验
[0046]a.培养基及试剂，在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121°C灭菌20min备用。路哥氏碘液:碘片1 g，碘化钾2g，先用少量(3?5mL)蒸馏水溶解碘化钾，现加入鹏片，待鹏完全洛解后，加水稀释至300mL。
[0047]b.菌种培养及结果观察，取菌种点接于平板上，30°C培养2?4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。
[0048]试验结果为淀粉水解阴性。
[0049]明胶水解试验
[0050]a.培养基及试剂，蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2?7.4，分装试管，培养基高度约为4?5cm，121°C灭菌20mino
[0051]b.菌种培养及结果观察，用穿刺法接种在试管中央。在30°C温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。
[0052]试验结果为明胶水解阳性。
[0053]柠檬酸盐的利用
[0054]a.培养基及试剂，柠檬酸钠2g，NaCl 5g,MgS04.7H20 0.2g,(NH4)2.HP04 lg,l%澳百里香酸蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馈水1000mL，pH6.8-7.0，121°C灭菌20min。
[0055]b.菌种培养及结果观察，取幼龄菌种接种于斜面上，30°C培养3-7天，培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者则为阴性。
[0056]柠檬酸盐利用的试验结果为阳性。
[0057]实施例3
[0058]在革兰氏阴性菌的7种蛋白分泌系统中，只有VI型分泌系统是针对原核生物且是接触依赖型的，为了验证是否是VI型分泌系统在起主要作用，我们构建了一个突变菌株VIH2 ΛρρΚΑ。该菌株的ppKA基因被破坏，而ppKA基因是调控VI型分泌系统的关键基因，该基因被破坏意味着VI型分泌系统失活。
[0059]首先，将VIH2菌株/VIH2ΛρρΚΑ菌株接种到含有30ppm卡那霉素的LB液体试管中，180r/min，30°C培养24小时制备VIH2/VIH2 ΛρρΚΑ种子液；同时将茄科劳尔氏菌接种到含有30ppm庆大霉素的ΝΑ液体试管中，180r/min，30°C培养24小时制备种子液。
[0060]然后，从VIH2/VIH2 ΛρρΚΑ种子液中吸取lOOyL接种到含有30ppm卡那霉素的100ml 1^液体培养基中，18(^/1^11，30°(3培养至006()()约为2.5;从茄科劳尔氏菌种子液中吸取100yL接种到含有30ppm庆大霉素的100ml ΝΑ液体培养基中，180r/min，30°C培养至OD600约为2.5。
[0061 ] 最后，用离心机14000r/min离心3min将100ml VIH2/VIH2 ΛρρΚΑ菌液沉淀，用无菌水洗涤3次，再用LB液体培养基重悬；同时用离心机14000r/min离心3min将100ml茄科劳尔氏菌液沉淀，用无菌水洗涤3次，再用NA液体培养基重悬。
[0062]实验1:
[0063]将VIH2菌悬液与茄科劳尔氏菌悬液按1:5比例进行混合培养。
[0064]对照组(CK):先在LB平板上接种10yL的无菌水，然后在上面盖一层0.22μπι的滤膜，最后在滤膜上接种50yL前科劳尔氏菌悬液。
[0065]处理组1:先在LB平板上接种10yL的VIH2菌悬液，然后在VIH2菌悬液上面盖一层
0.22μπι的滤膜，最后在滤膜上接种50yL茄科劳尔氏菌悬液。
[0066]处理组2:先在LB平板上放一层0.22μπι的滤膜，然后将10yL的VIH2菌悬液与50yL茄科劳尔氏菌悬液混匀接种到滤膜上。
[0067]培养24小时后，用平板计数的方法检测茄科劳尔氏菌的生物量变化情况。通过以上实验检测VIH2抑制茄科劳尔氏菌作用的产生是否需要接触。
[0068]实验结果显示，与对照组相比，处理组2中茄科劳尔氏菌的数量级下降5个以上，处理组1中茄科劳尔氏菌的数量级下降不足1个数量级(如图2所示)。结果表明，VIH2菌株是接触依赖型的拮抗菌。
[0069]实验2:
[0070]对照组(CK):茄科劳尔氏菌与无菌水按5:1混合培养。
[0071 ] 处理组1:茄科劳尔氏菌与VIH2菌株按5:1混合培养。
[0072]处理组2:茄科劳尔氏菌与VIH2 ΛρρΚΑ菌株按5:1混合培养。
[0073]培养24小时后，用平板计数的方法检测茄科劳尔氏菌的生物量变化情况。通过以上实验检测拮抗作用的产生是否与VIH2菌体内的VI型分泌系统相关。
[0074]实验结果显示，与对照组相比，处理组1中茄科劳尔氏菌的数量级下降5个以上，处理组2中茄科劳尔氏菌的数量级下降不足2个数量级(如图3所示)。结果表明，VIH2菌株中的VI型分泌系统在拮抗茄科劳尔氏菌时起主要作用。
[0075]实施例4
[0076]本发明对由茄科劳尔氏菌具有拮抗作用，下面通过土壤原位试验进行说明。
[0077]采集南京蔬菜所自然条件下0?20cm土层的新鲜土壤，过5mm筛，每烧杯装土500g，灭菌。
[0078]VIH2/VIH2 ΛρρΚΑ菌悬液:将本发明的VIH2/VIH2 ΛρρΚΑ接种于LB液体培养基，180!'/111；[11，30°(3摇床培养过夜，培养至006()()约为2.5。然后将菌液12000rpm离心5min，再用无菌水重悬。
[0079]KT2440菌悬液:将KT2440接种于LB液体培养基，180r/min，30°C摇床培养过夜，培养至0D6QQ约为2.5。然后将菌液12000rpm离心5min，再用无菌水重悬。
[0080]茄科劳尔氏菌悬液:将茄科劳尔氏菌接种于NA液体培养基，180r/min，30°C摇床培养过夜，培养至0D6QQ约为2.5。然后将菌液12000rpm离心lOmin，再用无菌水重悬。
[0081 ]对照组:将茄科劳尔氏菌悬液与KT2440菌悬液按1:1混合加入到灭菌土中共培养。
[0082]处理组1:将茄科劳尔氏菌悬液与VIH2菌悬液按1:1混合加入到灭菌土中共培养。
[0083]处理组2:将茄科劳尔氏菌悬液与VIH2 ΛρρΚΑ菌悬液按1:1混合加入到灭菌土中共培养。
[0084]然后，分别在第0、3、7、21、35天采样，用平板计数的方法检测茄科劳尔氏菌的生物量变化情况。
[0085]实验结果显示，随着时间的推移，3种处理下的茄科劳尔氏菌的生物量都会下降，但下降的幅度有明显差异。与对照组相比，处理组1的茄科劳尔氏菌生物量下降明显，下降了 1个数量级以上，而处理组2的茄科劳尔氏菌与对照组相比无明显差别(如图4所示)。结果表明，本实验发明的铜绿假单胞菌VIH2可以有效拮抗茄科劳尔氏菌，并且是通过VIH2菌体内的VI型分泌系统起主要拮抗作用。
【主权项】
1.一株铜绿假单胞菌VIH2，于2014年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏号CGMCC N0.9075。2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌VIH2在利用体内的VI分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌生长中的应用。3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌VIH2在防治由茄科劳尔氏菌引起的番茄青枯病中的应用。4.权利要求1所述的铜绿假单胞菌VIH2在制备防治茄科劳尔氏菌的菌肥中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株铜绿假单胞菌VIH2及其应用，该菌株能够通过VI型分泌系统拮抗茄科劳尔氏菌(Ralstonia？solanacearum)，属于分子微生物领域，该菌株于2014年04月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为假单胞菌(Pseudomonas？sp.)，保藏号CGMCC？No.9075。该菌株作为革兰氏阴性菌，体内有VI型分泌系统，它可以利用VI型分泌系统，通过接触的方式抑制茄科劳尔氏菌的生长繁殖。CGMCC No.907520140418
【IPC分类】C12R1/385, C12N1/20, C05F11/08, A01P1/00
【公开号】CN105441355
【申请号】CN201510883985
【发明人】武俊, 葛新成, 魏维, 李 根, 胡锋, 孙明明, 李辉信
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月4日