一种饲料黄曲霉生物拮抗剂及其培养分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品领域，具体而言，属于兽用饲料微生物制剂的生产。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉是很多作物的腐生菌或致坏死病原菌，依靠产生的分生孢子和毒素在作物 中交叉感染，侵染粮食、油料作物的种子、饲料以及各种食品等，导致农作物减产，威胁人、 畜和禽类健康。黄曲霉最大的危害是产生黄曲霉毒素，黄曲霉毒素具有很强的毒性，被认为 有致癌性、致突变、致畸性、抑制免疫力，并可引起肝部损伤等危害，其中毒性最大的黄曲霉 毒素，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。因此如何有效的防治黄曲霉及其毒素的产生具 有十分重要的理论和现实意义。
[0003]由于黄曲霉污染所带来的巨大经济损失和健康危害，人们一直在寻求对其进行有 效防治的策略和技术，并提出了一些初步措施，各种物理化学去毒方法、以及生物防治。大 量研究表明，很多拮抗微生物及其活性物质对黄曲霉的生长和毒素的产生均有明显的抑制 作用。
[0004]萎缩芽孢杆菌来源广泛，好氧行菌，适应温度范围大，耐盐耐碱也耐酸，同时萎缩 芽孢杆菌现已被作为消毒灭菌工艺的指标菌，因此展开对萎缩芽孢杆菌的更进一步研究与 应用都很有现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于从动物粪便与土壤培养分离优异芽孢杆菌，而后 进行表观与生理生化鉴定后，制作成添加剂形式添加到饲料里进行饲喂效果比较，进而对 效果最佳的菌进行的分子学上的鉴定，确定该有益菌的名称，将其应用于饲料领域。
[0006]本方案采用的制备工艺如下：
[0007] 1.将土壤、羊粪、牛粪等各种动物粪便取样以粉末状在培养基上划线涂布，培养基 成分为：蛋白胨l〇g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2,121°C高压20min 后使用；
[0008] 2.27°C_37°C下培养2-4天，逐步分离培养，当菌落单一，肉眼观测颜色形状一致 时，继续培养三代；
[0009] 3.取三代以后的菌株培养，用接种环蘸取待使用菌株菌悬液，在TSA培养基(酪蛋 白胰酶消化物15.0，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，pH值7.3 ± 0.225 °C)平板划线，适温培养18h-48h，待出现单菌落，观察形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透 明度、菌落及培养基的颜色。表观形态观察参考《常见细菌系统鉴定手册》，菌落表面圆形， 边缘整齐，形状凸起，不透明，白色或者淡黄色时初步确定为芽孢杆菌；
[0010] 4.挑取纯菌落进行革兰氏染色实验以及芽孢染色实验，结果细胞长宽分别为0.5_ 1 ·Oum，2 · 0-4 ·Oum，营养细胞杆状，有的呈链状排列，革兰氏染色菌体呈紫色为阳性;芽孢染 色后呈绿色，芽孢椭圆形，不膨大，中生，进一步确定为芽孢杆菌；
[0011] 5.生化实验(细菌微量生化鉴定管法），用甘油，接触酶反应阳性，能将硝酸盐还原 成亚硝酸盐，能液化明胶，可利用甘露糖发酵，不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵，能 在含胰胨水中生长，能水解淀粉者可鉴定为芽孢杆菌。
[0012] 6.经过耐盐性测定：10 %NaCL培养基中生长;耐酸碱测定:培养基在pH5.5-9菌落 都可以正常生长;温度范围测定:在5-55°C仍可以生长，在无氧条件下不能生长。
[0013] 7.对黄曲霉菌丝生长抑制的实验
[0014]将杆菌培养液各加入培养基中，冷凝后接种在平板上培养的黄曲霉菌碟，以无菌 水为对照，于恒温培养后测量菌落直径。
[0015] 8.对菌丝形态的影响实验
[0016]将黄曲霉孢子分别与杆菌培养液混合培养于液体培养基中，以无菌水为对照，摇 床培养，后显微镜观察黄曲霉菌丝体的形态变化。结果显示杆菌对黄曲霉具有明显抗生作 用。
[0017]本发明还提供一种芽孢杆菌拮抗剂添加到饲料里的制备方法：
[0018] A.将以上单一的几种杆菌用灭菌的生理盐水制成l*105CFU/ml的菌悬液，以4-8% 接种量接种于TSB液体培养基中，27-35°C振荡培养18-24小时；
[0019] B·TSB选择:胰蛋白胨1 · 5 % (g/100ml)大豆蛋白胨0 · 5 % (g/100ml)氯化钠0 · 5 % (g/100ml)用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2,经121°C压力蒸汽灭菌后使用；
[0020] C.在以上培养基中加入膨润土 5-10g/100ml，静置20-30分钟后，离心过滤，将沉淀 物在27-55°C环境中干燥后添加到动物饲料中。
[0021] 抑制黄曲霉最强或者说添加芽孢杆菌的饲料效果最佳的菌采用recA引物、ITS引 物进行PCR扩增，电泳条带清晰，送到送上海立菲生物技术有限公司测序鉴定，经过GenBank 的Blast对比分析，发育树的建立确定该菌为萎缩芽孢杆菌。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023] 1、原料为天然的微生物，来源广泛，无刺激、无残留；
[0024] 2、效果更明显而且其抗性强、无致病性、耐受不良环境等；
[0025] 3、不残留不易引起其它病变，有益菌有益于动物肠道消化。
【附图说明】
[0026] 图1:分离菌的序列与GenBank中收录的登录号为CP010778.1、CP007640.1、 CP002207.1、CP011802.1的萎缩芽孢杆菌相似性比较
[0027]图2:构建基于recA区序列的系统发育树
【具体实施方式】
[0028]实施例1.芽孢杆菌的培养与分离
[0029] 将土壤、羊粪、牛粪等各种动物粪便取样以粉末状在培养基上划线涂布，培养基成 分为：蛋白胨l〇g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水100〇11^，？!17.2，121°(3高压2〇1^11后 使用；
[0030] 27°c-37°c下培养2-4天，逐步分离培养，当菌落单一，肉眼观测颜色形状一致时， 继续培养三代；
[0031] 取三代以后的菌株培养，用接种环蘸取待使用菌株菌悬液，在TSA培养基(酪蛋白 胰酶消化物15.0，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，pH值7.3 ± 0.225°C) 平板划线，适温培养18h-48h，待出现单菌落，观察形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明 度、菌落及培养基的颜色。表观形态观察参考《常见细菌系统鉴定手册》，菌落表面圆形，边 缘整齐，形状凸起，不透明，白色或者淡黄色时初步确定为芽孢杆菌；
[0032] 挑取纯菌落进行革兰氏染色实验以及芽孢染色实验，结果细胞长宽分别为0.5_ 1 ·Oum，2 · 0-4 ·Oum，营养细胞杆状，有的呈链状排列，革兰氏染色菌体呈紫色为阳性;芽孢染 色后呈绿色，芽孢椭圆形，不膨大，中生，进一步确定为芽孢杆菌；
[0033] 生化实验(细菌微量生化鉴定管法），用甘油，接触酶反应阳性，能将硝酸盐还原成 亚硝酸盐，能液化明胶，可利用甘露糖发酵，不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵，能在 含胰胨水中生长，能水解淀粉者可鉴定为芽孢杆菌。
[0034]经过耐盐性测定：10 %NaCL培养基中生长;耐酸碱测定:培养基在pH5.5-9菌落都 可以正常生长;温度范围测定:在5-55°C