一株铜绿假单胞菌vih2及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，涉及一种微生物，具体地说涉及一株铜绿假单胞菌VIH2及其在通过VI型分泌系统拮抗茄科劳尔氏菌中的应用。
【背景技术】
[0002]青枯病由前科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，是一种严重危害农作物以及水果蔬菜品质和产量的植物病害。目前对于茄科劳尔氏菌的防治主要有一农药为主的化学防治和以产抗菌类化学物质的拮抗菌为主的生物防治。然而，施用农药严重破坏土壤结构，危害人类健康;抗菌类物质是次生代谢产物，只有在特定的培养条件下才会产生，且其容易使病原菌产生抗药性失去作用。
[0003]革兰氏阴性菌可以利用自身的分泌系统向胞外分泌效应蛋白，与其他种属的微生物相互作用，从而使自身获得竞争优势。现在越来越多的人意识到食品安全和环境保护的重要性，效应蛋白因其分泌不需要特定的培养条件且不易使病原菌产生抗药性而被认为是一种具有潜力的控制病原菌的方式。VI型分泌系统(type VI secret1n system，T6SS)是一种作用于原核生物的接触依赖型的分泌系统，具有抑制其他种属细菌繁殖的作用。
[0004]本实验从南京蔬菜所番茄根际土中筛选出一株铜绿假单胞菌VIH2，通过实验发现VIH2能够利用体内的VI分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌的生长。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株铜绿假单胞菌VIH2，该菌能够利用体内的VI分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌的生长。
[0006]本发明的另一个目的是提供上述铜绿假单胞菌VIH2在防治由茄科劳尔氏菌引起的番茄青枯病中的应用。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0008]本发明的措抗菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa VIH2)，于2014年04月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所;分类名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏号CGMCC N0.9075ο
[0009]所述铜绿假单胞菌VIH2菌落较小为淡黄色，表面湿润，不透明，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列，不产芽孢。
[0010]所述铜绿假单胞菌VIH2的生理生化特性是:革兰氏阴性，兼性需氧，化能异养，淀粉水解阴性，明胶水解阳性，柠檬酸盐利用阳性。
[0011]本发明所述的铜绿假单胞菌VIH2培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素;使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖;使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的铜绿假单胞菌VIH2发酵可在30°C，pH7.0的环境下进行。
[0012]本发明所述的铜绿假单胞菌VIH2能够通过接触杀死茄科劳尔氏菌，二者在ΝΑ平板上接触培养24小时后，茄科劳尔氏菌的生物量下降5个数量级以上。如果将VIH2菌株的VI型分泌系统的调控基因ΡΡΚΑ破坏掉，那么，在接触培养24小时后，茄科劳尔氏菌的生物量下降不足2个数量级。这个实验结果证明了该铜绿假单胞菌VIH2能够利用体内的VI分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌的生长。
[0013]本发明所述的铜绿假单胞菌能够有效抑制茄科劳尔氏菌在番茄根系的定殖，但是如果将ΡΡΚΑ基因破坏掉，铜绿假单胞菌抑制茄科劳尔氏菌定殖的效果不明显。
[0014]本实验所述的铜绿假单胞菌在土壤中也可以有效抑制茄科劳尔氏菌的生长，但是如果将ΡΡΚΑ基因破坏掉，铜绿假单胞菌在土壤中不再具有抑制茄科劳尔氏菌的能力。
[0015]上述的铜绿假单胞菌VIH2在利用体内的VI分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌生长中的应用。
[0016]上述的铜绿假单胞菌VIH2在防治由茄科劳尔氏菌引起的番茄青枯病中的应用。
[0017]上述的铜绿假单胞菌VIH2在制备防治茄科劳尔氏菌的菌肥中的应用。
[0018]本发明的有益效果:
[0019]本发明的铜绿假单胞菌VIH2能够利用体内的VI分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌的生长，降低由茄科劳尔氏菌引起的番茄青枯病的发病率。
【附图说明】
:
[0020]图1为本发明菌株VIH2的菌落图
[0021]图2为本发明菌株VIH2对茄科劳尔氏菌的接触与不接触抑制试验结果
[0022]图3为VIH2菌株与VIH2ΛρρΚΑ菌株对茄科劳尔氏菌的抑制试验结果
[0023]图4为VIH2/VIH2ΛρρΚΑ在土壤中对茄科劳尔氏菌的拮抗效果
【具体实施方式】
:
[0024]下面结合附图对本发明更进一步的说明。
[0025]首先准备以下2种培养基。
[0026]1^培养基:胰蛋白胨1(^，酵母粉58，氯化钠1(^，琼脂粉158，蒸馏水10001111，？!17.0，121°C灭菌，20min。
[0027]LB液体培养基:不加琼脂粉，其他条件同上。
[0028]NA培养基:胰蛋白胨5g，酵母粉0.5g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml ,pH 7.0，115°C灭菌，30min。
[0029]ΝΑ液体培养基:不加琼脂粉，其他条件同上。
[0030]将从南京蔬菜所取的番茄根际土挑根过筛后称取10g置于盛有90ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30°C，150r.π?η—1振荡20min，静置lOmin，得到土壤悬浮液。该土壤悬浮液中含有若干种拮抗菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，于30°C恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，-70°C甘油保藏待用。
[0031]实施例1接触抑制试验
[0032]通过平板对峙的方式筛选出接触依赖型的拮抗菌。
[0033]为了方便观察效果，采用带有红色荧光标记的茄科劳尔氏菌进行实验。
[0034]首先将茄科劳尔氏菌接种到含有30ppm庆大霉素的NA液体试管中，180r/min，30°C培养过夜。然后取lml菌液12000rpm离心2min收集菌体，用lml无菌水重悬3次。
[0035]实验1:
[0036]取5yL重悬后的菌液接种到不含任何抗生素的LB平板上，形成茄科劳尔氏菌的菌斑，在菌斑旁边用灭过菌的牙签接种分离纯化后的菌株，观察对峙结果。
[0037]实验2:
[0038]取5yL重悬后的菌液涂布到不含任何抗生素的LB平板上，该平板中央放置0.22μηι的无菌滤膜，在滤膜另一侧用灭过菌的牙签接种分离纯化后的菌株，观察对峙结果。
[0039]由于0.22μπι的无菌滤膜可以使小分子化合物通过却不能让细菌通过，所以接触依赖型的拮抗菌在实验1的条件下具有拮抗作用而在实验2的条件下不再具备拮抗茄科劳尔氏菌的作用。
[0040]通过以上方法筛选出一株接触依赖型的拮抗菌，如图1所示，该菌株形成的菌落为淡黄色，表面湿润，不透明，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列，不产芽孢，命名为VIH2。该菌株在ΝΑ平板上与茄科劳尔氏菌接触培养24小时后，茄科劳尔氏菌的生物量下降5个数量级以上(图2)，表示拮抗作用的发生依赖VIH2与茄科劳尔氏菌的接触。
[0041 ]将上述方法筛选分离出的菌株，经过测序，根据16SrDNA的测序结果，在http: //www.ncb1.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与VIH2的序列用MEGA vers1n 3软件构建VIH2的16SrDNA系统进化树，同时结合b1 log的实验结果，鉴定为铜绿假单胞菌(Rais toniasolanacearum)，同源性为99%。将该菌株于2014年04月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC N0.9075。
[0042]实施例2
[0043]好氧性试验
[0044]把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌，穿刺接种到上述培养基中(必须穿刺到管底)。301培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性需氧菌。试验结果为兼性需氧。
[0045]淀粉水解试