培育表达shTRAIL植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及培育表达ShTRAIL植物的方法。
【背景技术】
[0002] 药用蛋白质的生产方式主要有微生物发酵、昆虫和哺乳动物细胞培养、转基因动 物等传统生产系统。植物生物反应器是指利用植物系统，包括细胞、组织和器官，以及整株 植物来生产具有应用价值的生物制品（如人或动物用疫苗、抗体、激素等），已成为农业和 生物工程制药领域生产目的蛋白的理想载体。
[0003] 具体而言，植物生物反应器生产药用蛋白主要具有以下优势：
[0004] 1、成本低、易大规模生产：相对于微生物和昆虫细胞、哺乳动物细胞在发酵培养时 所需要的培养基和复杂培养条件而言，一旦获得目的蛋白高表达、遗传稳定的转基因植物， 则目的蛋白的生产只需要光照、土壤、水分等条件，生产成本较低、易于大规模生产且环境 友好。据估计，在目的蛋白表达量占干种子重量的1%且目的蛋白回收率为50%的条件下， 植物表达系统生产蛋白质的成本分别为微生物表达系统和哺乳动物表达系统的2-10 %和 0? 1%〇
[0005] 2、安全性好：动物细胞源性生物制品由于其原料来源和工艺流程的特殊性，可能 在生产过程中引入毒素、病原体和其它的有毒物质且难以去除。与人们对动物源性生物制 品可能由于原料来源而污染有病原微生物的担忧不同，由于未发现人与植物共患病的病原 微生物，且植物原料尤其是种子可耐受严格的表面消毒，因此植物源性的药用蛋白具有较 高的安全性。
[0006] 3、原料耐贮存：利用微生物、昆虫细胞及哺乳动物细胞表达系统，待目的蛋白积累 至适宜浓度后，需尽快进行下游工艺流程，原料无菌、保鲜等操作工艺复杂且增加成本。相 对而言，在谷类作物的种子中表达目的蛋白，种子经收获、干燥处理后，蛋白酶活力较低、生 命活动暂停，目的蛋白能够在室温下贮存很长时间而不显著降低活性，能够增强生产工艺 的灵活性。
[0007] 4、较完善的翻译后修饰系统：原核表达系统具有遗传操作简单、生长迅速、表达量 高、易于大规模发酵生产的优势。历史上第一款重组蛋白质药物即是由基因泰克公司利用 大肠杆菌表达的胰岛素产品。然而，由于原核细胞结构简单，一些对蛋白质活性至关重要的 翻译后修饰，如：信号肽切割、前肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化可能无法完成， 结果造成原核表达的一些复杂的药用蛋白质可能由于无法进行正确的折叠、加工而导致生 物学活性降低。因此，微生物表达系统一般仅用于表达一些简单的药用蛋白，例如：胰岛素、 干扰素、生长激素等。
[0008] 鉴于原核表达系统在翻译后修饰能力上的缺陷，科研人员开展了哺乳动物细胞、 酵母、真菌、昆虫细胞和转基因动物等表达系统的研究工作。发现其存在着下列问题：发酵 成本高、产量低、分泌表达困难、不正确的翻译后修饰、难于大规模生产、病毒或朊病毒污染 等问题。
[0009] 植物相对于酵母或大肠杆菌表达系统的一个主要优势是具有实现绝大多数蛋白 质类药物生物活性和药代动力学所必需的翻译后修饰能力，如：糖基化、酰基化、信号肽的 去除、寡聚化等。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是提供融合蛋白。
[0011] 本发明提供的融合蛋白，其包括shTRAIL蛋白及位于其N端的信号肽，所述 shTRAIL蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第29-33位氨基酸残基。
[0012] 上述的融合蛋白中，所述信号肽为PAH-L或PR-S ;
[0013] 所述PAH-L的氨基酸序列为序列表中序列2第1-20位氨基酸残基；
[0014] 所述PR-S的氨基酸序列为序列表中序列8第1-25位氨基酸残基。
[0015] 上述的融合蛋白中，所述融合蛋白还包括位于所述shTRAIL蛋白C端的分选信号 蛋白；
[0016] 所述分选信号蛋白具体为AFVY或KDEL ;
[0017] 所述AFVY的氨基酸序列具体为序列4第202-205位氨基酸残基；
[0018] 所述KDEL的氨基酸序列具体为序列6第202-205位氨基酸残基。
[0019] 上述的融合蛋白中，所述融合蛋白为如下1)-6)中任一种：
[0020] 1)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PAH-L和shTRAIL ;
[0021] 2)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PAH-L、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY ;
[0022] 3)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PAH-L、shTRAIL和分选信号蛋白KDEL ;
[0023] 4)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PR-S和shTRAIL组成；
[0024] 5)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PR-S、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY ;
[0025] 6)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PR-S、shTRAIL和分选信号蛋白KDEL。
[0026] 上述的融合蛋白中，1)所示的融合蛋白为序列2所示的蛋白或将序列表中序列2 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功 能由序列2衍生的蛋白质；
[0027] 2)所示的融合蛋白为序列4所示的蛋白或将序列表中序列4所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列4衍生的蛋 白质；
[0028] 3)所示的融合蛋白为序列6所示的蛋白或将序列表中序列6所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列6衍生的蛋 白质；
[0029] 4)所示的融合蛋白为序列8所示的蛋白或将序列表中序列8所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列8衍生的蛋 白质；
[0030] 5)所示的融合蛋白为序列10所示的蛋白或将序列表中序列10所示的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列10衍生 的蛋白质；
[0031] 6)所示的融合蛋白为序列12所示的蛋白或将序列表中序列12所示的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列12衍生 的蛋白质。
[0032] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0033] 编码上述融合蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围，其具体是如下1)_8)中任 一种的DNA分子：
[0034] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0035] 2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
[0036] 3)编码区为序列表中序列5所示的DNA分子；
[0037] 4)编码区为序列表中序列7所示的DNA分子；
[0038] 5)编码区为序列表中序列9所示的DNA分子；
[0039] 6)编码区为序列表中序列11所示的DNA分子；
[0040] 7)在严格条件下与1)-6)任一限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的 DNA分子；
[0041] 8)与1)-6)任一限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0042] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5 % SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2 X SSC，0? 1 % SDS 和 1 X SSC，0? 1 % SDS 各洗膜一次。
[0043] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0044] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备 促进肿瘤细胞凋亡产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0045] 或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培 育表达shTRAIL蛋白的植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0046] 本发明另一个目的是提供一种培育表达shTRAIL蛋白的转基因植物的方法。
[0047] 本发明提供的方法，为将编码上述融合蛋白的DNA分子导入目的植物，获得表达 shTRAIL蛋白的转基因植物。
[0048] 本发明的第三个目的是提供一种制备促进肿瘤细胞凋亡产品的方法。
[0049] 上述方法中，为提取上述方法制备的表达shTRAIL蛋白的转基因植物的总蛋白， 即得到促进肿瘤细胞凋亡产品。
[0050]本发明的实验证明，为了实现shTRAIL的高水平表达，本研究确定使用两种信号 肽（PR-S来源信号肽、PHA-L来源信号肽）、两种蛋白分选信号（AFVY、KDEL)进行信号序列 组合，以造成目的蛋白的三种亚细胞靶向部位一一质外体、内质网和蛋白质贮藏型液泡，并 比较不同亚细胞靶向对目的蛋白表达量的影响。经过对拟南芥1代转基因植株叶片和种 子、烟草代转基因种子的目的蛋白ELISA检测和表达量数据的统计分析，本研究发现使 用PHA-L来源的信号肽将目的蛋白靶向至质外体这一策略最有利于shTRAIL的高表达，其 在转基因拟南芥T 3代种子中的表达量为442. 29pg/mL。同时还发现，shTRAIL在种子中的 丰度高于叶片，说明种子是理想的目的蛋白表达器官。该研究结果，可为shTRAIL在烟草和 陆地棉中的表达提供参考。
[0051] 提取目的蛋白shTRAIL表达量较高的烟草转基因株系的总蛋白，以野生型烟草总 蛋白为对照，检测shTRAIL对人大细胞肺癌细胞NCI-H460的增殖抑制效果，表明植物源性 的shTRAIL具有生物学活性，能够抑制NCI-H460的增殖。本研究还在陆地棉中进行了组成 型启动子和种子特异性启动子驱动shTRAIL表达的尝试，证明该蛋白可以陆地棉为转基因 受体材料进行表达，为将来开展陆地棉种子植物生物反应器、提高陆地棉的经济价值奠定 了基础。
【附图说明】
[0052] 图1为融合蛋白示意图。
[0053] 图2为shTRAIL转基因拟南芥PCR鉴定的部分结果。
[0054] 图3为shTRAIL转基因拟南芥PCR鉴定的部分结果。
[0055] 图4为不同信号序列组合的shTRAIL表达量。
[0056] 图5为烟草源性shTRIAL的Western blot检测。
[0057] 图6为转基因烟草PCR的鉴定结果。
[0058] 图 7 为 GV3101 (pEXPR-PPvphas: : shTRAIL-211)转基因陆地棉的 PCR 检测。
[0059] 图8为pEXPR-PGh a GLOA: : shTRAIL-211转基因烟草不同株系shTRAIL的表达 量。
【具体实施方式】
[0060] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0061] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0062] 拟南芥（col-0)记载在如下文献中：拟南芥PMRP的表达特性及功能分析，中国农 业科学，2014, 47 (15) : 3094-3102,以下也称为野生型拟南芥。
[0063] 本氏烟草（N. benthamiana)NC89记载在如下文献中：同步抑制FAD2与FatB基因 提高烟草种子油酸组分含量的研究；西北植物学报，2015, 35(2) :0245_0251，以下也称为野 生型烟草。
[0064] 陆地棉（Gossypium hirsutum)品种'河字 312'（Coker312)，记 载在如 下文南犬中：Effects of hygrom