的重要课题，在我国这样的发展中国家问题尤为突 出，近年来食源性疾病患者的数目一直居高不下，由微生物引起的食物中毒情况非常严重。 添加化学防腐剂是人类使用的重要食品保藏方法，但经长期研宄发现过量食用合成的防腐 剂对血压，心脏，肾脏等有不良影响，甚至有些化学防腐剂有致癌性，致畸性和易引起食物 中毒等问题。热杀菌也是食品加过程中杀灭微生物的重要方法，但对某些低温制品，加热温 度过高，其色泽，风味会发生明显变化，营养价值也大幅降低。其它物理方法：如紫外消毒， 过滤除菌，钴60照射法等，对人体无毒害作用，但当包装打开后，又有再次感染腐败菌的可 能。因此，开发出高效，稳定，安全的天然食品防腐剂市食品工业发展的必然趋势。
[0003] 单核细胞增生李斯特菌是致病微生物，是人类和动物的严重疾病根源，尤其易于 通过污染食品进行传播，更具体的说是通过肉类，肉质品，海产品，奶类及由其衍生的产 品。单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表 水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口 腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%，有70% 的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽 均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴 氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心、菜色拉、序菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约 占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。
[0004] 乳酸菌细菌素 （bacteriocins of LAB)是指乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成 的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白类物质。它们通常可以抑制一些常见的腐败菌和致病 菌，如金黄色葡萄球菌，藤黄微球菌，枯草芽孢杆菌，单核细胞增生李斯特菌等。而且大部分 乳酸菌细菌素稳定性较好，可与食品一起加热使用，而且易于被人体中的蛋白酶降解，不会 在体内积聚引起不良反应，被认为是具有广阔前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株产细菌素的植物乳杆菌及其应用，该菌株生产的细菌素 可以抑制多种与其近缘的G +菌株，并对单核细胞增多性李斯特菌有强烈的抑制性。
[0006] 本发明提供的植物乳杆菌为植物乳杆菌（lactobacillus plantarum)，其在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No 5297。
[0007] 上述植物乳杆菌是以一些最常见的腐败菌和病原菌为指示菌，筛选出产对单核细 胞增多性李斯特菌有强烈抑制性的植物乳杆菌菌株，并且通过诱变手段提高其发酵液中的 细菌素活力。已于2011年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研宄所)，保藏登记 号为 CGMCC No 5297。
[0008] 本发明提供的应用，即植物乳杆菌CGMCC No 5297在抑制李斯特氏菌，尤其是单核 细胞增多性李斯特菌中的应用，以及植物乳杆菌CGMCC No 5297在生产细菌素中的应用，同 时还有所产细菌素在食品及饲料防腐中的应用。
[0009] 上述单核细胞增多性李斯特菌优选为单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595。
[0010] 本发明的植物乳杆菌（lactobacillus plantarun)可以产生对多种近源菌有抑制 作用的细菌素，并且对李氏杆菌有强烈的抑制性。该细菌素对蛋白酶敏感，具有很好的热稳 定性，在121°C作用30min，仍然保持较高的活性。该细菌素在pH2. 0-8. 0范围处理30min， 回调到pH5. 0后，均保持很强的抑制指示菌单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595的能力。可 以应用为具有广阔前景的天然食品防腐剂及饲料添加剂。
【附图说明】
[0011] 图1是野生菌Yal-I的EMS致死曲线。
[0012] 图2是筛选菌株CGMCC No 5297的生长曲线。
[0013] 图3是筛选菌株CGMCC No 5297生长过程中的pH变化曲线。
[0014] 图4是筛选菌株CGMCC No 5297生长过程中抑菌活性的变化曲线。
[0015] 图5是利福平标准效价曲线。
[0016] 图6是添加不同浓度植物乳杆菌CGMCC No 5297无菌上清的单核细胞增多性李斯 特菌的OD62tl变化曲线。
[0017] 图7是经植物乳杆菌CGMCC No 5297代谢产物粗品处理的酸奶细菌总数的变化。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体的实施方式来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说 明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0019] 实施例1 :植物乳杆菌的获得。
[0020] 一：植物乳杆菌野生菌的获得。
[0021] 菌种来源：分离自自制酸奶。在无菌条件下，取酸奶5mL，加入到45mL无菌蒸熘水 中，充分震荡5min，以10倍系列稀释，从KT 1 ~ KT7梯度，选合适的梯度，取IOOu L分别 涂布于含有CaCOj^ MRS (蛋白胨IOg，酵母膏5g，牛肉膏IOg，葡萄糖20g，磷酸氢二钾 2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，吐温80 lmL，琼脂15g，蒸馏 水lL，pH6. 50)培养基上，30 °C静置培养并计数。选取具有明显溶钙圈的单菌落，进行革 兰氏染色试验，镜检。挑选革兰氏阳性菌进行划线分离纯化2~3次，将分离纯化后的单菌 落再一次进行镜检，转移到MRS斜面培养基上，并于4°C保存，待鉴定。
[0022] 将保存的乳酸菌用接种环接种在MRS液体培养基中，30°C静置培养48 h后，利用 点种法，点种5ul，对各种G-，G+病原菌做抑菌试验，并选取抑菌圈比较明显的乳酸菌株进 行复筛试验。
[0023] 初筛后具有抑菌效果的菌株培养于MRS液体培养基中，24 h后离心收取上清，将 上清用过氧化氢酶处理后调节PH值为6. 0,过滤除菌。利用牛津杯双层琼脂扩散法，对指 示菌进行抑菌试验。含1. 5%琼脂的LB培养基(蛋白陈IOg，酵母提取物5g，氯化纳IOg ，蒸馏水1.0 L，pH7.0)按每平皿IOmL倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却，然后用 无菌摄子将牛津杯轻轻放置于培养基上；制备含0.8%琼脂的LB培养基，冷却至50 °C左 右，按1%的接种量加入单核细胞增生李斯特菌菌悬液作为上层培养基，倾倒15mL上层培 养基于放置好牛津杯的的平板中冷却，冷却后将牛津杯取出，将上清液加入小孔中于4°C冰 箱中扩散，30°C过夜培养。用游标卡尺比较抑菌圈大小。获得一株对单核细胞增生李斯特 菌有强烈抑制的乳酸菌，命名为Yal-I。
[0024] 二、植物乳杆菌 CLactobacillus plantarum) Yal-I 的鉴定。
[0025] 参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，并对菌株Yal-I进 行16sRNA测序。其中菌株生理生化实验结果如表1所示，碳源发酵试验结果如表2所示， 结合生理生化及碳源发酵实验结果，并将16S信息进行比对，菌株Yal-I应为植物乳杆菌。
[0026] 根据细胞显微形态、生理生化数据和16S rRNA基因序列数据，将菌株鉴定为植物 乳杆菌（Lactobacillus plantarum) 〇
[0027] 表1 :植物乳杆菌Yal-I的理化试验结果。
[0028] 精氨酸产氨- 石蕊牛奶+ 硫化氢实验-淀粉水解-七叶苷水解+ 精氨酸水解-葡萄糖产气-葡聚糖_ V-P实验+ 明胶液化-过氧化氢酶- 注代表阴性，"+"代表阳性。
[0029] 表2 :植物乳杆菌Yal-I糖发酵实验结果。
[0030] 阿拉伯糖w 木糖_ 半乳糖+ 麦芽糖+ 甘露糖+ 棉子糖+ 可溶性