专利名称：与植物耐寒性及抗病性相关的基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种与植物耐寒性抗病相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及拟南芥的一种与耐寒性抗病相关的基因及其编码蛋白的应用。
背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几大难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增 加农业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会碰到需要克服逆境限制或减轻逆境 危害的问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增 产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。随着人类的经济发展和人口膨胀，人们对环境的破坏也越来越严重，从而引起了 气候的变化，比如南方的冻雪，北方气候的短期内的巨变，这些因素严重地影响了农业生 产。目前，在冬季的蔬菜都是采用大棚技术，增加了农民的生产成本，而且也增加了农 药的使用量，影响了蔬菜的食用安全性，通过基因工程技术提高蔬菜本身对低温以及病原 菌的抗性，是非常有用及有必要的。拟南芥是一种典型的模式植物，其作用与实验鼠相当，广泛用于植物遗传学、发育 生物学和分子生物学的研究。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的 任何发现都能应用于其它植物研究，专家指出，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农 作物产量的方法。拟南芥共有约1. 3亿个碱基对，2. 9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚， 利用突变技术研究基因功能已成为一种有效方法。对双子叶植物(主要是拟南芥)而言， EMS诱变是主要途径，并且已经得到大量EMS诱变突变体。通过对突变体的研究，获知了一 些逆境基因的功能，如ICEl (抗寒)，SOSl (盐敏感)，SNCl (抗病)，LEW2 (抗旱)等。
发明创造内容本发明的目的是提供一种与植物耐寒性及抗病性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的与植物耐寒性及抗病性相关的蛋白，名称为CHS3m，来源于EMS诱变 后的哥伦比亚生态型的拟南芥(拟南芥atchs3突变体)，是下述1)或2)所述的蛋白质1)序列表中的SEQ ID No . 2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID N2 . 2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。序列表中序列2氨基酸残基序列是由1422个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明提供的与植物耐寒性和抗病性相关的蛋白的编码基因，其核苷酸序列是下 列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID Na 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID Na 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中序列SEQ ID No 1的DNA序列由5339个碱基组成，该基因的读码框为自 5’端第1位到第5339位碱基，含有9个内含子，分别为自5’端第417位到第762位碱基； 自5，端第1889位到第1978位碱基；自5，端第2276位到第2360位碱基；自5，端第3132 位到第3228位碱基；自5，端第4332位到第4420位碱基；自5，端第4542位到第4650位 碱基；自5，端第4732位到第4827位碱基；自5，端第4945位到第5029位碱基；自5，端 第5243位到第5315位碱基。上述与植物耐寒性和抗病性相关的蛋白的编码基因，其cDNA基因的核苷酸序列 是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 5的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID Na 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID Na 5限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列。序列表中SEQ ID Na 5编码序列表中序列1所示的蛋白序列。含有本发明基因的表达载体、细胞系及扩增CHS3m中任一片段的引物对均属于本 发明的保护范围。扩增CHS3m中任一片段的引物对的序列可为引物1 :5，GTC GAC GAGATG GAACCA CCA GCT GCT C 3，(SEQ ID Ns :3)和引物 2 :5，GGA TCC TCA TAA CTTTGAATA TTG TGG AGT C 3，(SEQ ID Na 4)为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加 工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单 子叶植物，也可以是双子叶植物。实验证明，本发明的蛋白和其编码基因具有耐寒和抗病功能，可用于培育抗冻和/ 或抗病植物新品种以及抗冻抗病植物新品种，具有重要意义。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为WT和chs3突变体的表型分析图2为CHS3的图位克隆图3为35S:CHS3m转基因植株的验证和表型分析
具体实施例方式实施例1、植物耐寒性及抗病性相关的基因CHS3的克隆及其功能验证一、植物耐寒性及抗病性相关的基因CHS3及其编码蛋白的获得1、突变体chs3的耐寒性和抗病性分析拟南芥 atchs3 突变体最早是 Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)购买获得(Stock No :CS8000)，按照下述的方法对突变体的形状与野生型拟南芥(Col)进行对比分析将野生型拟南芥(Col，ABRC)和突变体chs3的种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在 1/2MS培养基上，分别放入22°C和16°C培养箱中生长。 结果如图1所示，结果表明，22°C直接生长两周后的植物野生型和突变体没有任 何差异(图1A)，16°C直接生长三周后的植物野生型生长正常，突变体植株显示出了植株矮 小，叶子向下卷曲的表型(图1B)。图IA和图IB中的Col表示野生型拟南芥，chs3为突变 体 atchs3。将16°C直接生长三周后的野生型(Col)和突变体chs3(本文中突变体chs3， chs3-l均为拟南芥atchs3突变体)植株，移入低温冰箱(型号为RuMED4001，温差 士 0.5°C)进行抗冻性分析。4°C开盖放置2-3h蒸发皿内和植株表面的水滴，之后从-1°C 开始每小时降一度降温至_6°C放置2h-4h后取出，在4°C黑暗12h恢复培养，然后正常培养 条件4d后，计算存活率(叶片是否有绿色定为成活标准)并照相。结果如图1中C和D所 示，将野生型和突变体atchs3的成活率进行比较后发现，突变体明显抗冻。图1中C和D 中的Col表示野生型拟南芥，chs3-l为突变体atchs3。将野生型(Col)和突变体atchs3的种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在1/2MS上， 分别放入22°C培养箱生长一周后将小苗移入土中，分别放入22°C和16°C温室生长10天 后进行接菌实验。具体方法为将培养至OD6tltl为0. 2的致病菌株Pseudomonassyringae pv tomato (Pst)DC3000(Dong X, Mindrinos Μ,Davis KR,Ausubel FM(1991)Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringaestrains and by a cloned avirulence gene. Plant Cell 3:61-72)通过沾苗的方法接入 22°C和 16°C培养的野生型和突变体的植株，分别取接菌后Od和3d的植株研磨稀释测定植株中的 Pseudomonas syringae pv tomato (Pst)DC3000 数目。结果如图 1 中 E 所示，22°C 的野生型 和突变体的抗病性没有什么明显的差异，而16°C的突变体相对于野生型来说具有明显的抗 病性。图1中C和D中的Col表示野生型拟南芥，chs3-l为突变体atchs3。2、植物耐寒性及抗病性相关的基因的获得将突变体atchs3与野生型Ler杂交后得到F2代，挑选16°C下生长矮小的植株构 建图位克隆的群体。经过图位克隆的初步定位得到该突变基因定位于第五条染色体的上 部，经过SSLP标记的进一步定位分析，把突变基因定位于ngal39与ngal51之间，进一步扩 大群体，把该基因定位于MP17-2和MCM23之间，经过测序分析发现突变碱基位于at5gl7890 基因的第5314位(图2A)，由G变为A，这个位点的突变发生在CHS3第九个内含子与外显 子的连接处，导致剪切异常，从而产生一个截断的蛋白CHS3m。该蛋白具有序列表中序列2 的氨基酸序列，是植物耐寒性及抗病性相关蛋白。图2A表示CHS3基因的图位克隆，在图 中，(a)箭头上方的是marker，横线代表第五条染色体的一部分，下方数字代表染色体的位 置(kb) ； (b)括号中的数字代表重组数/总数；(c)CHS3基因被定位到第5条染色体MP17 和MCM23两个BAC之间，(d)这个区域含有的基因从At5gl7850到At5gl7960 ； (e)CHS3基 因结构示意图，黑色框代表外显子，黑线代表内含子，箭头所指处为突变位点。 按照下述方法获得该植物耐寒性及抗病性相关的基因CHS3m 提取突变体atchs3的总DNA，以该总DNA为模板，以引物1和引物2为引物，进行 PCR扩增。引物序列为引物 1 :5，GTC GAC GAG ATG GAA CCA CCA GCT GCT C3，(SEQ ID Na 3)；引物 2 :5，GGATCC TCATAACTT TGAATATTG TGGAGTC3，(SEQ ID Na :4)。将突变体atchs3的种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在1/2MS培养基上，放入22°C培养箱中生长10d，取突变体的一到两株植物放入1. 5ml离心管中加入250ul的genomic DNA extraction buffer (200mM Tris-HCl pH7. 4,250mM NaCl,25mM EDTApH8. 0,0. 7% (v/ v) 二巯基乙醇)，研磨至叶片破碎完全，加入35ul SDS(预先加热熔解)，混勻后65°C温 育15min中，加入75ul 5M KOAC,上下混勻，放在冰上5min，离心，12000rpm, IOmin,将上 清液倒入新的1. 5ml离心管，加入30ul NaOAC和300ul异丙醇，混勻-20 °C 20min,离 心，12000rpm，20min，用70 %的乙醇清洗沉淀，室温晾干，融于200ul的冊buffer (IOmM Tris-HCl ρΗ8· 0)得到 Genome DNA。PCR扩增反应体系为上述提取的 Genome DNA 5ul, IOXPyrobest buffer II 5ul, dNTP Mixture (各 2.5mM)4ul，引物 I(IOuM) 2ul，引物 2 (IOuM) 2ul，Pyrobest DNA Polymerase (5U/ul) 25ul, ddH20 32ul。在 BIO-RAD MyCycler thermalcycler 上进行 PCR0 Pyrobest DNA Polymerase 购于TaKaRa公司，引物在三博远志公司合成。PCR扩增反应程序为94°C 预变性 10min，94°C lmin，56°C lmin，72°C 6min，共计 30 个循环；72°C 延伸 IOmin，将获得的PCR产物，做1 %琼脂糖凝胶电泳。结果扩增得到约5350bp的片段，即为本发明的植物耐寒性及抗病性相关的基因， 将其命名为CHS3m。测序表明该片段具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列表中序列 1的DNA序列由5339个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1位到第5339位碱基，含有 9个内含子，分别为自5’端第417位到第762位碱基；自5’端第1889位到第1978位碱基； 自5，端第2276位到第2360位碱基；自5，端第3132位到第3228位碱基；自5，端第4332 位到第4420位碱基；自5，端第4542位到第4650位碱基；自5，端第4732位到第4827位 碱基；自5，端第4945位到第5029位碱基；自5，端第5243位到第5315位碱基。该基因编 码具有序列表中SEQ ID N2 :2氨基酸残基序列的蛋白质，即抗冻抗病相关基因CHS3m的编 码蛋白CHS3m。3、植物耐寒性及抗病性相关的基因的cDNA的获得将突变体atchs3的种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在1/2MS培养基上，放入22°C 和培养箱中生长10d，取0. Ig的植物，使用液氮在研钵中研磨破碎，移入1. 5ml离心管中， 加入Iml Trizol，室温抽提5min，4°C离心，12000rpm，8min，上清移入新管，加入200ul氯 仿，剧烈混勻，室温放置3min，4°C离心，12000rpm，8min，吸取500ul上层水相放入新管，力口 入500ul异丙醇，颠倒数次混勻，室温沉淀lOmin，4°C离心，12000rpm, 15min,用70%的DEPC 乙醇清洗沉淀两次，吸走管内多余液体，待管内RNA略干时，加入50ul DEPC ddH20。(使用 Invitrogen 公司的 Trizol)取2ul RNA, 2ul (IOuM) oligodT, 8ul DEPC ddH20，70°C 5min，冰上 5min，加入 5ul DEPC dNTP，5ul M-MLV 5 X buffer, Iul M-MLV，42 °C lh，94°C lOmin，此反应在在 BIO-RAD MyCyclerTM thermalcycler上进行，得到突变体的cDNA。(使用Promega公司的M-MLV)。以 该 cDNA 为模板，引物序列为引物 1 :5，GTC GACGAG ATG GAA CCA CCA GCT GCT C 3，(SEQID Na 3)和引物 2 :5，GGA TCCTCA TAA CTT TGAATA TTG TGG AGTC 3，(SEQ ID Na 4)；进 行PCR扩增。PCR 反应体系为lul cDNA，5ul IOXPyrobest bufferll,4ul dNTP Mixture (各 2. 5mM),2ul 引物 1(IOuM)，2ul 引物 2(IOuM)，25ul Pyrobest DNA Polymerase(5U/ul), 36ul ddH20。(Pyrobest DNA Polymerase购于TaKaRa公司，引物在三博远志公司合成)。 在 BIO-RAD MyCycler thermalcycler 上进行如下的 PCR。PCR反应程序为94°C 预变性 10min，94°C lmin，56°C lmin，72°C 5min，共计 30 个循环；72°C 延伸 IOmin,将获得的PCR产物，做1 %琼脂糖凝胶电泳，得到突变基因CHS3m的cDNA。结果表明 扩增得到全长为4. 3kb CHS3m的cDNA，经测序表明，该cDNA具有序列表中序列5的核苷酸 序列。二、本发明的植物耐寒性及抗病性相关的蛋白的转基因功能验证利用Sal I和BamH I内切酶进行酶切上述扩增的cDNA PCR产物，将其连接到双元 载体 pGreen0029 (该质粒购自 http: //www, pgreen. ac. uk/a pis fr. htm)的 Xho I 禾口 BamH I酶切位点，测序验证序列的正确性，命名为35S:CHS3m。将该35S:CHS3m 载体导入农杆菌 GV3101(Koncz C, Schell J (1986) The promoter ofTL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried bv anovel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet 204 383-396.)，然后利用蘸花法将35S:CHS3m载体转入AtCHS3缺失突变体或野生型Ler植 株(Arabidopsis BiologicalResource Center (ABRC))，采用 10mg/L 的 Basta 筛选得到转 35S:CHS3m突变体植株和转35S:CHS3m野生型Ler植株，因为35S:CHS3m突变体植株和转 35S CHS3m野生型Ler植株的表型非常相似，所以以下的描述均以转35S CHS3m野生型Ler 植株(简称转35S:CHS3m植株)为例。将鉴定阳性的转35S:CHS3m植株的种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在1/2MS培 养基上，分别放入16°C培养箱中生长。三周后，查看表型，以生长在16°C未转基因的野生 型Ler植株为对照，结果表明，生长在16°C下的野生型Ler拟南芥植株生长较为正常，而转 35S:CHS3m植株呈现出生长抑制的表型，图3中A中的WT表示16°C时的野生型Ler拟南芥， 35S:CHS3m为16°C时的转35S:CHS3m野生型Ler拟南芥植株。提取筛选到的有表型的阳性植株两个株系转35S:CHS3m野生型Ler拟南芥株系 及相应的野生型Ler，分别取0. Ig的植物组织，使用液氮在研钵中研磨破碎，移入1. 5ml离 心管中，加入 Iml Trizol (Invitrogen 公司)，室温抽提 5min，4°C 离心，12000rpm, 8min, 上清移入新管，加入200ul氯仿，剧烈混勻，室温放置3min，4°C离心，12000rpm, 8min,吸取 500ul上层水相放入新管，加入500ul异丙醇，颠倒数次混勻，室温沉淀10min，4°C离心， 12000rpm, 15min,用70 %的DEPC乙醇清洗沉淀两次，吸走管内多余液体，待管内RNA略干 时，加入 50ul DEPC ddH20。使用Promega公司的M-MLV进行反转录获得cDNA，具体方法为取2ul RNA, 2ul (IOuM) oligodT，8ul DEPC ddH20,70 "C 5min,冰上 5min，力卩入 5ul DEPC dNTP，5ul M-MLV 5 Xbuffer, Iul M-MLV, 42 "C lh，94 "C IOmin,此反应在在 BIO-RADMyCyclerTM thermalcycler上进行，得到转基因植株与相应野生型的cDNA。
将上述的得到的cDNA，稀释10倍，作为模板，取2ul cDNA, 1, 5ul 10XPCR buffer, 1. 2ul dNTP Mixture (各 2. 5mM) ,0. 6ul 弓| 物 3 (IOuM) ,0. 6ul 弓I 物 4 (IOuM)，0· 2ultaq E(5U/ul, taq E 购于 TaKaRa 公司)，9ul ddH20。 在 BIO-RAD MyCyc 1 er thermal cyc 1 er上进行半定量PCR。PCR弓丨物为弓丨物3 5' -TTTAAATGTGCACGAGGCTCTG-3 ‘禾口 引物 4 -TGAATGCATCGTGTTTGACATC 3', 用 TOB8 做内标，弓I 物为 TUB8-F :5，GAGTCAATG TCTACTACAACG 3', TUB8-R 5’ CTCTGTATTGCTGTGATCCAC3’。 反应程序为941预变性31^11，9410. 5min,56°C 0. 5min,72°C lmin，共计 30 个循 环；72°C 延伸 3min。将获得的PCR产物，做琼脂糖凝胶电泳，得到的胶图上(图3中B)可以看出， 转基因植株和野生型植株中的TUB8的表达量没有明显的差异，而在转35S:CHS3m植株中， CHSm的表达量明显高于野生型，因此转基因植株中该基因确实得到了过量表达。图3B中， WT表示野生型Ler拟南芥，#1和#2为两个转35S CHS3m野生型Ler株系(#1和#2分别是 两个独立的转35S:CHS3m野生型Ler株系)。将上述16°C直接生长三周后的野生型Ler拟南芥(WT)、转35S:CHS3m植株，移入 低温冰箱(型号为RuMED4001，温差士0. 5°C )进行抗冻性分析。4°C开盖放置2_3h蒸发 皿内和植株表面的水滴，之后从-1°C开始每小时降一度降温至_6°C放置2-4h后取出，在 4°C黑暗12h恢复培养，然后正常培养条件4d后，计算存活率(叶片是否有绿色定为成活标 准)并照相。转35S:CHS3m植株具有明显的抗冻性(图3中C)，转35S: CHS3m植株在_6°C 处理后的成活率显著高于野生型Ler图3中D)。图3C-D中的WT表示野生型Ler拟南芥， 35S:CHS3m 为转 35S:CHS3m 植株。将野生型(WT)和转35S:CHS3m植株的种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在1/2MS 上，分别放入22°C培养箱生长一周后将小苗移入土中，分别放入22°C和16°C温室生长10 天后进行接菌实验。具体方法为将培养至0D_为0. 2的致病菌株Pseudomonassyringae pv tomato (Pst)DC3000通过沾苗的方法接入22°C和16°C培养的野生型和转35S:CHS3m 植株，分别取接菌后Od和3d的植株研磨稀释测定植株中的Pseudomonassyringae pv tomato(Pst)DC3000 数目。 具体的实验方法将野生型Ler拟南芥(WT)和转35S:CHS3m野生型Ler拟南芥的 种子经过次氯酸钠的灭菌后，铺在1/2MS上，分别放入22°C培养箱生长一周后将小苗移入 土中，分别放入22°C和16°C温室生长10天后进行接菌实验。挑取Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) DC3000划板于加有50mg/L的卡那霉素的KB固体培养基(Bacto Proteose Peptone No. 329g/l, K2HPO4 · 3H20 1. 96g/L，甘油 8ml/L, MgSO4 · 7H20 1. 52g/L，琼脂 15g/ L ；培养基购于BD公司)上，28°C，培养2天，从板上刮取一些Pseudomonas syringae pv tomato (Pst)DC3000，悬在在Iml的液体KB培养基(KB固体培养基未添加琼脂)中，吸取 IOOul涂到一个新加有50mg/L的卡那霉素的KB固体培养基上，28°C，培养2天，加入5ml IOmM MgCl2把板上的菌洗下来移入一个50ml的离心管中，用IOmM MgCl2稀释至一定浓度 测量0D600，直至稀释到0D600 = 0. 2加入0. 025% Silwet L-77，将加好的菌液倒入培养 皿，分别侵染植株，覆盖lh，揭开薄膜，取Od和3d的植株，进行称重研磨，用IOmM MgCl2做 梯度稀释，涂在50mg/L的卡那霉素的KB固体培养基上，28°C，培养40h，数培养基上菌体的数目，用EXCEL计算得出菌体的log (10)，并进行作图分析。 结果如图3E所示，结果表明，22 0C的野生型Ler拟南芥和转35S CHS3m野生型Ler 拟南芥的抗病性没有什么明显的差异，而16°C的转基因植株体内的Pseudomonassyringae pv tOmatO(PSt)DC3000的数目明显低于野生型，说明转基因植株具有明显的抗病性。图3E 中的WT表示野生型拟南芥，35S CHS3m为转35S CHS3m植株。
权利要求
一种蛋白，是下述1)或2)所述的蛋白质1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述编码基因，其基因组基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之1)序列表中SEQID Na 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID N2 :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
4.根据权利要求2所述的编码基因，其cDNA基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之1)序列表中SEQID Na 5的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID N2 :5限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
5.含有权利要求2-4中任意一项所述基因的重组表达载体、重组工程菌或转基因细胞系。
6.扩增权利要求2-4中任意一项所述基因任一片段的引物对。
7.根据权利要求8所述的引物对，其特征在于所述引物对为序列表中SEQID No 3 和 SEQ ID Na :4。
8.权利要求2-4中任意一项所述基因在培育耐寒性和/或抗病性提高的转基因植物中 的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述抗病性对 Pseudomonassyringae pv tomato 弓|起的病害的抗病性。
全文摘要
本发明公开了一种与植物耐寒性和抗病性相关的蛋白及其编码蛋白与应用。该蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID№2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。本发明的基因可用于培育耐寒植物和/或抗病植物新品种，具有重要意义。
文档编号C12N5/10GK101805398SQ201010116828
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月2日 优先权日2010年3月2日
发明者张晓燕, 杨海便, 杨淑华 申请人:中国农业大学