具有黄瓜CsMADS07基因的表达载体及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜MADS-box基因CsMADS07过表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，其名称来源于4种蛋白质因子MCN(酿酒酵母)、AGAM0US(拟南芥)、DEFICIENS(金鱼草)和SRF(人类)的首字母缩写。这4种蛋白质的N端具有一个由56-58个氨基酸组成的高度保守区结构域，可识别特异的DNA序列，称为MADS-box结构域，简称M结构域。MADS-box转录因子通过通过结合特异的DNA顺式元件来调控基因的时空表达。通过染色质免疫共沉淀、凝胶电泳迀移率变动分析和随机结合位点筛选等实验技术，发现许多MADS-box蛋白的DNA结合片段具有核心序列C( A/T)8G，此核心序列称CArG盒。CArG盒常出现在MADS-box蛋白靶标基因的启动子区域，有时也存在于内含子和3’UTR区域。
[0003]MADS-box基因广泛存在于真核生物中，几乎遍布整个植物界。在番茄、油菜、烟草和矮牵牛等双子叶植物以及玉米、小麦、高粱等单子叶植物中已经发现大量的MADS-box基因。MADS-box基因最主要的功能是参与花器官的形态建成。同时还涉及植物发育的整个过程，包括参与营养生长的调节、子房和种皮发育、根形成、胚形态建成、共生诱导等，如在拟南芥根中优势表达的AGL17，在营养组织中表达的AGL12、AGL19等。Ohto等发现AP2的过量表达使种子变大，并发现该基因对种子大小的调控是通过控制胚胎细胞的数目和大小实现的。AGL12不仅影响拟南芥的开花时间，还控制着根尖分生组织细胞的增殖。在番茄中分离出一个与其成熟相关的MADS基因LeMADS-RIN，在香蕉中分离出一个在香蕉后熟过程中起重要作用的MuMADSI基因。马铃薯根组织中表达的IbMADS3和在营养器官中表达的IbMADS4，在玉米根和花粉中表达的ZmMADS2。大豆AP3类基因GmNMH7基因属在根瘤以及不同发育时期的花中表达，并且发现它在根瘤中的表达受到光周期的调节。是拟南芥GmAGL15在胚胎发育过程中优势表达。通过转基因使其在大豆中过量表达可促进体细胞胚的发育。耧斗菜的FRUITFULL-1ike参与叶的发育，胡椒的CaJOINTLESS基因可以抑制茎的分生组织的生长。
[0004]黄瓜属葫芦科植物，广泛分布于中国各地，为主要的温室产品之一。最近黄瓜全基因组测序的完成标志着黄瓜功能基因组的研究进入了一个全新的阶段。尽管目前与黄瓜重要经济性状相关的基因正在逐渐被克隆，但关于黄瓜MADS-box基因的报道还较少。黄瓜虽属双子叶植物，但不同于拟南芥，黄瓜有雄花、雌花及两性花三种类型的花，而拟南芥仅为两性花。对相关黄瓜CsMADS基因进行功能的解析具有一定的理论和实践意义。我们首先克隆出CsMADS07基因，连到含双35S启动子的过表达载体PHB上获得过表达载体PHB-CsMADS07，转化拟南芥后发现过量表达CsMADS07基因会使得植株的果荚数目增加、花器官形状改变，利用这一特性可以有效地利用到其它物种上来增加植物的产量和改造花卉的形
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【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种黄瓜CsMADS07基因花特异表达载体及及其在花器官改造中的应用，该载体含有黄瓜MADS-box基因CsMADS07，基因的上游连有双35S启动子。
[0006]本发明的上述植物表达载体为PHB_CsMADS07，由下述方法构建而成:
(I)根据CuGI(http://cucumber.genomics.0rg.cn/page/cucumber/index.jsp)上公布的黄瓜CsMADS07的序列(Csa004120)，设计两端引物:
CsMADS07-F:5’-aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCTGAAG-3，
(含Bam HI位点)
CsMADS07-R:5 ’- aaaaGAGCTCTTACCCAAATGATAAAGAAGGGAT-3 ’
(含Sac I位点)。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADS07全长。
[0007](2)回收CsMADS07的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADS07。
[0008](3)使用Bam HI和Sac I酶切pMD18_CsMADS07，回收CsMADS07片段，同时用BamHI和Sac頂每切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB-CsMADS07。
[0009]本发明的另一目的是公开黄瓜CsMADS07在遗传改良中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADS07转基因植株的果荚数量增加，萼片膨大卷曲、萼片异生出类似柱头状的器官，可以应用在生产实践中改造花卉的形状和提高作物的产量。
[0010]
【附图说明】
[0011]图1为本发明中CsMADS07全长扩增后的电泳示意图；
图2为本发明表达载体PHB-CsMADS07的Bam HI和Sac I双酶切电泳检测图；
图3为转基因植株的PCR鉴定图；
图4为过量表达CsMADS07的转基因拟南芥植株的表达分析，其中A为野生型;B-D为转基因植株株系。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0013]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于Τ0Υ0Β0公司，DNaseI购于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。其余试剂均为国产分析纯;仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0014]实施例1:表达载体PHB_CsMADS07的构建
(I)引物设计:根据CuGI (http: //cucumber.genomics.0rg.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黄瓜CsMADS07的序列(Csa004120)，设计两端引物:
CsMADS07-F:5’_ aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCTGAAG-3’(含Bam HI 位点)。
[0015]CsMADS07-R: 5 ’ - aaaaGAGCTCTTACCCAAATGATAAAGAAGGGAT-3 ’(含Sac I位点)。
[0016](2)黄瓜花蕾总RNA的提取
所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm的花蕾lmg，取材后立刻冻到液氨中，采用TRIzol(Invitrogen，USA)试剂法提取总RNA:加1.5 ml Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。12,OOOrpm离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混勾后室温放置15 min04°C12,OOOg离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置30min04°C 12，OOOg离心10 min，弃上清。用Iml 75%乙醇洗涤2次沉淀。4°C 8，OOOg离心5min，弃上清。室温瞭干 10 min。用50uL H20(Rnase free)溶解RNA0
[0017](3)黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成
黄瓜花蕾RNA用DNaseI处理后用于以Oligo(ClT)18为引物的反转录:取RNA 15 uL，加Oligo(ClT)18 luL，混匀，70°C保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M_MLV (200U/uL) luL，总体积20 uL，混匀，42°C保温60min，95°C 1min 灭活M-MLV酶活性，_20°C保存。
[0018](4)CsMADS07 基因的扩增
以CsMADS07-F和CsMADS07-R为引物，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-Plus进行PCR扩增，PCR 反应条件为:94°C 5 min;94 °C 30 s；56°C 30 s；68°C 1.0 min,40个循环;68°C 5 minoPCR产物用1.5%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段与预期大小基本一致(图1)。
[0019](5)CsMADS07片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0020](6)CsMADS07 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μ1、10Χ Taq DNA聚合酶缓冲液2yl、10mM dNTP 2yl、Taq DNA聚合酶2μ1;72°C处理45 min;先加0.18 mL无菌水，再加20μ1 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀2hr ,12, OOO