仍可以生长，在无氧条件下不能生长。
[0035]实施例2.芽孢杆菌的功能试验
[0036]将初步确定为芽孢杆菌的抑制黄曲霉生长进行实验观测，取lmL各处理芽孢杆菌 培养液于无菌平板中，倾注入10_15mLPDA培养基，摇匀，待培养基凝固后，用直径6mm无菌 打孔器在平板中央打孔，向孔中注入10uL黄曲霉孢子悬浮液(l*105CFU/mL)，以未做任何处 理的无菌PDA培养基为对照，每个处理重复3个PDA平板，在32°C恒温培养箱中培养3-5d，观 察黄曲霉的生长情况，并测定黄曲霉直径，计算抑菌率。计算公式如下：
[0037] 抑菌率％ = 100*(对照组直径-实验组直径/对照直径），抑菌率最高的5个菌留作 黄曲霉拮抗剂，芽孢杆菌培养液对黄曲霉的抑菌率的数据如表1所示：
[0038] 表1:芽孢杆菌培养液各处理组对黄曲霉的抑菌率
[0039]
[0040]将上述分离的几株芽孢杆菌用灭菌的生理盐水制成l*105CFU/ml的菌悬液，以4-8%接种量接种于TSB液体培养基中，27-35°C振荡培养18-24小时；
[0041]TSB培养基:胰蛋白胨1 · 5% (g/100ml)，大豆蛋白胨0· 5% (g/100ml)，氯化钠0· 5% (g/100ml)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2,经121°C压力蒸汽灭菌后使用；
[0042]在以上培养基中加入膨润土 5-10g/100ml，静置20-30分钟后，离心过滤，将沉淀物 在27-55°C环境中干燥后添加到动物饲料中。
[0043] 采用该饲料中饲喂1个月，2个月，3个月8组(每组6只羔羊）羊，对羊体重进行对比 分析(如表2所示）：
[0044] 表2:添加拮抗剂体重变化数据表(单位:kg)
[0046]通过上述试验可以证明抑制黄曲霉最强或者说添加芽孢杆菌的饲料效果最佳的 菌为第4种菌。
[0047]实施例3.芽孢杆菌菌种的鉴定
[0048]对菌株4进行PCR扩增，recA序列的种间相似性程度更低可以替代或补充16SrRNA基因，该序列用于细菌菌种的鉴定或用于区分紧密相关的，广泛用于研究细菌的进化关系， 因此选择recA引物。
[0053] 59 · 0-63 · 0°C退火温度下，94°C预变性lmin，94°C变性 30s，58 · 8°C退火 30s，72°C延 伸30s，34个循环，72°C终延伸7min。
[0054]测序结果为：
[0058]由测序结果可知，分离菌的ITS区序列大小为131bp。将测序结果提呈至GenBank数 据库，进行BLAST比对。经比对后发现，分离菌的序列与GenBank中收录的登录号为 CP010778.1、CP007640.1、CP002207.1、CP011802.1的萎缩芽孢杆菌相似性在98%以上（图 1)，利用DNASTAR.Lasergene.W.l生物医学软件，构建基于recA区序列的系统发育树（图 2) ，进而进一步确定该菌落为萎缩芽孢杆菌的一个种。
[0059]以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种用于饲料黄曲霉的诘抗剂萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)。2. 如权利要求1中所述的饲料黄曲霉诘抗剂萎缩芽孢杆菌(Baci1lusatrophaeus)的 分离培养方法，其特征在于，将土壤、羊粪、牛粪等各种动物粪便取样以粉末状在培养基上 划线涂布，培养基成分为:蛋白胨l〇g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2， 121°C高压20min后使用。3. 如权利要求2所述的芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养条件为:于27°C_37 °C下培养2-4天。4. 如权利要求1所述的芽孢杆菌在拮抗黄曲霉从而抑制毒素产生方面的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为拮抗饲料中的黄曲霉毒产生。6. -种饲料黄曲霉诘抗剂萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)的培养分离方法，其 特征在于： A. 将土壤、羊粪、牛粪等各种动物粪便取样以粉末状在NA培养基上划线涂布； B. 取三代以后的菌株培养，用接种环蘸取待使用菌株菌悬液，在TSA培养基平板划线， 适温培养18h-48h，待出现单菌落，观察形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培 养基的颜色； C. 挑取纯菌落进行革兰氏染色实验以及芽孢染色实验； D. 经过耐盐性测定、耐酸碱测定、生长温度范围测定、需氧性测定试验、生化实验(细菌 微量生化鉴定管法），结果显示菌落表面光滑，不透明，不规则;体紫色，单生或双生，杆状； 好氧生长;生长温度可在5-55°C之间生长;耐盐性强，可在10 %NaCl下生长;最低生长pH为 5.5,最高pH为9。 E. 对黄曲霉菌丝生长抑制的实验 将杆菌培养液各加入培养基中，冷凝后接种在平板上培养的黄曲霉菌碟，以无菌水为 对照，于恒温培养后测量菌落直径。 F. 对黄曲霉菌丝形态的影响实验 将黄曲霉袍子分别与杆菌培养液混合培养于液体培养基中，以无菌水为对照，摇床培 养，后显微镜观察黄曲霉菌丝体的形态变化，结果显示杆菌对黄曲霉具有明显抑制作用。7. -种包含芽孢杆菌拮抗剂的饲料的制备方法，其特征在于： A. 将权利要求1-6中所述的芽孢杆菌用灭菌的生理盐水制成l*105CFU/ml的菌悬液，以 4-8%接种量接种于TSB液体培养基中，27-35°C振荡培养18-24小时； TSB培养基:胰蛋白胨1.5 % (g/ 100ml)，大豆蛋白胨0.5 % (g/100ml)，氯化钠0.5 % (g/l〇〇ml)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2,经121°C压力蒸汽灭菌后使用； B. 在以上培养基中加入膨润土 5-10g/100ml，静置20-30分钟后，离心过滤，将沉淀物在 27-55°C环境中干燥后添加到动物饲料中。
【专利摘要】本发明公开了一种饲料黄曲霉生物拮抗剂及其培养分离方法。芽孢杆菌是自然界广泛存在的一种菌，因其抗性强、无致病性、耐受不良环境等，广泛应用于医疗、工业、农业与卫生等领域，本发明对芽孢杆菌对黄曲霉的抑制与拮抗作用展开研究。首先从羊粪、牛粪等各种动物粪便与土壤进行取样分离芽孢杆菌；对分离菌株进行形态与生化鉴定；随后对各种芽孢杆菌对黄曲霉的抑制与拮抗作用进行比较；将拮抗效果好的芽孢杆菌添加到饲料里，进行饲喂效果比较；最后确定饲料黄曲霉生物拮抗剂——萎缩芽孢杆菌的制备方法。本发明的物质来源广泛，制备工艺简单，更适合用于饲料里的黄曲霉的拮抗与产生毒素的预防。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07, C12N1/02, A23K10/18
【公开号】CN105462889
【申请号】CN201510978164
【发明人】侯勇跃, 李锋, 裴乐
【申请人】内蒙古自治区农牧业科学院, 呼和浩特市亿羊达生物科技有限责任公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月23日