专利名称：一种培育耐逆植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育耐逆植物的方法。
背景技术：
水资源短缺和土壤盐渍化是全球农业生产面临的严峻事实。由于旱灾频繁，我国 年平均受旱面积达3. 27亿亩，随着全球气候变暖，旱灾将日趋严重，受旱灾威胁农田面积 可能超过7亿亩。据估算，干旱、低温和盐碱等非生物胁迫对作物产量的影响达40%，我国 北方主要粮食产区每年因缺水造成减产700-800亿公斤；季节性干旱在降水量丰富的南方 也频繁发生，如广东每年受旱面积超过750万亩；四川省2006年作物受旱面积达2100万 亩，占播种面积的35%，绝收397万亩，造成直接经济损失达61亿元。水稻作为我国重要的 粮食作物，用水量占农业用水量的70%，因此水资源匮乏及干旱、低温和盐碱等非生物胁迫 已成为影响水稻高产稳产的重要限制因子。植物抗逆机制十分复杂，传统的育种手段对于 作物的抗逆性改良虽有一定效果，但离人们期望的目标还有很大距离。通过生物技术培育 耐逆水稻品种是充分利用我国盐碱地、缓解水资源短缺、保证水稻高产稳产最经济和有效 的途径，对保障农业可持续发展具有重要的现实意义。研究表明，植物受到干旱、低温和盐碱等非生物胁迫后，通过一系列复杂的信号转 导并激活特定转录调控因子，再通过特定的顺式作用元件，调控大量目标基因的表达，最终 提高植物的耐逆性。在提高作物对环境胁迫的分子育种中，传统的单一抗性功能基因的转 基因策略对农作物抗性的改良具有一定的局限性，而改良或增强一个关键的信号转导途径 中的组分，便可能同时调控多个下游抗性功能基因的表达，是提高作物抗逆性的更为有效 方法和途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育耐逆植物的方法。本发明提供的培育耐逆植物的方法，是将OsEILl蛋白的编码基因导入出发植物 中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物；所述OsEILl蛋白是如下(a)或(b)的蛋 白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。所述OsEILl蛋白的编码基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的 DNA分子。上述严格条件可为在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC,0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆 贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证 整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也 可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是 抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述OsEILl蛋白的编码基因可通过pCAMBIA1301-0sEILl导入植物中；所述 pCAMBIAl301-OsEILl是在pCAMBIA 1301的多克隆位点插入所述OsEILl蛋白的编码基因得 到的重组质粒。所述pCAMBIA1301-0sEILl具体可为在pCAMBIA 1301的BamH I和Pmac I 酶切位点之间插入所述OsEILl蛋白的编码基因得到的重组质粒。所述耐逆植物可为耐非生物胁迫的植物。所述非生物胁迫可为干旱胁迫、低温胁 迫(如4°C )等。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞，可获得耐逆能力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达 载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介 导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植 物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如苗木、花草等，如棉花、大豆、油菜、烟 草、百脉根、拟南芥、水稻(如日本晴水稻)、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。所述OsEILl蛋白或其编码基因可应用于培育耐逆植物。本发明中构建了 OsEILl超表达载体并转化水稻愈伤组织，获得一系列超表达的转基因水稻株系。过表达OsEILl能明显地提高水稻幼苗对干旱和低温胁迫的耐性，使植物 在遇到干旱和低温等非生物胁迫时能正常生长，不致胁迫致死。本发明提供的方法可以提 高植物对非生物胁迫的耐逆性，具有广阔的应用前景。
图 1 为 pCAMBIAl301-OsEILl 的结构示意图。
图2为OsEILl超表达植物中OsEILl的表达水平分析结果。图3为OsEILl超表达植物干旱胁迫前后的表型分析；A 培养两周的幼苗；B 干旱 处理后的幼苗。图4为OsEILl超表达植物低温胁迫后的表型分析。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。“日本晴”中国农业科学院作物科学研究所，编号WD-10576。实施例1、OsEILl超表达植物的获得和耐逆性鉴定一、OsEILl 超表达载体 pCAMBIA1301_0sEILl 的构建根据OsEILl 的核苷酸序列(GENBANK ACCESSION NUMBER :DQ153245)设计一对特 异性引物如下上游弓丨物5，-C GG !ggaixcl ATGATGGGAGGTGGTCTGG-3，；下游引物5，-TGCC|CACGT(j TCAGTAGTACCAATTCGAGC-3，。以梗稻 口口口 禾中"曰本 Hf" (Oryza sativa subsp. japonica cv. Nipponbare) 的cDNA为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，用限制性内切 酶BamHI和Pmac进行双酶切，回收酶切产物；用限制性内切酶BamH I和Pmac I双酶 切 pCAMBIAl301 (Cambia，GPO Box 3200，Canberra, ACT 2601，Australia),回收骨架 载体；将所述酶切产物和所述骨架载体进行连接，然后进行测序，测序结果表明，得到了 pCAMBIAl301-OsEILl (在 pCAMBIA 1301 的 35S CaMV 启动子的下游，BamH I 和 Pmac I 酶切 位点之间插入了序列表的序列2所示的OsEILl)。pCAMBIAl301-OsEILl的结构图见图1。二、OsEILl超表达植物的获得1、将 pCAMBIA1301-0sEILl 通过电转化方法导入农杆菌 LBA4404 (http //www, cbs. knaw. nl/, NCCB bacteria/plasmids database, NCCB number2760)，HSJiiiH干胃。2、根癌农杆菌介导的OsEILl超表达水稻的获得用步骤1的重组农杆菌菌液浸染“日本晴”水稻愈伤组织；将浸染的愈伤在无菌的 滤纸上吸干，再转到共培养基上24°C暗培养2-4天；清洗的愈伤组织转到含潮霉素的选择 培养基上进行抗性筛选；经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基培养7-10天后再转到分 化培养基进行光照培养；待小苗长至2-4cm时转到装有生根培养基的试管中生长2-3周， 生长良好的小苗经2-3天的炼苗后便可移栽到温室中(TciR )。得到3株阳性小苗(T1-8、 T2-UT1-6)。分别将小苗传代，得到T1代。分别取2周的野生型水稻(日本晴)和1\代水稻幼苗，提取mRNA进行反转 录，获得cDNA后通过荧光定量PCR技术分析水稻中OsEILl的表达水平(上游引物 5，-AGCACGGAGAACAAGCCAT-3，；下游引物5，-GTTGAAACCAGAGCCGAACC-3，)。将野生型水 稻中OsEILl的表达量作为1，Tl-8、T2-1、T1-6三个株系中OsEILl的表达水平如图2所 示。结果表明Τ1-8、Τ2-1、Τ1-6均为OsEILl超表达植物，OsEILl的表达量是野生型水稻的2. 5-3. 8倍，表明该基因在转基因水稻中的表达得到明显的提高。三、OsEILl超表达植物对非生物胁迫的耐性T1代表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株。将3株阳性小苗(Τ1-8、Τ2-1、Τ1_6)的种子(T1代)使用潮霉素进行选择萌发，萌 发3天后将幼苗转至土壤后开展以下抗逆性功能分析；将野生型水稻(日本晴)的种子采 用相同处理，作为对照；每种植物取30个植株，试验重复三次，结果取平均值。1、耐旱性鉴定对生长2周的水稻进行干旱处理(连续8天不浇水)，然后观察水稻叶片。水稻干 旱处理前后的照片见图3。在干旱8天后，野生型水稻的叶片全部萎焉；OsEILl超表达水稻 呈现出正常的生长状态，叶片舒展。结果表明OsEILl提高了水稻的耐旱性。2、转OsEILl基因植株对低温耐性的鉴定对生长2周的水稻进行低温处理(4°C处理2天)，观察水稻叶片。水稻低温处理 后的照片见图4。4°C处理2天后，野生型水稻的叶片出现萎焉；OsEILl超表达水稻呈现出 正常的生长状态。结果表明OsEILl提高了水稻对低温的耐性。
权利要求
一种培育耐逆植物的方法，是将OsEIL1蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物；所述OsEIL1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述OsEILl蛋白的编码基因是如下1)或 2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述OsEILl蛋白的编码基因通过 pCAMBIA1301-0sEILl 导入植物中；所述 pCAMBIA1301_0sEILl 是在 pCAMBIA 1301 的多克隆 位点插入所述OsEILl蛋白的编码基因得到的重组质粒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述pCAMBIA1301-0sEILl是在 PCAMBIA1301的BamH I和Pmac I酶切位点之间插入所述OsEILl蛋白的编码基因得到的重 组质粒。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述耐逆植物为耐非生物胁迫 的植物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述非生物胁迫为干旱胁迫或低温胁迫。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述低温为4°C。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述出发植物为双子叶植物或 单子叶植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述出发植物为棉花、大豆、油菜、玉米、水 稻或烟草，优选日本晴水稻。
10.OsEILl蛋白或其编码基因在培育耐逆植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种培育耐逆植物的方法。本发明提供的培育耐逆植物的方法，是将OsEIL1蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐逆性高于出发植物的转基因植物；所OsEIL1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。将OsEIL1蛋白的编码基因导入植物，能明显地提高植物对非生物胁迫的耐逆性(如干旱和低温胁迫)，使植物在遇到非生物胁迫时能正常生长，不受胁迫致死。本发明提供的方法可以提高植物对非生物胁迫的耐逆性，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/29GK101831436SQ201010116830
公开日2010年9月15日 申请日期2010年3月2日 优先权日2010年3月2日
发明者万丽云, 张执金, 张海文, 权瑞党, 黄荣峰 申请人:中国农业科学院生物技术研究所