癌性疾病调节抗体141205-05的制作方法

专利名称：癌性疾病调节抗体141205-05的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和制备，以及这些 CDMAB单独地或与一种或多种CDMAB/化疗剂联合在治疗和诊断方法 中的应用。本发明还涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。
背景技术：
TROP-2是表达于大多数癌以及某些正常人组织的细胞表面糖蛋 白。其最初被定义为由针对人绒毛膜癌细胞系BeWo的两种鼠科单克 隆抗体所识别的分子，所述细胞系BeWo识别在人滋养层细胞上的抗 原(Faulk 1978)。相同的分子由其它研究者独立地发现，这产生了描述同 一抗原的多个名称。因此，TROP-2还被称为GA733-1和上皮糖蛋白-1 (EGP-1) (Basu 1995, Fomaro 1995)。
TROP-2基因是无内含子的基因，其被认为通过经由RNA中间物的 同源基因GA733-2(还被称为J:发潜蛋冷-2、五/ C4M和7h / -7)的反转录 转座(retroposition)而形成。TROP-2基因已被定位于染色体lp32 (Calabrese 2001)。 TROP-2蛋白组分的分子质量为约35千道尔顿。其质量可由其细 胞外结构域的异源N连接糖基化而增加11至13千道尔顿。在所述细胞 外结构域中存在很多半胱氨酸残基，所述残基能够形成二硫键位点。 TROP-2是蛋白激酶C的底物，所述蛋白激酶C是依赖Ca"的蛋白激酶， 并且已表明其细胞内的303位丝氨酸残基是磷酸化的(Basu 1995)。还表 明TROP-2与抗-TROP-2抗体的交联转导钙信号，表现为细胞质的Ca2+ 的升高(Ripani 1998)。尽管迄今为止还没有识别出任何生理配体，这些数 据支持信号转导是TROP-2的生理功能。近来，TROP-2表达与癌症之间 的关系已被表明，因为7T 0尸-2被确认为一组基因的成员，所述基因在使 用cDNA微陈列技术的大规模基因表达分析中，被报道在卵巢浆液性乳 头状癌中相对于正常卵巢上皮细胞最高度地过表达(Santin 2004)。已通过免疫组织化学(IHC)和流式细胞术研究、使用许多不同
TROP-2抗体阐明了 TROP-2的表达谱。通过小鼠对人绒毛膜癌细胞系 BeWo的免疫产生抗-TROP-2抗体162-25.3和162-46.2，并且研究了所 述抗体对一 系列的肿瘤和淋巴细胞系及外周血单个核细胞的反应性。在
该研究中，两种抗体均表现出滋养层特异性，在间接免疫荧光FACS分 析中，所测试的4种绒毛膜癌细胞系中的3种被染色而其它淋巴或肿瘤 细胞系(代表纤维肉瘤、宫颈肉瘤、结肠癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、 红白血病)没有被染色。此外，正常的外周血细胞没有被染色。；险测了所 述抗体对曱醛固定的石蜡包埋的胎盘组织切片和水冻的正常肝、肾、脾、
胸腺以及淋巴结组织切片的染色。两种抗体均使胎盘组织切片染色而没 有使其它正常组织染色(Lipinski 1981)。已准确报道了这两种抗体在体外 诊断研究中的应用。
通过用分化差的卵巢癌OvCa4343/83的膜粗制备物免疫小鼠，制备 了抗-TROP-2抗体MOvl6。检测了 MOvl6对一系列良性和恶性卵巢肺 瘤的冷冻组织切片的反应性。MOvl6与54种恶性卵巢肿瘤中的31种以 及16种良性卵巢肿瘤中的2种发生反应。在测试的5种卵巢粘液性肿瘤 中，MOvl6完全不发生反应。还检测了 MOvl6对非卵巢恶性肿瘤的冷 冻切片的反应性，其中发现MOvl6结合了 189种乳腺癌切片中的117种 以及18种肺癌切片中的12种。MOvl6与测试的16种非上皮的肿瘤(包 括脂肪肉瘤、软骨肉瘤、内皮瘤、组织细胞瘤和无性细胞瘤)完全不发生 反应。当测试冷冻的正常组织切片时，MOv-16与乳腺、胰腺、肾和前列 腺切片发生反应。虽然未报道使用的组织切片数，但是报道了 MOv-16 对肺、脾、皮肤、卵巢、曱状腺、腮腺、胃、喉、子宫及结肠切片没有 反应活性。该作者提到使用冷冻的组织切片是因为MOvl6与石蜡包埋的 组织不发生反应(Miotti 1987)。该抗体还<又#皮净艮道用于体外it断研究。
抗-TROP-2抗体Rs7-3G11 (RS7)是通过用来自手术去除的人肺部原 发性鳞状细胞癌的膜粗制备物免疫小鼠而产生。使用IHC检测RS7在人 肺瘤和正常组织的冷冻切片中的染色。RS7与代表乳腺、结肠、肾、肺 部、前列腺肿瘤及鳞状细胞癌的40个切片中的33个相结合。在正常组 织中，RS7与乳腺、结肠、肾、肝、肺和前列腺组织的20个切片中的16个相结合而脾脏组织的5个切片均未被染色。在本研究中，作者提到在
肿瘤中的抗原密度看起来比正常上皮组织中的密度高(Stein 1990)。
在肿瘤和正常组织上对RS7的组织专一性均进行了更多的研究。在 一组冷冻肿瘤切片测试了 RS7，其与代表肺、胃、肾、膀胱、结肠、乳 腺、卵巢、子宫和前列腺的肺瘤的77个切片中的65个相结合。测试的5 个^^巴瘤未^皮结合。在由总共24个组织类型组成的一组85个冷冻的人 正常组织切片中对RS7进行测试。13种正常组织(肺部、支气管、气管、 食道、结肠、肝脏、胰脏、肾、膀胱、皮肤、曱状腺、乳腺和前列腺)的 39个切片被RS7染色。本研究的作者提到在观察到阳性染色的组织中， 其反应性通常仅限于上皮细胞，主要是在导管或腺体中。还提到，由于 观察到RS7在曱醛固定的石蜡包埋的切片中没有反应性，因此本研究仅 限于冷冻切片(Stein 1993)。
多克隆的抗-TROP-2抗体是通过用与人TROP-2胞浆区的169至182 位的氨基酸相应的合成肽免疫小鼠而制备。在包含福尔马林固定的人食 道增生和癌组织的组织阵列切片上测试了所述多克隆抗体。55个癌样本 中的10个显示出由多克隆抗体的大量染色，而轻度增生组织的染色很弱， 这表明表达水平可能与恶性转化有关(Nakashima 2004)。
大体上，由不同抗-TROP-2抗体得到的IHC反应性模式是一致的。 TROP-2在癌症中的表达主要见于癌，并且大部分癌是有反应性的。在正 常组织中，看起来表达仅限于上皮来源的细胞，并且有些证据表明癌的 染色强于相应正常上皮组织的染色。
除了用于IHC研究，抗体RS7还在体内模型中由棵鼠异种移植模型 中的肺瘤靶向研究组成的初步实验中被测试。已表明，静脉内注射的放
射性标记的RS7在荷Calu-3 (肺腺癌)或GW-39 (结肠癌)肿瘤的小鼠的肿 瘤中特异性积聚(Stein 1990)。进行了另外的研究以研究对放射性标记的 RS7在异种移植体系中的生物分布以及研究RS7作为免疫偶联物的治疗 潜力。本研究中，研究了"4-标记的RS7 F(ab')2在荷Calu-3人肺腺癌异 种移植物的棵鼠中的治疗功效。在用Calu-3细胞给小鼠接种后的3周， 当肿瘤达到约0.3克至0.9克时，用1.0 mCi mi-RS7-F(ab')2或1.5 mCi 131I-RS7-F(ab')2以单剂量静脉内注射治疗6至7只小鼠的组，并与未治疗的对照小鼠的相似组进行比较。单剂量的1.0mCi mi-RS7-F(ab')2导致约 5周的肿瘤生长抑制，而单剂量的1.5mCi^I-RS7-F(ab')2导致肿瘤消退， 并且直至放射性抗体注射后的8周，平均胂瘤大小才超过治疗前的大小。 接受1.5 mCi ^I-RS7-F(ab')2剂量的小鼠的平均体重减轻了 18.7%,表明 存在与该治疗有关的毒性。本研究中，用棵RS7或RS7的F(ab')2片段的 治疗效果未被测试(Stein 1994a)。进行了另一研究以;险测131I-RS7在 MDA-MB-468乳腺癌异种移植模型中的功效。用250微居里的131I-RS7 或250微居里的131I-Ag8 (同种型匹配的对照抗体)单剂量静脉注射治疗带 有约0.1 cm3的MDA-MB-468肺瘤的10只小鼠的组。用30孩i克未标记 的RS7或Ag8单剂量静脉注射治疗6只小鼠的组。在用^I-RS7治疗的 动物中观察到肺瘤的完全消退(除了 一只动物出现了短暂的肿瘤再现)，这 种情况在11周的观察期期间一直保持。在用^I-Ag8治疗的小鼠中也观 察到肿瘤消退，尽管其仅在第2周至第5周观察到，同时肿瘤在余下的 研究中维持不变或继续生长。接受未标记的RS7或Ag8的小鼠的肿瘤生 长未被抑制并且RS7治疗的小鼠的平均肿瘤体积与Ag8治疗的小鼠相比 较未出现任何不同。用较高的单剂量的275微居里131I-RS7或275微居里 Ag8治疗带有约0.2 cm3至0.3 cm3的较大MDA-MB-468肿瘤的另外两个 IO只小鼠的组，并与未治疗小鼠的相似组进行比较。每周测量一次肿瘤 体积，测量15周。虽然在这种情况下在^I-RS7治疗的小鼠与未治疗的 小鼠之间，肿瘤生长有显著差异，但在131I- RS7治疗的小鼠与131I-Ag8 治疗的小鼠之间肿瘤生长没有显著差异，表明部分功效来自放射的非特 异性效应。在带有0.2 cn^至0.3 cmS肿瘤的小鼠中没有测试未标记的抗 体(Shih 1995)。
已有很多检测RS7作为免疫偶联物的功效的其它研究，其试图选择 用于放射免疫治疗的最佳放射性标记(Stein 2001a, Stein 2001b， Stein 2003)。已经产生了人源化的RS7，然而仅在临床前异种移植的模型中对 其作为放射偶联物进行了测试(Govindan 2004)。这些研究显示RS7产生 了与前述的研究相似的阳性作用，然而在一项研究中，即使以先前确定 的最大可耐受剂量递送放射性标记的RS7,在某些小鼠中也会出现毒性 而导致死亡(Stein2001a)。虽然在这些研究中用放射性标记的RS7实现了对小鼠中异种移植肿瘤的有效治疗，但棵RS7未被评价。
用神经氨酸酶预治疗的H3922人乳腺癌细胞免疫小鼠制备抗 -TROP-2的单克隆抗体BR110 (如美国专利5,850,854中所公开的，参见 现有专利部分)。通过免疫组织学，使用人冷冻的组织样本，显示BR110 与许多不同的人癌样本反应，包括肺、结肠、乳腺、卵巢、肾、食道、 胰腺、皮肤、肺部和扁桃体的人癌样本。未4企测人正常组织切片。体外 研究表明，BR110对人癌细胞系H3396或H3922没有ADCC或CDC活 性。在人癌细胞系H3619、 H2987、 MCF-7、 H3396和H2981上进行分析 BR110免疫毒素的细胞毒性作用的体外研究。所测试的细胞系的ECs。分 别为0.06、 0.001、 0.05、 0.09和大于5微克/mL。对于棵BR110抗体， 没有细胞毒性作用数据被公开。没有关于棵BR110或免疫偶联的BR110 的体内数据被公开。
已经产生了很多其它靶向TROP-2的抗体，例如用卵巢癌细胞系 CoLo 316免疫小鼠产生的MR54、 MR6和MR23 (Stein 1994b)以及用T24 膀胱癌细胞系免疫小鼠产生的抗体T16(Fmdet 1984)。这些抗体的用途限 于TROP-2抗原的生化表征以及细胞系和组织表达研究。还没有这些抗 体的体外或体内的抗癌功效的报道。RS7是在临床前癌症模型中被测试 治疗功效的仅有的抗体，同时其用途限于放射性同位素的载体。没有关 于任何棵TROP-2抗体在体外或体内临床前癌症模型中表现出治疗功效 的报道。
用于癌症治疗的单克隆抗体每个患有癌症的个体都是独特的，由 于个体的差异，其患有的癌症也不同于其他癌症。尽管如此，目前的治 疗对患有同期同类型肿瘤的所有患者采用相同的方式。至少30%的患者 的一线治疗是失败的，这样就造成更多轮次的治疗，增加了治疗失败、 肿瘤转移及最终死亡的可能性。 一种优越的治疗方式应该是针对特定个 体的个体化治疗。目前唯一采用个体化治疗的方式是外科手术。化疗和 放疗不能针对患者量身定做，而在大多数情况下，手术本身并不足以治 愈癌症。
随着单克隆抗体的问世，发展个体化治疗的方法的可能性变得更为 现实，因为每种抗体可以针对单一的抗原决定簇。而且，制备针对多个抗原决定簇的集群(constellation)的抗体组合成为可能，该抗原决定簇集群 唯一确定了某一特定个体的肿瘤。
认识到癌细胞和正常细胞的显著差异在于癌细胞含有转化细胞特异 性抗原，科学界长期认为可以通过与这些癌抗原特异结合设计出特异靶 向转化细胞的单克隆抗体；这样就产生了单克隆抗体能够作为"魔术子 弹(Magic Bullets)"消除癌细胞的观点。然而，现在已经广泛地认识到单 一的单克隆抗体不能用于癌症的所有情形，单克隆抗体可以按类来开发， 用来治疗目标癌症。依照本发明公开的方法分离出的单克隆抗体已经显 示出能够以有利于患者的方式调节癌性疾病进程，如通过降^f氐肿瘤负荷， 并且在本文中这些单克隆抗体将分别被称为癌性疾病调节抗体(CDMAB) 或"抗癌"抗体。
目前，癌症患者通常可选择的治疗方式4艮少。目前的癌症治疗方法 已经改善了总体存活率和发病率。然而，对特定的个体来说，这些改善 的统计数据与他们个人情况的改善并无必然关系。
因此，如果提出一种方法学，使医生能够在同组患者中，独立于其 他患者治疗每例肿瘤，这就使根据个人进行量身定做的独特治疗成为可 能。理论上，这样一种治疗过程可以增加治愈率，产生更好的效果，从 而满足长期的需要。
,人历史上来看，多克隆抗体的应用在治疗人癌症的方面取得的成功 有限。 一直用人的血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但^f艮少有长期的好转或 反应。而且，这种治疗方法重复性差，与化疗相比，没有更多的益处。 像乳腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌等实体肿瘤也用人血液、黑猩猩的血清、 人血浆和马血清治疗过，但相应的结果是不可预测和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代， 就有至少四项针对人乳腺癌的临床试验，在使用了针对特定抗原或基于 组织特异性的抗体的至少47名患者中，只产生了一名应答者。直到1998 年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗Her2/neu抗体 (Herceptii^)与顺柏。在这项试验中，对37名患者的反应进行了评估，大 约有四分之一的患者有部分反应，另外四分之一有轻微的或稳定的病情 发展。在反应者中，中位进展时间(median time to progression)是8.4个月，其中中位反应持续时间(median response duration)是5.3个月。
Herceptin 4 1998年被批准作为与Taxof联合使用的一线用药。临 床试验结果表明，与单独接受Taxo产治疗的AJf的中位疾病进展时间(3.0 月)相比，抗体治疗与Taxo^的联合应用增加了患者的中位疾病进展时间 (6.9月)。Hercepti,与Taxof联合治疗组的中位存活时间也轻微增加，与 TaxoP单独治疗组相比是22个月18个月。除此之外，该抗体和Taxol 联合应用组与单独^^用Taxo^组相比，在完全应答者(8%: 2%)和部分应 答者(34%: 15%)的数量方面都有增加。然而HerceptiZ和Taxof联合治 疗相比Taxo^单独治疗，导致了较高的心血管毒性发病率(分别是13%和 1%)。 Herceptii^治疗也只对那些过表达人表皮生长因子受体 2(Her2/neu)(通过免疫组化分析(IHC)来确定)的患者有效。Her2/neu是一 种目前还不知其功能或生物学重要配体的受体；大约25%的转移性乳腺 癌患者过表达Her2/neu。因此远远不能满足患乳腺癌的患者的治疗需求。 即便那些从Herceptii^治疗中受益的患者仍然需要化疗，并且随后还必须 至少在一定程度上处理这类治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及到同时针对糖蛋白和糖脂耙标的抗 体。对腺癌有某些特异性的诸如17-lA等抗体，已经在超过60例的患者 中进行了2期临床实验，其中仅有1例患者有部分反应。在其他试验中， 17-1A的使用在采用额外使用环磷酰胺实验方案的52例患者中，只产生 了 l例完全反应，2例轻孩i反应。到目前为止，17-lA作为III期结肠癌 辅助治疗的III期临床试验还没有显示出改善的疗效。最初被批准用于显 像的人源化鼠单克隆抗体也没能使肿瘤消退。
只有到了最近，使用单克隆抗体进行的结肠直肠癌的临床试验才有 一些阳性结果。2004年，ERBITUX⑧被批准作为表达EGFR的转移结肠 直肠癌患者的二线治疗用药，这些患者对于基于依立替康(irinotecan)的化 疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，ERBITUX⑧与 依立替康联合应用分别有23%和15%的反应率，中位疾病进展时间分别 是4.1和6.5月。来自同一项双臂II期临床试验和另一项单臂研究的结果 表明，ERBITUX⑧单独治疗的反应率分别是ll。/。和9。/。，中位疾病进展时 间分别是1.5和4.2个月。因而在瑞士和美国，ERBITUX⑧与依立替康的联合应用，以及在美国， ERBITUX 的单独治疗都已经被批准作为依立替康一线治疗失败的结肠 癌患者的二线治疗。因此，与Herceptir^—样，￡1^1丁1 @治疗在瑞士只 被批准作为单克隆抗体和化疗联合应用。此外，在瑞士和美国，ERBITUX 治疗只被批准作为患者的二线治疗。同样，在2004年，AVASTE^被批 准与基于静脉注射5-氟尿嘧啶的化疗联合应用，作为转移性结肠直肠癌 的一线治疗。m期临床研究结果表明，联合应用AVASTIN⑧和5-氟尿嘧 啶，与单独使用5-氟尿嘧咬相比，延长了患者的中位存活时间(分别是20 个月和16个月)。然而，还是与Herceptii^和ERBITUX⑧一样，AVASTIN 只被批准作为单克隆抗体与化疗联合应用。
对于肺脏、脑、卵巢、胰腺、前列腺和胃癌的治疗，疗效仍然很差。 在II期临床试验中，得到了对于非小细胞肺癌最有希望的近期结果，其 治疗涉及与化疗试剂TAXOTERE⑧联合应用的偶联细胞杀伤药物阿霉素 的单克隆抗体(SGN-15;dox-BR96，抗-唾液酸化的Lex)。 TAXOTERE㊣是唯 一经FDA批准的用于肺癌二线治疗的化疗药物。初始数据表明，与单独 使用丁八乂01￡肌@相比，总体存活率提高。参与该研究的62个患者中， 三分之二接受了 SGN-15与丁八乂0丁￡11￡@的联合治疗，剩下的三分之一接 受了 TAXOTERE⑧的单独治疗。接受SGN-15与TAXOTERE⑧联合治疗的 患者中位总体存活时间是7.3个月，相比之下，接受TAXOTERE⑧单独治 疗的患者的中位存活时间是5.9个月。与接受TAXOTERE⑧单独治疗的患 者的1年和18个月的总体存活率为24%和8%相比，接受SGN-15与 丁八乂01￡11￡@联合治疗的患者是29%和18%。进一步的临床试验在计划 中。
临床前试验中，使用单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了有限的成功。 这些抗体中，极少有达到临床试验期的，且至今还没有一种得到批准， 或在III期临床试验中显示出良好效果。
由于对促进疾病发生的30,000种已知基因产物中的相关靶点缺乏鉴 定，使治疗疾病的新药的发现受阻。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点 只因为其在肿瘤细胞中过表达这一事实而经常被选择。随后，这样鉴定 的靶点通过与大量化合物的相互作用被筛选。就潜在抗体的治疗而言，这些候选化合物通常由依据Kohler和Milstein提出的基本原理(1975, Nature, 256, 495-497， KoWer and Milstein)制备单克隆抗体的传统方法所 产生。从抗原免疫过的小鼠(例如，全细胞、细胞成分、纯化的抗原)收 集脾细胞，并与永生的杂交瘤细胞伴倡融合。基于与耙抗原密切结合的 抗体的分泌来筛选所产生的杂交瘤。包括Herceptii^和利妥昔单抗在内的 许多针对癌细胞的治疗和诊断的抗体已经被用这些方法制备并已基于它 们的亲和性被选择。这项策略的缺陷是双重的。首先，由于对组织特异 性的癌症过程认识的贫乏及由此产生的鉴定这些耙标的过分简单的方法 (诸如通过过表达来筛选)，与用于诊断和治疗的抗体结合的合适靶标的选 择是有限的。其次，与受体有最大亲和性的药物分子启动或抑制信号通 路的可能性最大这一假说并不总是成立。
尽管乳癌和结肠癌的治疗取得了 一些进展，但是有效的抗体治疗的 鉴定与开发对所有类型癌症而言都是不够的，不管是作为单一试剂还是 联合治疗。
现有专利
美国第5,750,102号专利公开了一种方法，其中用可从患者的组织或 细胞中克隆的MHC基因转染来自患者肿瘤的细胞。然后用这些转染的细 胞给患者接种。
美国第4，861，581号专利公开了一种方法，所述方法包括的步骤有 获取特异针对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分而对外部成分 没有特异性的单克隆抗体；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与哺乳动 物的组织接触，该哺乳动物已"l妄受杀灭肺瘤细月包的治疗；以及通过测量 该标记抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的效果。 在制备针对人细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞代表 这类抗原的 一个方便来源。
美国第5,171,665号专利提供了一种新型抗体及其制备方法。具体地， 该专利4又述了 一种单克隆抗体的制备，该抗体有与人肺瘤(例如肠癌和肺 癌)相关的蛋白抗原牢固结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。
美国第5,484,596号专利提供了一种癌症治疗的方法，该方法包括手术去除人癌症患者的肿瘤；处理所述肿瘤组织以获得肺瘤细胞；照射 肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；以及使用这些细胞来制备抑制原发性 肿瘤复发，同时抑制肿瘤转移的用于患者的疫苗。该专利讲述了能够与 肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行等处 提到的，专利权所有人在开发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，所述 单克隆抗体对人肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国第5,693,763号专利讲述了人癌细胞的糖蛋白抗原特性，其不依 赖于起源的上皮组织。
美国第5，783,186号专利涉及i秀导表达Her2的细胞凋亡的抗-Her2抗 体、产生该抗体的杂交瘤细胞系、使用所述抗体和包括所述抗体在内的 药物组合物治疗癌症的方法。
美国第5,849,876号专利描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞 系，该抗体针对从肿瘤和非肿瘤组织来源中纯化的粘液素抗原。
美国第5,869,268号专利涉及制备产生特异针对目标抗原的抗体的 人淋巴细胞的方法、制备单克隆抗体的方法及由该方法制备的单克隆抗 体。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人单克隆抗体的制备。
美国第5，869，045号专利涉及与人癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗 体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，其中该分子 可与人癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体能够进一 步内化入癌 细胞内，随后结合，使它们对形成抗体-药物，抗体-毒素的偶联物尤其有 用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒特性。
美国第5，780，033专利公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的使 用。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，自身 抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为所述自身抗体来自"老 年哺乳动物"，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。此外，该专利 公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体以及产生单克隆抗 核自身抗体的杂交瘤细胞系。
美国第5,850,854号专利公开了针对GA733-1的特异性抗体BRllO。 该专利公开了 BR110作为免疫毒素偶联物的体外功能。没有该抗体作为 -沐抗体(naked antibody)的体外功能被公开。该抗体的体内功能也没有一皮公美国第6,653,104号专利要求保护包括但不限于RS7的免疫毒素-偶 联的抗体，其针对包括但不限于EGP-1的宿主抗原。所述免疫毒素限于 具有核糖核酸水解活性(ribonucleolytic activity)的免疫毒素。然而，实施 例仅公开了针对CD22的特异性免疫毒素-偶联的抗体LL22。在该申请中 没有公开RS7的体外或体内功能。
美国申请20040001825A1公开了针对EGP-1的特异性抗体RS7。该 申请公开了 RS7作为放射性标记的偶联物的体外功能。没有公开该抗体 作为棵抗体的体外功能。该申请还公开了 RS7以放射性标记的和未标记 的偶联物形式依次给予引起的体内功能。然而，该研究限于一个患者并 且观察到的功能是否均由未标记的抗体引起是未知的。没有关于RS7以 棵抗体给予引起的体内功能。
发明概述
本申请利用美国专利6,180，357讲述的制备患者特异性的抗癌抗体的 方法，分离编码调节癌性疾病的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。可以针对 一个肺瘤专门制备这些抗体，从而使癌症治疗的个性化成为可能。在本 申请公开的内容中，有杀伤细胞(细胞毒的)或抑制细胞生长(细胞生长抑 制的)特性的抗癌抗体将在下文被称为细胞毒的。这些抗体可用于辅助癌 症的分期和:^断，可以用于治疗肿瘤转移。这些抗体也可以通过预防性 治疗的方式来预防癌症。与传统的药物发现模式下制备的抗体不同，用 本方法制备的抗体可靶向以前没有表明对恶性组织生长和/或存活必需的 分子和途径。而且，这些抗体的结合亲和性满足启动细胞毒性作用事件 的要求，该事件可不顺从于更强的亲和性相互作用。同样，本发明的范 围还包括将传统的化疗调节物质，比如力丈射核素，与本发明中的CDMAB 偶联，从而使所述的化疗作用集中。该CDMAB也可与毒素、细胞毒性 部分、酶(例如生物素偶4关酶)、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子 部分或造血细月包偶H从而形成抗体偶耳关物。该CDMAB可单独^吏用或 与 一种或多种CDMAB/化学治疗剂结合使用。
个体化抗癌治疗前景将会带来患者治疗方式的变化。 一个可能的临床情境就是在肿瘤出现时，就获取肿瘤样本并入库。通过该样本，从预 存在的癌性疾病调节抗体组中对该胂瘤进行分型。对该患者进行常规分 期，而所提供的抗体可用于该患者的进一步分期。用现有的抗体可直接 对该患者进行治疗，且肿瘤特异性的抗体组可通过本文中列出的方法来 制备或通过噬菌体显示库与本文公开的筛选方法合用来制备。既然其他 肿瘤可能携带一些与被治疗肿瘤相同的抗原决定簇，制备的所有抗体将 被加入到抗癌抗体库中。按照本方法制备的抗体可以用于治疗许多患有 与这些抗体结合的肿瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐治疗作为多模式治疗 方案的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌细胞相对无毒性这一事 实允许大剂量使用抗体组合，要么单独应用，要么与传统的治疗联合应 用。高治疗指数也允许短期内的重复治疗，这种治疗应当降低治疗抗性 细胞出现的可能性。
如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肺瘤特异 性抗体的产生过程进行再次治疗。而且，该抗癌抗体可以与从该患者体 内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肿瘤。目前几 乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良结 果。然而，转移癌通常血管丰富，通过红细胞来运输抗癌抗体可以4吏抗 体富集在肿瘤部位。即便在转移之前，大多数癌细胞也要依赖于宿主的 血供来存活，与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤同样有效。可选择地， 所述抗体可以与其他的血细胞，比如淋巴细胞、巨喧细胞、单核细胞、 自然杀伤细胞等偶联。
抗体有五类，每类都有其重链所赋予的功能。通常认为通过抗体依
赖性细胞的细胞毒性作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒性作用(CDC)来介 导棵抗体的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和lgG2a抗体能够结合补体 系统的C-l组分来活化人补体，从而活化导致肺瘤裂解的补体活化的经 典途径。对于人抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl。鼠lgG2a 和IgG3同种型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，所述Fc 受体会导致单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作 用。人的IgGl和IgG3同种型抗体介导ADCC。用需要例如NK细胞、T细胞和补体的 效应细胞、其相应受体或蛋白的存在。这些效应器机制缺乏的情况下，
所述抗体的Fc部分是无活性的。所述抗体的Fc部分在体内可提供影响
抗体的药物动力学的特性，但在体外这是无效的。
我们测试抗体的细胞毒性作用分析不存在任何的效应器机制，并且
在体外进行。这些分析不存在效应细胞(NK、巨噬细胞或T细胞)或补体。 由于这些分析完全由加在一起的组分确定，所以各组分均能被表征。本 文用到的分析仅包含靶细胞、介质和血清。由于所述靶细胞是癌细胞或 成纤维细胞，因此其不具有效应器功能。在不存在具有效应器功能特性 的外源细胞的情况下，就没有具有该功能的细胞组分。所述介质不包含 补体或任何细胞。用于支持靶细胞生长的所述血清不具有厂商公开的补 体活性。此外，我们已在我们自己的实验室中证实了在使用的血清中不 存在补体活性。因此，我们的工作证明了这样的事实抗体的作用完全 来自经Fab介导的抗原结合的作用。有效地，由于所述靶细胞不具有Fc 的受体，其仅被观察到与Fab发生作用。虽然杂交瘤分泌用靶细胞测试 的完整免疫球蛋白，但所述免疫球蛋白与所述细胞发生作用的唯一部分 是作为抗原结合片段的Fab。
关于本发明要求保护的抗体和抗原结合片段，提交的本申请已证明 了细胞的细胞毒性作用，如

图1中的数据所证实的那样。如以上所指出 以及如本文经客观证据所证实的，所述作用完全归因于Fab与胂瘤细胞 的结合。
本领域存在抗体介导细胞毒性作用的大量证据，所述作用来自抗体 与耙标抗原的直接结合，而不依赖于由Fc募集的效应器机制。对此最好
类型的试验已经用完整的免疫球蛋白或用抗原结合片段(例如F(ab)'2片 段)实施。在这些类型的试验中，抗体或抗原结合片段能够直接诱导靶细 胞的细胞凋亡，例如抗-Her2和抗-EGFR抗体的情况，这两种抗体已被美 国FDA4比准上市用于癌症治疗。
抗体介导的癌杀伤功能的另 一可能机制是通过使用能够催化细胞膜
及其相关糖蛋白或糖脂中各种化学键水解的抗体，即所谓的催化抗体。抗体介导的癌细胞杀伤功能还有三种机制。第 一种是抗体作为疫苗 诱导机体产生针对存在于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种是用抗 体靶向生长受体，干扰其功能或下调该受体，以使其功能有效丧失。第
三种是这类受体与细胞表面部分直接连接(ligation)的作用，其可导致直接 的细胞死亡，比如与诸如TRAILR1或TRAILR2的死亡受体，或是与诸 如aV/ 3等的整合素分子连接。
癌症药物的临床应用是基于该药物在可接受的风险范围下对患者的 益处。在癌症治疗过程中，存活率通常是追求的最主要的益处。但是， 除了延长寿命之外，还有一些其他公认的益处。在治疗对存活率没有负 面影响的情况下，这些其他益处包括症状减轻、防止副作用、延长复发 或无疾病存活时间以及延长病情进展时间。这些标准是4皮普遍接受的， 且像美国食品药品管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物 (Hirschfeld " a/. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy (肿瘤学/血液学 的临床综述)42:137-143 2002)。除了这些标准之外，人们充分认识到还有 一些其他的指标可以预测这些类型的益处。在某种程度上，美国FDA准 许的快速审批程序肯定了可能预测患者受益的替代品的存在。到2003年 末，有16种药物在这种程序下得到批准，在这些药物中，有四种进入了 完全审批，即后续的研究已经显示了直接的患者受益，正如替代指标预
测的那样。确定药物对实体胂瘤的效果的一个重要的指标是通过测定对 治疗的反应来评价月中瘤负荷(Therasse & a/. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。这类评价的临床标准(RECIST标准)已经由 实体月中瘤反应评《介标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group) ^>布，该工作组由国际癌症专家组成。正如依据 RECIST标准的客观反应显示的，与适当的对照组相比，对肺瘤负荷有确 切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。在临床前设置中，肿瘤 负荷通常能更直接地被评价和记录。因为临床前研究可以转化成临床设 置，所以在临床前模型中延长存活率的药物有最大的预期临床效用。与 临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿瘤负荷的药物也 对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药物治疗中追求的 最主要的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，显然，降低肿瘤负荷(其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都有关系)也能导致直接
的益处，并具有临床作用 (Eckhardt ef a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(发 展的治疗学靶化合物的临床试验设计的成功与失败);ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003， pages 209-219)。
本发明描述了 AR47A6.4.2的开发和应用，其通过在细胞毒性作用分 析中的作用、在动物模型中未建立的和建立的肿瘤生长中的作用以及在 患有癌性疾病的动物模型中延长存活时间的作用得到鉴定。本发明代表 了癌症治疗领域中的进步，在于它第一次描述了特异性结合于存在于靶 分子(TROP-2)上的一个或多个抗原决定簇的试剂，所述试剂作为棵抗体， 在体外对恶性肿瘤细胞也有细胞毒性作用，对正常细胞没有毒性，其也 可作为棵抗体直接介导肿瘤生长的抑制作用以及人癌症体内模型中的生 存延长。这是相对于前述的任何其它抗-TROP-2抗体的进步，因为这些 抗体均未显示出具有相似的特性。它还提供了本领域的进步，因为它第 一次明确证实了 TROP-2直接参与与某些类型的肿瘤的生长和发展相关 的事件。它还代表了癌症治疗中的进步，因为其具有在人患者中显示出 相似抗癌特性的潜力。另外的进步在于，将这些抗体包含在抗癌抗体库 中，通过确定不同抗癌抗体的适当组合会增加靶向表达不同抗原标志物 的肿瘤的可能性，以实现最有效的靶向和抑制该肺瘤的生长和发展。
总之，本发明教导了 AR47A6.4.2抗原作为治疗试剂靶点的应用，当 给予AR47A6.4.2时，可以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌的肿瘤负荷， 并还能使被治疗的哺乳动物生存延长。本发明还教导了将CDMAB (AR47A6.4.2)及其衍生物、其抗原结合片段和其细胞毒性作用诱导配体用 于靶向它们的抗原以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌的肿瘤负荷并使被 治疗的哺乳动物生存延长。此外，本发明还教导了在癌细胞内检测 AR47A6.4.2抗原的用途，这能够用于携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物 的诊断、治疗的预测及预后。
因此，本发明的目的是利用产生癌性疾病调节抗体(CDMAB)方法， 以分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离单克隆抗体及 其抗原结合片段，所述抗体针对来自特定个体的癌细胞，或一个或多个特定癌细胞系，所述CDMAB对癌细胞有细胞毒性作用，而同时对非癌
细胞相对无毒。
本发明的另一目的是教导癌性疾病调节抗体、配体及其抗原结合片段。
本发明进一步的目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性作用由 抗体依赖的细胞毒性作用介导。
本发明另一目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性作用由补体 依赖的细胞毒性作用介导。
本发明进一步的目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性作用是 其催化细胞化学键水解的能力的函数。
本发明进一步目的是制备癌性疾病调节抗体，其用于癌症诊断、预 后和监测的结合分析。
通过本发明下述的说明、举例和一些实施方案的描述，本发明其它 的目的和优点将变得显而易见。
附图简要说明
图1比较了杂交瘤上清液对OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk细胞系 的细胞毒性作用百分比及结合水平。
图2将AR47A6.4.2和抗-EGFR抗体对照与癌细胞及正常细胞系的结 合制成表格。数据以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。
图3包括:针对几种癌细月包和非癌细胞系的AR47A6.4.2和抗-EGFR抗 体的代表性FACS直方图。
图4显示AR47A6.4.2在预防性BxPC-3胰腺癌才莫型中对肿瘤生长的 影响。垂直线表示给予抗体的阶段。数据点代表平均值+/-标准误。
图5显示AR47A6.4.2在预防性BxPC-3胰腺癌模型中对体重的影响。 数据点代表平均值+/-标准误。
图6显示AR47A6.4.2在建立的BxPC-3胰腺癌模型中对肿瘤生长的 影响。垂直线表示给予抗体的时期。数据点代表平均值+/-标准误。
图7显示AR47A6.4.2在建立的BxPC-3胰腺癌模型中对体重的影响。 数据点代表平均值+A标准误。图8显示AR47A6.4.2在预防性PL45胰腺癌^^莫型中对肿瘤生长的影 响。垂直线表示给予抗体的阶段。数据点代表平均值+A标准误。
图9显示AR47A6.4.2在预防性PL45胰腺癌模型中对生存的影响。
图10显示AR47A6.4.2在预防性PL45胰腺癌模型中对体重的影响。 数据点代表平均值+A标准误。
图11显示AR47A6.4.2在预防性PC-3前列腺癌模型中对肿瘤生长的 影响。垂直线表示给予抗体的阶段。数据点代表平均值+/-标准误。
图12显示AR47A6.4.2在预防性PC-3前列腺癌模型中对生存的影响。
图13显示AR47A6.4.2在预防性PC-3前列腺癌模型中对体重的影 响。数据点代表平均值+/-标准误。
图14显示AR47A6.4.2在预防性MCF-7乳腺癌;漠型中对肿瘤生长的 影响。垂直线表示给予抗体的阶段。数据点代表平均值+/-标准误。
图15显示AR47 A6.4.2在预防性MCF-7乳腺癌模型中对体重的影响。 垂直线表示给予抗体的阶段。数据点代表平均值+A标准误。
图16显示AR47A6.4.2在预防性MCF-7乳腺癌模型中对生存的影响。
图17显示AR47A6.4.2在预防性Colo 205结肠癌才莫型中对肿瘤生长 的影响。垂直线表示给予抗体的阶段。数据点代表平均值+/-标准误。
图18显示AR47A6.4.2在预防性Colo 205结肠癌才莫型中对体重的影 响。数据点代表平均值+A标准误。
图19.用AR47A6.4.2作为探针探测的、来自MDA-MB-231细胞的 全部膜部分(泳道l)以及来自PC-3细胞系(泳道2)和CCD-27sk细胞系(泳 道3)的全细胞裂解产物的样本的免疫印迹。分子量标记显示在左侧。
图20.通过MDA-MB-231细胞系的全部膜部分与AR47A6.4.2 (泳道 l)和同种型对照(泳道2)的免疫沉淀反应制备的免疫复合物的蛋白印迹。 还使用未与MDA-MB-231的全部膜部分孵育的抗体偶联的蛋白G-琼脂 糖珠作为阴性对照(泳道3和泳道4)。用抗体AR47A6.4.2、 IgG2a同种型 对照或不用一抗^r测了 3个重复的印迹。分子量标记显示在左侧。
图21.通过MDA-MB-231细胞系的全部膜部分与AR47A6.4.2 (泳道 2和3)或同种型对照(泳道1和4)的免疫沉淀反应制备的免疫复合物的蛋白印迹。重复的等分样本在糖芬酶混合物的存在(泳道3和4)和不存在(仅 有緩冲液，泳道1和2)的情况下进行孵育。分子量标记显示在左侧。
图22.来自免疫复合物的蛋白印迹(中间组)和胶体染色(左侧组)的图 像的比对，所述免疫复合物由MDA-MB-231细胞系的全部膜部分与 AR47A6.4.2 (泳道l)和同种型对照抗体(泳道2)的大规模免疫沉淀反应而 制备。还使用仅AR47A6.4.2偶联的蛋白G琼脂糖珠(未与MDA-MB-231 细胞孵育)作为阴性对照(泳道3)。分子量标记显示在左侧。
图23.在取出中心部分以分离蛋白样本之前或之后的胶体蓝 (Colloidal Blue)染色凝胶的图像，所述蛋白样本在用胰酶消化后通过质谱 法被分析。泳道描述与图20相同。分子量标记显示在左侧。
图24.在胰蛋白酶对由胶体蓝染色的凝胶取出中心部分而获得的样 本进行水解后获得的质谱图。质谱图下面是Profound检索结果概要。
图25.来自对一种独特的肽的MS/MS分析的MASCOT检索结果概 要，所述独特的肽是在胰蛋白酶消化AR47A6.4.2免疫沉淀物后获得的。 SEQ ID NO: 9被显示。
图26.由MDA-MB-231细胞系的全部膜部分与AR47A6.4.2 (泳道1) 和同种型对照抗体(泳道3)获得的免疫复合物的蛋白印迹。仅AR47A6.4.2 偶联的蛋白G琼脂糖珠(还使用"模拟IP"作为阴性对照(泳道2))。用 AR47A6.4.2、抗-人TROP-2和同种型对照作为探针检测重复的印迹。分 子量标记在左侧显示。
图27.纯化的人重组蛋白TROP-2 (泳道l)和CD63大胞外域(泳道2) 的蛋白印迹。用AR47A6.4.2、抗-人TROP-2、 1A245.6或同种型对照作 为探针检测重复的印迹。分子量标记在左侧显示。
图28.在变性或非变性的条件下糖基化(G)或去糖基化(D)的 MDA-MB-231膜蛋白(MB-231)和重组人TROP-2 (rh TROP-2)，其由 AR47A6.4.2作为探针检观'J 。
图29.在变性或非变性的条件下糖基化(G)或去糖基化(D)的 MDA-MB-231膜蛋白(MB-231)和重组人TROP-2 (rh TROP-2),其由抗-人TROP-2作为探针4全测。
图30.在变性或非变性的条件下糖基化(G)或去糖基化(D)的MDA-MB-231膜蛋白(MB-231)和重组人TROP-2 (rh TROP-2),其由IgG 同种型对照作为探针检测。
图31.用不同的一抗的溶液作为探针检测重组人TROP-2的蛋白印 迹。泳道3至7分别用与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克mL、 500微 克/mL以及1000微克/mL的非生物素化的AR52A301.5混合的生物素化 的AR52A301.5作为探针检测。泳道9至13分别用与0.5微克/mL、 5微 克/mL、 50微克mL、 500微克/mL以及1000微克/mL的非生物素化的 AR47A6.4.2混合的生物素化的AR52A301.5作为揮:针4全测。泳道15至 19分别用与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克mL、 500微克/mL以及 1000孩i克/mL的非生物素化的8A3B.6混合的生物素化的AR52A301.5作 为揮:4十>险测。泳道8和14用阴性对照溶液孵育并且泳道8不在二抗溶液 中孵育。泳道l、 2和20仅用TBST孵育。
图32.用不同的一抗的溶液作为探针检测重组人TROP-2的蛋白印 迹。泳道3至7分别用与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克mL、 500微 克/mL以及1000微克/mL的非生物素化的AR52A301.5混合的生物素化 的AR47A6.4.2作为探针检测。泳道9至13分别用与0.5微克/mL、 5微 克/mL、 50微克mL、 500微克/mL以及1000微克/mL的非生物素化的 AR47A6.4.2混合的生物素化的AR47A6.4.2作为探针检测。泳道15至19 分别用与0.5微克/mL、 5微克/mL、 50微克mL、 500微克/mL以及1000 微克/mL的非生物素化的1B7.11混合的生物素化的AR47A6.4.2作为探 针4全测。泳道8和14用阴性对照溶液孵育并且泳道8不在二抗溶液中孵 育。泳道l、 2和20仅用TBST孵育。
图33.将AR47A6.4.2在正常人组织微阵列上与阳性对照和阴性对照 的IHC比4交制成表才各。
图34.典型的显微图，显示了正常人组织;微阵列中用AR47A6.4.2 (A) 或同种型对照抗体(B)在脾组织上获得的结合模式以及用AR47A6.4.2 (C) 或同种型对照抗体(D)在脑组织上获得的结合模式。放大倍数为200倍。
图35.将AR47A6.4.2在来自不同组织微阵列的多种人肺瘤切片与正 常组织切片上的IHC比较制成表格。
图36.典型的显微图，显示了多种人肺瘤组织微阵列中用AR47A6.4.2 (A)或同种型对照抗体(B)在乳腺肺瘤组织上获得的结合模式 和用AR47A6.4.2 (C)或同种型对照抗体(D)在前列腺肿瘤组织上获得的 结合才莫式以及用AR47A6.4.2 (E)或同种型对照抗体(F)在胰腺肺瘤组织上 获得的结合模式。对于乳腺和胰腺肿瘤组织的放大倍数为400倍，对于 前列腺肿瘤组织的力文大倍it为200倍。
图37.将AR47A6.4.2在来自不同的正常物种组织孩i阵列的多种人正 常组织切片与其它物种正常组织切片的IHC比较制成表格。
图38.典型的显微图，显示了多种多物种组织微阵列中用 AR47A6.4.2 (A)或同种型对照抗体(B)在正常人肾组织上获得的结合模式 和用AR47A6.4.2 (C)或同种型对照抗体(D)在正常食蟹猴肾组织上获得的 结合模式以及用AR47A6.4.2 (E)或同种型对照抗体(F)在正常恒河猴组织 上获得的结合模式。放大倍数为200倍。
图39.用于鼠科AR47A6.4.2序列测定的全部寡核苷酸引物(SEQ ID NOS: 10-47)的序列。
图40.扩增AR47A6.4.2 VH与VL区域的RT/PCR的琼脂糖凝胶。
图41. AR47A6.4.2 VH-C与VL-E的PCR集落筛选的琼脂糖凝胶。
图42. AR47A6.4.2 VHA与VLG的PCR集落筛选的琼脂糖凝胶。
图43. AR47A6.4.2 Vl氛基酸序列(SEQ ID NO:8)。
图44. AR47A6.4.2 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
发明详述
下面用于概述、说明书、实施例和权利要求书中的字词或短语通常 具有其指定的含义。
术语"抗体"使用其最宽泛的涵义，且具体包括，例如单克隆抗体(包 括激动剂、拮抗剂和中和抗体，脱免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗 体)、携带多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、双体(diabodies)、三体 (triabodies)、免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本发明中使用的术语"单克隆抗体"指从基本同质的抗体群中获得 的一种抗体，即构成该群抗体的单个抗体是相同的，除了可少量存在的 可能自然发生的变异。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原位点。而且，与包含针对不同决定基(抗原决定簇)的不同抗体的多克隆抗体制剂相 比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定基。除了特异性之外，单 克隆抗体的优势还在于其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语"单克 隆的"指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要 通过任何特定的方法来生产该抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体
可以通过由Kohler d a/.， A^ww， 256:495 (1975)首次描述的杂交瘤(鼠或 人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567 号)。还可以使用在例如Clackson a/"胸,,352:624- 628 (1991)和 Marks W a/, /. Mo/.说W, 222:581-597 (1991)中描述的技术，从噬菌体抗体 库中分离"单克隆抗体"。
"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或 可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv 片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子， 融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
"完整"抗体指包括抗原结合可变区，以及轻链恒定区(QJ和重链恒 定区Ch1、 Ch2和Ch3的抗体。恒定区可以是天然序列的恒定区(例如， 人天然序列恒定区)或其氨基酸序列的变体。优选地，该完整抗体有一个 或多个效应器功能。
依据其重链恒定区的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的"种类"。 有五大类完整的抗体IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM,其中几种可进 一步分为"亚类"(同种型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。 与不同种类抗体对应的重链恒定区分别净皮称为a、 S、 e、 7和g。不同种 类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维空间构型是公知的。
抗体"效应器功能"指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或 氨基酸序列变异的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的例子包括Clq 结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的 细胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受 体；BCR)等。
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用"和"ADCC"指细胞介导的 反应，在该反应中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别耙细胞上结合的抗体，并随
后导致靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcryRIII, 而单核细胞表达F(ryRI、 Fc^RII和Fcr^IIL Ravetch和Kinet， Aev. //wm/"o/9:457-92 (1991 )第464页的表3总结了造血细胞的FcR表达。为 了测定目标分子的ADCC活性，可以进行例如在美国专利5,500,362或 5,821,337描述的体外ADCC活性测定。用于这类分析的效应细胞包括外 周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。选择地或附加地，可在体 内评价目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes er a/. /W^4S (USA) 95:652-656 (1998)中公开的动物模型中。
"效应细胞"指表达一种或多种FcRs并执行效应器功能的白细胞。 优选地，这些细胞至少表达F(ryRIII，并执行ADCC效应器功能。介导 ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK) 细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMCs和NK细 胞。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或 PBMCs中分离。
术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合于抗体Fc区的受体。优选的 FcR是天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(Y受 体)的受体，并包括FcryRI,F(yyRII和Fc7RIII亚类的受体，其包括这些受 体的等位基因变体和选择性的剪切形式。Fc7RII受体包括Fc7RIIA("激 活性受体")和FcoRIIB ("抑制性受体")，两者的M酸序列相似，区 别主要在于其胞浆区。激活性受体FcyRIIA在其胞浆区含有免疫受体酪 氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcryRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪 氨酸抑制基序(ITIM)。(参见Dagron， Z ev. /www"o/. 15:203-234 (1997)
中的综述M)。在Ravetch和Kinet， "ev. /mmw"o/ 9:457-92(1991);
Capel & a/" Tmwwwwwe^oJs 4:25-34 (1994)禾口 de Haas a a/" C7z'". Met/. 126:330-41 (1995)中对FcR进行了综述。其他FcR，包括将来要被 确认的FcR，都包括在本发明中的术语"FcR"中。该术语也包括负责将 母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer " a/., /wmw朋/. 1 17:587 (1976)和Kim " a/.' Ewr./mww"o/. 24:2429 (1994))。
"补体依赖性细胞毒性作用"或"CDC"指分子在补体存在下，裂解靶细胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第 一组分(Clq)与交联了
同类抗原的分子(比如，抗体)的结合启动。为了评价补体激活，可以进行
i口在Gazzano-Santoro a a/.,7mmwwo/. 202:163 (1996)中4笛ii6勺
CDC分析。
术语"可变的"指可变区某些部分的序列在抗体间高度不同，并用 于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变异并不是
均匀分布在抗体的可变区域内。它集中在轻链和重链可变区的三个所谓 的高度可变区的片段内。可变区内更加高度保守的部分被称为骨架区 (FRs)。每个天然的重链和轻链可变区包括由三个高度可变区连接的主要 采用/3-片层构型的四个FRs，其形成环状连接，且在某些情况下形成部 分/3-片层结构。每条链的高度可变区通过FRs以密切靠近的方式结合在 一起，并与另一条链的高度可变区一起，促进抗体的抗原结合部位的形 成(参见Kabat iS^wewce51 o/_Prato>w o/immimo/og/ca/ /"femst(^瘦夢 《#~蛋^的淨/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合， 而是呈现各种效应器功能，例如在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中抗 体的参与。
本发明中使用的术语"高度可变区"指抗体中负责与抗原结合的氨 基酸残基。高度可变区通常包括"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残 基(例如轻链可变区的氨基酸残基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3) 及重链可变区的氨基酸残基31-35 (Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat d S^we"cas o//VotoVw o//mmw"o/o^c"/ /"tems,(^瘦夢《标蛋 冷的#/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991))和/或"高变环"区的氨基酸残基(例如轻链可变区的 残基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重链可变区的26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk / Mo/.所o/. 196:901-917 (1987》。
"骨架区"或"FR"残基指除了本发明定义的高变区残基之外的那些可 变区的残基。木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为"Fab"片段 的抗原结合片段和一个残余的"Fc"片段，每个"Fab"片段都有单一的 抗原结合部位，"Fc"片段的名称反映了其易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其有两个抗原结合部位，且仍能够与抗原交联。
"Fv"是含有完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区 域由以紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体构成。 以这种每个可变区的三个高变区相互作用的构型决定Vh-Vl二聚体表面 的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然 而，即便单一的可变区(或只含有三个抗原特异性高变区的Fv的一半)仍 能够识别和结合抗原，尽管比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含 有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。 Fab'片段不同于Fab片段之处 在于其重链CH1区的羧基末端多了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰 链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本发明中指代Fab',其中恒定区 的半胱氨酸残基至少携带一个游离的.硫基。最初的F(ab')2抗体片段以 Fab'片段对产生，所述Fab'片段之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段 的化学偶联也是公知的。
来自任一脊推动物的抗体的"轻链"基于其恒定区的氨基酸序列，都 可以归于两种截然不同的所谓kappa (k)和lambda (入)链中的 一种。
"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和Vl区，其中这些 区域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽还包含VH和VL区之间的 多肽连接子，其使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv的综述参见 Pliickthun in 尸Aar画co/ogy Mo"oc/o""/爿"必ocfes(^乂發我谬秀理 釣，vol. 113， Rosenburg and Moore eds.， Springer-Verlag， New York, pp. 269-315 (1994)。
术语"双体(Diabodies)"指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段， 该片段在同 一 多肽链上(VH-VO含有与轻链可变区(VO结合的重链可变区 (VH)。通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子，使 这些区域^皮迫与另 一条4连上的互补区域配对，由此产生了两个抗原结合 位点。例如在EP 404,097; WO 93/11161 ;和Hollinger d a/. ， Prac. MzZ/ 爿cad 90:6444-6448 (1993)中对双体作了更详细的描述。
术语"三体(triabodies)"或"三价的三聚体"指三个单链抗体的结合。 三体是由V^或VH区的氨基酸末端构建的，即，没有任何连接子序列。 三体具有三个Fv头，其中多肽以环状的、头接尾的方式排列。该三体可能的构象是平面的，其中，位于平面内的三个结合位点彼此成120度的
角度。三体可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的。
"分离"抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗 体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗作用的物质，可 以包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶解物。因为缺乏抗体的天 然环境中的至少 一种组分，分离的抗体包括重组细胞内部的原位抗体。 但是，通常分离的抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
"结合"目的抗原(例如TROP-2抗原)的抗体是指对该抗原有充分亲 和力的抗体，以致该抗体在靶定表达该抗原的细胞时，可以作为治疗或 诊断试剂。如果抗体是结合TROP-2的抗体，它通常会优先结合TROP-2， 而不是其它受体，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或与其他 抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋白有明显的相互 作用。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可包括 但并不局限于例如FACS、细胞ELISA和免疫印迹等分析。
正如本发明中使用的，"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物，，的表述可 以交替使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或 非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化 细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。才艮据有意 使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。
"治疗(treatment)或治疗(treating)"既指治疗性处理，也指预防性或 防止性的措施，其目的就是预防或减緩(减轻)目标病理状态或病症。需要 治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该 病症的或名大对其病症进行预防的个体。因此，本文中彩d皮治疗的哺乳动 物可已经净皮i貪断为患有该病症或可倾向于或易感于该病症。
术语"癌症"和"癌性(的)"是指或描述哺乳动物的生理状态，其典 型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴 瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的实 例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺 癌、肺腺癌和肺鳞癌在内的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌在 内的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子 宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，曱状腺癌，肝癌，肛 癌，阴茎癌，还有头颈部癌。
"化疗剂"是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括诸如噻 替派和环磷酰胺(CYTOXAlSFM)的烷化剂；诸如白消安(busulfan)、英丙舒 凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如苯佐替派 (benzodopa)、卡波酉昆、美妥替口底(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)的氮丙 啶类；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、 三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙 烯亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamine); 如瘤可宁 (chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、 盐酸曱氧氮芥、美法仑(melphalan)、 新氮芥 (novembichin)、苯乙酸氮齐(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫 司汀(uracilmustard)等氮芥类药物；如卡氯齐、氯脲霉素、福莫司汀、洛 莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas);如阿克拉霉素类、 放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉 素、洋红霉素、》友霉素(camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、 柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、 依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄 榄霉素、灰霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链 黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类抗生 素；曱氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二曱叶酸、氨曱喋呤、 蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、石克米嘌呤、 硫鸟噤呤类噤呤类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、 阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶 类似物；如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮 等男性激素类药物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物； 如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛石粦酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安 吖啶；bestrabucil;比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依 氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达
39明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥； 吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；锗 螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春 地辛；达卡巴"秦；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(TAXOL⑧， Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)和多西他赛(TAXOTERE⑧， Aventis， Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥； 吉西他滨；6-硫鸟噤呤；巯嘌呤；曱氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物； 长春4^;铂；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌； 长春新碱；长春瑞滨；去曱长春碱；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；柔 红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11;拓朴异构酶抑制剂 RFS 2000; 二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；埃斯波霉素类 (esperamicins);卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、 酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定 义内，像抗雌激素药物，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制 剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、LYl 17018、 奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素物质，例如氟他胺、尼鲁米 特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种药物在药学上可 接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的"哺乳动物"指任何一种可归于哺乳类的动物，包 括人、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或棵鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及 动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。 优选地，本发明中的哺乳动物指人。
"寡核苷酸"指短长度、单链或双链多聚脱氧核普酸，其通过已知 的方法(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学)，利用例如发表于1988 年5月4日的EP 266,032中描述的固相技术，或利用Froehler ^ a/, M/c/.
i es.， 14:5399-5407, 1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物化学合 成。然后将其用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
根据本发明，非人(例如鼠科)免疫球蛋白的"人源化"形式和/或"嵌 合"形式是指抗体，所述抗体包含导致人抗鼠抗体(HAMA)应答、人抗嵌性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、 Fab、 Fab，、 F(ab，)2 或抗体的其他抗原结合序列)，并且包含来自所述非人免疫球蛋白的必要 部分(例如CDR、抗原结合区域、可变区域等等)，所述必要部分对于再 现所需作用并同时保持可与所述非人免疫球蛋白相比的结合特性是必需 的。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中， 来自受者抗体的互补决定区(CDRs)的残基^皮诸如具有所需的特异性、亲 和力、能力的小鼠、大鼠或兔等非人抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替 代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人 FR残基所替代。此外，人源化抗体可包含既不在受者抗体也不在供者抗 体的CDR或FR序列的残基。产生的这些修^饰可进一步改善和优化抗体 的性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常是两个可变区的几乎所 有的部分，其中所有或几乎所有的CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR 区，且所有或几乎所有的FR残基是人免疫球蛋白共有序列的FR残基。 最优地，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区序列的至少一部分，通常 是人免疫球蛋白的序列。
"去免疫化"抗体是对特定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的 免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现去免疫化。可以使用任何本 领域技术人员公知的去免疫化技术。例如，在于2000年6月15日公开 的WO 00/34317中，描述了一项使抗体去免疫原性的适当的技术。
诱导"细胞凋亡，，的抗体是通过任一方式诱导程序性细胞死亡的抗 体，这些方式例如但不限于结合Annexin V(膜联蛋白V )、 caspase (半 胱天冬酶)活性、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞石皮碎和/或膜 嚢泡(所谓的凋亡小体)的形成。
如本文使用的"抗体诱导的细胞毒性作用"，其含义应理解为源自杂 交瘤上清液或由杂交瘤产生的抗体的细胞毒作用，所述杂交瘤以保藏号 141205-05保藏于IDAC，所述作用并不必然与结合度有关。
在本说明书中，杂交瘤细胞系及其产生的分离的单克隆抗体可选择 用内部分类号AR47A6.4.2或保藏号IDAC 141205- 05来表示。
本发明中使用的"抗体-配体"包括至少对靶抗原的一个抗原决定簇有结合特异性的部分，其可以是完整的抗体分子、抗体片段和至少有一
分子、Fab分子、Fab'2分子、双特异性抗体、融合蛋白或任一基因工程 分子，其特异性识别和结合抗原的至少一个抗原决定簇，所述抗原可^皮 命名为IDAC 141205-05(IDAC 141205-05抗原)的杂交瘤细胞系产生的分 离的单克隆抗体结合。
本发明中使用的"癌性疾病调节抗体，，(CDMAB)指能够以有益于患 者的方式，例如通过减轻肺瘤负荷或延长肺瘤患者的生存期的方式，调 节癌性疾病过程的单克隆抗体和其抗体-配体。
"CDMAB相关的结合剂"使用其最宽泛的涵义，应理解为包括， 但不限于，任何形式的人或非人抗体、抗体片段、抗体配体等，其竟争 性地与至少一个CDMAB靶抗原决定簇结合。
"竟争性结合剂"应理解为包括任何形式的人或非人抗体、抗体片 段、抗体配体等，其与至少一CDMAB靶抗原决定簇具有结合亲合力。
待治疗的肿瘤包括原发性肺瘤、转移瘤以及耐受性肿瘤。耐受性肿 瘤包括对用单独的化学治疗剂、单独的抗体、单独的放射或其结合的治 疗不应答或产生抗性的肿瘤。耐受性肿瘤还包括这样的肿瘤看起来通 过用这样的试剂治疗而被抑制，但在治疗中断后5年、有时一直到10年 或更长的时间复发的肺瘤。
能够^f皮治疗的肿瘤包括未形成血管的或基本上未形成血管的肿瘤， 以及形成血管的肿瘤。能够因此治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、 结肠直肠癌、胰腺癌、胶质瘤和淋巴瘤。这样的肿瘤的一些实例包括表 皮样肿瘤、鳞状上皮肿瘤，诸如头颈部肿瘤、结肠直肠胂瘤、前列腺瘤、 乳腺肿瘤、肺胂瘤(包括小细胞肺肿瘤、非小细胞肺肿瘤)、胰腺肿瘤、 甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤以及肝肿瘤。其它的实例包括卡波西肉瘤、中 枢神经系统肿瘤、神经母细胞瘤、毛细血管性血管母细胞瘤、脑膜瘤和 脑转移瘤、黑色素瘤、肠胃和肾的癌和肉瘤、横紋肌肉瘤、优选多形性 胶质母细胞瘤的胶质母细胞瘤和平滑肌肉瘤。
本发明中使用的"抗原结合区"指识别靶抗原的分子部分。
本发明中使用的"竟争性抑制"是指通过常规的抗体相互竟争分析(Belanger L,Sylvestre C.和Dufour D. (1973)， Enzyme linked immunoassay
for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟争和夹心法
的曱胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48， 15),能够识别和结
合由IDAC 141205-05杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC 141205-05 抗体)针对的抗原决定表位。
本发明中使用的"靶抗原"指IDAC 141205-05抗原或其部分。
本发明中使用的"免疫偶联剂"指以化学或生物学方式连接到细胞 毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分、酶、 毒素、抗肿瘤药或治疗剂的诸如抗体的任一分子或CDMAB。只要能够 与其靶标结合，该抗体或CDMAB可以在其分子的^f壬一部位与细胞毒素、 放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分、酶、毒素、 抗肿瘤药或治疗剂连接。免疫偶联剂的实例包括抗体毒素化学偶联剂和 抗体-毒素融合蛋白。
适于用作抗肿瘤试剂的放射性试剂对本领域技术人员而言是公知 的。例如，使用131I或211At。使用常规技术(例如Pedley w a/.， Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993))将这些同位素结合到抗体。或者，结合到抗体的所述抗 肿瘤试剂是活化前药的酶。给予前药，其将保持非活性形式直到到达肿 瘤部位，在该肿瘤部位， 一旦给予抗体复合物则所述前药转化为其细胞 毒素形式。在实践中，将抗体-酶偶联物给予患者并允许其定位于待治疗 的组织区域。然后将所述前体药物给予患者以使向细胞毒性药物的转化 发生在欲被治疗的组织区。或者，与抗体偶联的抗肺瘤试剂是细胞因子， 例如白介素-2 (IL-2)、白介素-4(IL-4)或肺瘤坏死因子q(TNF-Q!)。抗体将 细胞因子靶向肿瘤以使所述细胞因子在不影响其它组织的情况下，介导 对肿瘤的损伤或破坏。使用常规的重组DNA技术在DNA水平将细胞因 子融合到抗体。还可以使用干扰素。
本发明中使用的"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其中抗原结合区与 例如毒素、酶、荧光蛋白、发光标记物、多肽标签(polypeptide tag)、细胞 因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分、或蛋白药物的生物活性分子 连接。
本发明还涉及与靶标部分或报告分子部分连接的本发明的CDMAB。靶标部分是结合对的第一成员。例如，抗肿瘤药剂与这样的对的第二成 员偶联并因此针对与抗原结合蛋白结合的位点。这样的结合对的常见实
例是抗生物素蛋白和生物素。在优选的实施方案中，生物素与本发明的
CDMAB的靶抗原偶联，并因此为抗肿瘤药剂或与抗生物素蛋白或抗生 蛋白链菌素偶联的其它部分提供了靶标。可选择地，生物素或另一种这 样的部分与本发明的CDMAB的靶抗原相连接，并且被用作报告分子， 例如在诊断系统中，其中可检测的信号产生剂偶联到抗生物素蛋白和抗 生蛋白链菌素。
可检测的信号产生剂用于体内和体外的诊断目的。信号产生剂产生 可通过外部装置检测的可测量信号，通常是通过电磁辐射的测量。大部 分情况下，所述信号产生剂是酶或生色团，或者通过荧光、磷光或化学 发光而发光。生色团包括在紫外或可见光区域吸收光的染料，并且可以 是酶催化反应的底物或降解产物。
此外，本发明的CDMAB用于体内和体外的、本领域公知的研究或 诊断方法包含在本发明范围内。为了进行如本文涉及的诊断方法，本发 明还可包括包含本发明CDMAB的试剂盒。这种试剂盒通过4企测CDMAB 耙抗原在个体的细胞上的过表达，将用于识别有患某些类型肿瘤风险的 个体。
诊断分析试剂盒
以诊断分析试剂盒的形式利用本发明所述的CDMAB来确定肿瘤的 存在是被考虑的。通常，基于一种或多种肿瘤特异性抗原的存在会在患 者中检测出肿瘤，所述肿瘤特异性抗原例如蛋白和/或在生物样本中编码 这样的蛋白的多核苷酸，所述生物样本例如血液、血清、尿和/或肿瘤活 组织检查，所述样本已从患者中获得。
所述蛋白作为显示特定肿瘤存在或不存在的标记物，例如结肠肿瘤、 乳腺肿瘤、肺肿瘤或前列腺肿瘤。还涉及所述抗原将用于检测其它癌性 肿瘤。将包含本发明的CDMAB的结合剂或CDMAB相关的结合剂包含 于诊断分析试剂盒中，使与生物样本中的试剂相结合的抗原的水平能够 被检测。多核苷酸引物和探针可用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA的水平，所述mRNA水平还指示癌症的存在或不存在。为了使结合分析具有i會断 价值，产生与抗原的显著水平在统计学上相关的数据以使结合的识别对 癌性肿瘤的存在有决定性的诊断价值，所述显著水平相对于在正常组织 内存在的抗原水平。为了使用结合剂以检测样本中的多肽标记物，预期 多种形式将用于本发明的诊断分析，正如本领域普通技术人员公知的。 i"列^口,长口在Harlow禾口 Lane , Antibodies: A Laboratory Manual (才元体实马全 室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988中所示例的。还涉及前述i貪 断分析形式的任何以及全部的组合、变换或修饰。
通常，通过以下步骤检测患者中癌症的存在或不存在(a)将从患者 中得到的生物样本与结合剂接触；(b)检测样本中与结合剂结合的多肽的 水平；以及(c)将该多肽水平与预定的临界值进行比较。
在示例性实施方案中，涉及所述分析将包括使用固定在固体载体上 的基于CDMAB的结合剂以结合并且移除来自样本的残余物中的多肽。 然后可以使用含有报告分子基团并且与结合剂/多肽复合物特异性结合的 检测试剂检测结合的多肽。示例性的检测试剂可包括与多肽或抗体特异 性结合的基于CDMAB的结合剂或与结合剂特异性结合的其它试剂，例 如，抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。在可选择的实施方案中， 涉及使用竟争性分析，其中多肽用报告分子基团标记并在结合剂与样本 孵育后，多肽被允许与固定的结合剂结合。样本组分抑制标记的多肽与 结合剂结合的程度指示样本与固定的结合剂的反应性。用于这样的分析 的合适的多肽包括全长胂瘤特异性蛋白和/或其部分，其与结合剂具有结 合亲和力。
诊断试剂盒会带有载体，所述载体可以是本领域普通技术人员公知 的任何材料的形式，蛋白可附于其上。合适的实例可包括在微量滴定板 或硝化纤维或其它合适的膜中的试验孔。可选择地，所述载体可以是诸 如玻璃、玻璃纤维、胶乳的珠或盘或者诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑性 材料。该载体还可以是磁性粉末或光纤传感器，例如在美国专利5,359,681 中所/>开的那些。
本发明涉及使用在专利和科学文献中详细描述的、本领域技术人员 公知的多种技术将结合剂固定在所述固体载体上。术语"固定，，是指诸如吸附的非共价结合，以及共价结合，其在本发明的上下文中可以是在 试剂与载体上的官能团之间的直接连接，或者可以是通过交联剂的方式 连接。在优选的但非限定性实施方案中，优选通过吸附至微量滴定板中 的孔的固定或通过吸附至膜的固定。可通过将结合剂在合适的缓沖液中 与固体载体接触合适的时间而实现吸附。接触时间可随温度而变化，并
且通常在约1小时至约1天的范围内。
反应而实现，所述双功能试剂能够与载体和在结合剂上的官能团(例如羟 基或氨基基团)均反应。例如，可使用苯醌或通过载体上的醛基基团与结 合伴倡上的胺和活性氢缩合而将结合剂共价连接至具有合适的聚合物涂
层的载体(参见,例如,Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (Pierce免疫技术目录和手册)，1991， at A12 A13)。
还涉及所述诊断分析试剂盒会采用双抗体的夹心分析的形式。可通 过首先将抗体，例如本文公开的、被固定在固体载体上的CDMAB，与 样本相接触来进行该分析，以致样本中的多肽能够结合到固定的抗体， 所述CDMAB已经被固定于固体载体，通常是微孔板的孔。然后从固定 的多肽-抗体复合物中除去未结合的样本并加入含有报告分子基团的检测 试剂(优选能够结合至多肽上不同位点的二抗)。然后使用适于特定报告分
子基团的方法测定与所述固体载体保持结合的检测试剂的量。
在具体的实施方案中，涉及一旦所述抗体如上所述被固定在载体上，
所述载体上剩余的蛋白结合位点将通过使用本领域普通技术人员已知的 任何合适的封闭剂，例如牛血清白蛋白或Tween 20TM (Sigma Chemical Co.， St. Louis, Mo.)被封闭。然后，固定的抗体将与样本孵育，使多肽与 所述抗体结合。在孵育之前，可以用合适的稀释剂，例如磷酸緩冲盐 (PBS),稀释所述样本。通常，选择合适的接触时间(即，孵育时间)以对 应足以检测样本中多肽的存在的时间，所述样本从带有特定选择的肿瘤 的个体中获得。优选地，所述接触时间为足以达到在结合的与未结合的 多肽之间平衡时所获得的水平的至少约95%的结合水平。本领域普通技 术人员会认识到，达到平衡所需的时间可通过对一段时间出现的结合水 平的分析而容易地确定。本发明还涉及未结合的样本随后通过用合适的緩冲液冲洗所述固体 载体而被除去。然后将包含报告分子基团的二抗加至所述固体载体中。 然后，将检测试剂与固定的抗体-多肽复合物的孵育进行一段时间以足够 检测结合的多肽。接着，除去未结合的检测试剂并使用报告分子基团检 测结合的检测试剂。检测报告分子基团所使用的方法必须对所选择的报 告分子基团的类型是特异的，例如对于放射性基团，闪烁计数或放射自 显影方法通常是适合的。光谱法可用于检测染料、发光基团和荧光基团。 使用与不同报告分子基团(通常为放射性的或焚光的基团或酶)偶联的抗 生物素蛋白可4企测生物素。酶报告分子基团通常可以通过添加底物(通常 为特定的一^殳时间)然后对反应产物进行光谱分析或其它分析来检测。
为了利用本发明的诊断分析试剂盒以确定例如前列腺癌的癌症存在 或不存在，通常，将由与固体载体保持结合的报告分子基团检测到的信 号与对应于预定的临界值的信号进行比较。例如，检测癌症的示例性临 界值可以是当固定的抗体与来自没有癌症的患者的样本孵育时得到的平 均信号的平均值。通常，产生高于预定临界值约三个标准偏差的信号的
样本将被视为癌阳性的。在可选择的实施方案中，依照Sackett "/， Clinical Epidemiology. A Basic Science for Clinical Medicine (临床流行病 学，临床医学的基础学科)，Little Brown and Co., 1985, p. 106-7所述的方 法，可通过使用受试者工作曲线来确定所述临界值。在这样的实施方案 中，所述临界值可以由对应于诊断测试结果的每个可能临界值的成对的 真阳性率(即，敏感性)和假阳性率(100%-特异性)的曲线来确定。在该曲
线上，最靠近左上角的临^H直(即，包含最大面积的值)是最准确的临界值， 产生高于由该方法确定的临界值的信号的样本可被视为阳性的。可选择 地，该临界值可沿该曲线向左移动以^/假阳性率最小，或向右移动以使 假阴性率最小。通常，产生高于由该方法确定的临界值的信号的样本被 视为癌阳性的。
涉及由所述试剂盒实现的诊断分析将以流动(flow-through)或检验条 的形式进行，其中结合剂被固定在膜上，例如硝酸纤维素。在流动测试 中，当样本经过膜时，.在样本中的多肽与固定的结合剂结合。然后，当 含有第二结合剂的溶液流经该膜时，被标记的第二结合剂与结合剂-多肽复合物结合。然后，可如上所述对结合的第二结合剂进行检测。在检验 条的形式中，将结合剂结合的膜的一端浸入含有样本的溶液中。该样本 沿着该膜移动，经过含有第二结合剂的区域并移动至固定的结合剂的位 置。第二结合剂在固定的抗体位置的集中提示癌症的存在。在结合位点 产生视觉上能够观察到的图案，例如直线，提示阳性测试。没有出现这 样的图案表示阴性结果。通常，在上述的形式中，当生物样本包含的多 肽水平足以在该双抗体夹心分析中产生阳性信号时，选择固定在膜上的 结合剂的量以产生视觉可辨别的图案。用于本诊断分析的优选结合剂为
本文公开的抗体、其抗原-粘合片段以及如本文所述的任何CDMAB相关
的结合剂。固定在膜上的抗体的量为任一有效产生诊断分析的量，并可
在约25纳克至约1毫克的范围变化。通常，这样的分析可用很少量的生 物样本进行。
此夕卜，由于本发明的CDMAB识别其靶抗原的能力，其可用于实验 室的研究。
为了可以更全面地理解本文所述的发明，进行下述说明。 本发明提供特异识别和结合IDAC 141205-05抗原的CDMAB (即， ID AC 141205-05 CDMAB)。
以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的CDMAB可以是任何形式，只要其具有竟争性抑制IDAC 141205-05杂 交瘤产生的分离的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合的抗原结合 区。因此，与IDAC 141205-05抗体具有相同结合特异性的任何重组蛋白 (例如，融合蛋白，其中该抗体与诸如淋巴因子的第二蛋白或胂瘤抑制性 生长因子结合)都在本发明的范围内。
在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB为IDAC 141205-05抗体。 在另一个实施方案中，所述CDMAB为抗原结合片段，所述抗原结 合片段可以是Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab分子、Fab，分子、F(ab，)2 分子、融合蛋白、双特异性抗体、异种抗体或具有IDAC 141205-05抗体 的抗原结合区域的重组分子。本发明的CDMAB针对的抗原决定蔟是 IDAC 141205-05单克隆抗体针对的抗原决定簇。
可修饰本发明的CDMAB,即，在分子内通过氨基酸修饰，以便产生衍生的分子。还可以是化学修饰。还可以是通过直接突变、亲和力成 熟的方法、噬菌体展示或链替换的修饰。
通过使CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基突变以及对具有所需特 性的抗原结合位点进行筛选，能够修饰或改善亲和力和特异性(例如， Yang W fl/， J. Mol. Biol., (1995) 254: 392-403)。 一种方法是使单个的残基或 残基组合随机排列以使在否则完全相同的抗原结合部位群中，在特定的 位置找到两个到二十个氨基酸的亚群。或者，可以通过错配PCR方法诱 导多个残基突变(例如Hawkins " a/, J. Mol. Biol.， (1992) 226: 889-96)。在 另 一 实例中，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体能够在大肠 杆菌(E. coli)的增变基因系中繁殖(例如，Low e《a/, J. Mol. Biol" (1996) 250: 359-68)。这些突变的方法用以示例本领域4支术人员已知的许多方法。
增加本发明抗体的亲和力的另一方法是进行链替换，其中，所述重 链或轻链与其它重链或轻链随机配对以制备具有更高亲和力的抗体。抗 体的多种CDRs还可与其它抗体中相应的CDRs替换。
衍生分子将保留多肽的功能特性，即，具有这种取代的分子仍将允 许多肽与IDAC 141205-05抗原或其部分的结合。
这些氨基酸取代包括但不必限于在本领域中已知的"保守"的氨基 酸取代。
举例来说，被称为"保守氨基酸取代"的某些氨基酸取代能够在蛋 白中频繁出现，但并不改变所述蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中 已建立的法则。
这些改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一种取代任 何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷 氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N),反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸 (T)，反之亦然。依据特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用， 其他的取代也可以被认为是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可 经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的蛋氨酸(M)可以经常与 亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R) 经常互换，其发生部位氨基酸残基的重要特征是其带电特性，而这两种 氨基酸残基的不同的pK并不重要。在特定环境中，仍有其他的变化可以被认为是"保守的"。 实施例1
制备杂交瘤-杂交瘤细胞系AR47A6.4.2
根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR47A6.4.2于2005年12月14 日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC)，位于加拿大马尼托巴省温 尼伯市阿林顿街道1015的加拿大卫生部樣i生物局，R3E 3R2，保藏号为 141205-05。依据37 CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可 撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。如果保藏中保藏样本不 存活，应替换保藏物。
为了制备产生AR47A6.4.2抗癌抗体的杂交瘤，在PBS中制备冷冻 的人卵巢肿瘤组织(子宫内膜样腺癌；Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的单细胞悬浮液。将IMMUNEASY (Qiagen， Venlo, Netherlands)佐 剂轻轻混合后备用。通过皮下注射含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂来 免疫5周至7周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2周至5周，用新鲜制 备的含约2百万个细胞的50微升至60微升抗原-佐剂腹腔注射加强 AR47A6.4.2免疫鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的 脾细胞与NSO-l骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆 融合的上清液。
为了检测杂交瘤分泌的抗体是IgG还是IgM同种型，进行ELISA分 析。将4。C包被缓冲液(O.l M碳酸盐/碳酸氢盐緩冲液，pH 9.2-9.6)中的 浓度为2.4 /xg/ml的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L)按100 jd/孔加入ELISA 板过夜。该ELISA板用洗涤缓冲液(PBS + 0.05% Tween-20)洗三次。按 100 Ad/孔加入封闭緩沖液(5%奶洗涤緩冲液)，室温1小时，随后用洗涤 緩沖液洗三次。按100/il/孔加入杂交瘤上清液，将该板室温孵育l小时。 该板用洗涤緩冲液洗三次，按100 /il/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣 根过氧化物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含1%奶的PBS稀释)。室温 孵育l小时后，该板用洗涤緩冲液洗三次。按100gl/孔加入TMB溶液， 室温孵育1至3分钟。按50 yl/孔加入2M H2S04,终止颜色反应，用 Perkin-Elmer HTS7000酶标仪在450 nm波长处读板。如图1所示，AR47A6.4.2杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型 分斗斤"i式剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit) (HyCult Biotechnology, Frontstraat， Netherlands)进行同种型分型(isotyping)实马全。将 500 ^緩沖液加入含有大鼠抗小鼠亚类特异性抗体的测试条。将500卩l 杂交瘤上清液加入试管并通过轻轻搅拌而浸没。捕获的小鼠免疫球蛋白 通过与胶体颗粒偶联的第二小鼠单克隆抗体直接检测。这两种蛋白的结 合产生用于分析该同种型的可见信号。抗癌抗体AR47A6.4.2是IgG2a， k同种型。
经过一轮限制稀释，在细胞ELISA测定系统中，检测杂交瘤上清液 中与靶细胞结合的抗体。检测了两种人卵巢癌细胞系和一种人正常皮肤 细胞系分别是OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk。除了 OCC-l，所有细 胞系来自美国典型培养物保存中心(ATCC; Manassas, VA)。 OCC-l卵巢癌 细胞系由渥太华区域癌症研究中心(Ottawa, ON)获得。
板内的细胞在使用前先固定。室温下，该板用含MgCl2和CaCU的 PBS洗三次。每孔加PBS稀释的2%的多聚曱醛100 /*1，室温10分钟， 然后弃掉多聚曱醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室温下洗涤该板三 次。每孔加100 pi 5。/。奶洗涤液(PBS + 0.05% Tween-20)进行封闭，室温1 小时。该板用洗涤液洗三次，按75/xl/孔加入杂交瘤上清液，室温孵育1 小时。用洗涤緩冲液将该板洗三次，按100 /xl/孔加入辣根过氧化物酶偶 联的山羊抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含1%奶的PBS稀释)。 室温孵育1小时后，该板用洗涤緩沖液洗三次，每孔加入100/xlTMB底 物，室温孵育1-3分钟。每孔加入50 /il 2 M H2S04终止反应，用 Perkin-Elmer HTS7000酶标仪在450 nm波长处读板。如图1列表所示， 结果表示为与内部(in-house)的IgG同种型对照相比，高出背景的倍数， 事先已经证明该对照不与所才企测的细胞系结合。AR47A6.4.2杂交瘤分泌 的抗体对卵巢癌细胞系OVCAR-3表现出结合。对正常的皮肤细胞系 CCD-27sk, AR47A6.4.2未表现出可4全测水平的结合。
进行抗体结合试马全的同时，在OCC-l 、 OVCAR-3和CCD-27sk这 些细胞系上，检测了杂交瘤上清液的细胞毒性作用。钙黄绿素(calcein AM)购自Molecular Probes (Eugene, OR)公司。根据制造商的说明书以及如下 所述的变化进行分析。在分析前，将细胞根据预先确定的适当密度进行 铺板。两天后，将75 /il来自杂交瘤微孔板的上清液转移到细胞培养板中， 在5°/。 C02孵箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100 /il叠氮化钠 (NaN3)或放线菌酮。经过5天的处理后，倒空反应板的液体并吸干。通过 多通道塑料挤瓶，将含MgCl2和CaCl2的室温DPBS (Dulbecco's磷酸盐缓 冲液)分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50/d用含MgCl2 和CaCl2的DPBS稀释的荧光染料钙黄绿素，在37。C含5。/。C02的孵箱 内孵育30分钟。该板置于Perkin-ElmerHTS7000荧光读板仪内读数，数 据用Microsoft Excel进行分析。结果在图1的表格中列出。AR47A6.4.2 杂交瘤上清液对OVCAR-3细胞产生了 20%的特异性细胞毒性作用，其 分别是阳性对照叠氮化钠和放线菌酮的细胞毒性作用的29%和31%。图 1的结果表明AR47A6.4.2的细胞毒效应与其对这些癌细胞型的结合水平 成比例。与OCC-l细胞相比，在OVCAR-3细胞中产生更高水平的细胞 毒性作用，这与OVCAR-3细胞中较高水平的结合一致。如图1列表所示， AR47A6A2在CCD-27sk正常细胞系中未产生细胞毒性作用。已知的非 特异性的细胞毒物质放线菌酮和叠氮钠普遍产生了预期的细胞毒性作 用。
实施例2
体外结合
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville, ON)中培养所述杂交瘤 来制备AR47A6.4.2单克隆抗体，每星期进行两次收集和再接种。然后用 蛋白G琼脂4唐4 '决;危(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urft， QC)进行标准的抗体纯化操作。利用去免疫原性 的、人源化的、嵌合的或鼠源化的单克隆抗体均属于本发明的范围。
用流式细胞仪(FACS)评价了 AR47A6.4.2与胰腺(BxPC-3、 AsPC-1和 PL45)、结肠(DLD-1、 Lovo、 SW1116、 HT-29和Colo-205)、乳腺 (MDA-MB-468和MCF-7)、前列腺(PC-3和DU-145)、肺(NCI-H520和 A549)、食道(T.Tn)、甲状腺(SW579)、头和颈(FaDu)及卵巢(OCC-l、 C-13、OVCA-429、 Sk-OV-3、 OV2008、 Hey、 A2780-cp、 A2780-s和OVCAR画3) 癌细胞系以及来自皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888丄u)的非癌细胞系的结合。 除了大多数所述的卯巢癌细胞系外，所有细胞系均来自美国典型培养物 保存中心(ATCC; Manassas， VA)。 C-13、 OV2008、 Hey、 A2780-cp、 A2780-s、 OCC-l和OVCA-429卵巢癌细胞系来自渥太华区域癌症研究中心(Ottawa, ON)。
通过首先用DPBS(不含钙离子和镁离子)洗涤单层细胞来制备用于流 式细胞术(FACS)的细胞。然后在37。C条件下，用细胞解离緩沖液 (INVITROGEN, Burlington, ON)将细胞从细胞培养板上分离出来。离心收 集细胞，在4。C下，将细胞重悬在含MgCl2、CaCl2和2%胎牛血清的DPBS (标记培养液)中，记数，调整到合适的细胞密度，离心沉淀细胞，将其重 悬在4。C的标记液中，加入20/ig/mL的测试抗体(AR47A6.4.2)或对照抗 体(同种型对照，抗-EGFR),冰上放置30分钟。在加AlexaFluor546偶联 的二抗前，细胞用标记液洗一次。然后加入溶于标记培养液中的Alexa Fluor546偶联的二抗，4。C置30分钟。最后洗涤一次细胞，并将其重悬 在固定液(含1.5%多聚曱醛的标记培养液)中。通过在FACSarrayTM上运行 样本，使用FACSarrayTM系统软件(BD Biosciences, Oakville， ON)来评估流 式细胞计数的细胞获取结果。通过调整前向角散射(FSC)和侧向角散射 (SSC)探测器上的电压和振幅，设置细胞的FSC和SSC。运行未标记的细 胞来调整荧光(Alexa-546)通道的探测器，使这些细胞有一个统一的约为 1-5单位的中等荧光强度的波峰。对于每一个样本，约需要获取10,000 个门事件(标记的固定细胞)用于分析，结果见图3。
图2以高出同种型对照的倍增表示平均焚光强度。图3汇集了 AR47A6.4.2抗体代表性的直方图。AR47A6.4.2对胰腺癌细胞系BxPC-3 和PL45(分别为31.6倍和26.4倍)、结肠癌细胞系DLD-1、 HT-29和 Colo-205 (分别为91.5倍、22.1倍和44.9倍)、乳腺癌细胞系MDA-MB-468 (35.9倍)、头和颈癌细胞系FaDu (77.1倍)、食道癌细胞系T.Tn (26.9倍) 以及卵巢癌细胞系OV2008、 OVCAR-3和C-13 (分别为78.4倍、28.4倍 和43.6倍)显示出强结合。也检测到了 AR47A6.4.2与乳腺癌细胞系MCF-7 (5.4倍)、前列&*癌细胞系PC-3和DU-145 (分别为3.3倍和5.1倍)、肺癌细胞系NCI-H520(10.7倍)、结肠癌细胞系SW1116(1.8倍)和卯巢癌细胞 系Hey、 Sk-OV-3、 OCC-l和OVCAR-429(分别为6.6倍、1.9倍、10倍 和4.2倍)的结合。在这样的条件下未检测到与来自皮肤的非癌细胞系 (CCD-27sk)和来自肺的非癌细胞系(Hs888丄u)的结合。这些lt据表明 AR47A6.4.2显示出功能特异性，因为尽管与多种癌细胞系存在明显的结 合，但仅与测试的某些细胞系存在关联的细胞毒性作用。
实施例3
BxPC-3细胞的体内预防性胂瘤实验
实施例1和2表明AR47A6.4.2对人癌细胞系有抗癌特性，且与若干 不同的癌症具有可检测的结合。参见图4和5,颈背皮下注射的100 )Ul 生理盐水中的5百万个人胰腺癌细胞(BxPC-3)植入到6-8周的雌性SCID 小鼠。这些小鼠被随机分成3个治疗组，每组5只。移植癌细胞后第一 天，每组小鼠腹腔给予300 pd的AR47A6.4.2测试抗体(20 mg/kg)或緩冲 液对照，所述给予的液体由含2.7mMKCl、 lmMKH2P04、 137mMNaCl 和20 mM Na2HP04的稀释剂将储存液稀释后得到。随后抗体和对照样本 以相同的方式每周给药一次， 一共7周。大约每7天用测径器测量肿瘤 生长， 一直测到第8周或个体动物达到了加拿大动物保护协会(CCAC)规 定的指标。在研究过程中， 一周记录一次动物的体重。研究结束时，依 据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
在人胰腺癌预防性体内模型中，AR47A6.4.2抑制肺瘤生长，并减轻 肿瘤负荷。在种植后的第49天，也是治疗的最后一天，AR47A6.4.2治疗 组中肿瘤的平均体积比緩冲液对照治疗组肿瘤体积小53% (p<0.05;图4)。
在整个研究中，没有出现临床毒性症状。如图5所示的体重作为动 物健康和发育停止的指标。在组内，整个研究期间对照组体重有不显著 的10%的增加。AR47A6.4.2治疗组的体重也有不显著的增加，/人平均20 g至22.8 g的14%的增加。在治疗期结束时，各组间没有显著的体重差异。
总之，AR47A6.4.2在人胰腺癌异种移植模型中被良好地耐受，并降 低了肿瘤的负荷。实施例4
体内建立的BxPC-3细胞肿瘤试验
为了进一步测定AR47A6.4.2对人胰腺癌的BxPC-3模型的疗效，在 建立的BxPC-3异种移才直模型上测试该抗体。参考图6和7，颈背皮下注 射的100 生理盐水中的5百万个人胰腺癌细胞(BxPC-3)植入到6-8周的 雌性SCID小鼠。每周用测径器测量一次肺瘤生长。当在植入后第33天 该组的大多数达到85 mm3 (56至111的范围)的平均肿瘤体积时，将9只 小鼠随机分配至2个治疗组。每组小鼠腹腔给予300 /xl的AR47A6.4.2测 试抗体或缓沖液对照，所述抗体的剂量为20 mg/kg，所述给予的液体由 含2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释 剂将储存液稀释后得到。随后抗体以相同的方式每周给药3次， 一共10 次剂量，直到植入后的第53天。大约每7天用测径器测量肿瘤生长，直 到植入后第63天或直到个体动物达到了 CCAC规定的指标。在研究过程 中， 一周记录一次动物的体重。研究结束时，依据CCAC的指导方针， 所有的动物都采取安乐死。
在建立的人胰腺癌4莫型中，AR47A6.4.2显著减轻肿瘤负荷。在第54 天，给予最后一剂抗体后的一天，AR47A6.4.2治疗的动物的平均肿瘤体 积是对照治疗的动物的平均肿瘤体积的40%(p<0.0001;图6)。这些结果 与AR47A6.4.2的30%的平均T/C相一致。
每周测量的体重作为动物健康和发育停止的指标。如图7所示，研 究结束时，在抗体治疗组和对照组之间，平均体重没有显著差异。此外， 在整个研究期间，所有组的体重均没有显著变化。
总之，AR47A6.4.2在该建立的人胰腺癌异种移植模型中^皮良好地耐
受，并降低了肿瘤的负荷。AR47A6.4.2在人胰腺癌的预防性模型和建立 的模型中均显示出疗效。
实施例5
体内预防性的PL45细胞肿瘤试验
实施例3和4表明AR47A6.4.2对人胰腺癌细胞系有抗癌特性。为了 测定AR47A6.4.2对另 一种人胰腺细月包系的疗效，在PL45人胰腺癌的异种移植模型上测试该抗体。参见图8、 9和10，将颈背皮下注射的100/il PBS溶液中的5百万个人胰腺癌细胞(PL45)植入到8-10周的雌性SCID 小鼠。这些小鼠被随即分为2个治疗组，每组10只。植入后的第一天， 每组小鼠腹腔给予300 pi的AR47A6.4.2测试抗体(20 mg/kg)或緩冲液对 照，所述给予的液体由含2.7mMKCl、 lmMKH2P04、 137mMNaCl和 20mMNa2HPO4的稀释剂将储存液稀释后得到。随后，在研究过程中抗 体样本和对照样本每周给药一次。大约每7天用测径器测量钟瘤生长。 在抗体9次给药后结束治疗。在研究过程中， 一周记录一次动物的体重。 研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
在人胰腺癌的PL45预防性体内模型中AR47A6.4.2完全抑制了胂瘤 生长。当对照治疗组和抗体治疗组中所有小鼠几乎均存活时，如在第77 天，即最后一剂抗体之后的第20天所测量的，用ARIUS抗体AR47A6.4.2 的治疗，相对于缓冲液治疗组，减少了 PL45肿瘤生长接近100% (p=0.0005， t-试验)(图8)。在第102天，即末次剂量后的第45天，研究 仍在进行，此时，由于肺瘤体积的原因，对照组中的全部小鼠已经从研 究中移除。然而，AR47A6.4.2仍对肿瘤生长显示出几乎完全的抑制并且 在该组中的4只小鼠仍然存活(图9)。应说明的是，在第42至48天， AR47A6.4.2治疗组中的一只小鼠死于与抗体治疗无关的原因。此外，在 第48至55天，在抗体治疗组中的5只小鼠死于笼中水瓶的泄漏。在 AR47A6.4.2治疗组中死亡的所有6只小鼠仍发展有可测量的皮下PL45 肿瘤。因此，在第102天仍存活的4只小鼠不足以代表抗体治疗的生存 益处。
研究过程中，没有明显的临床毒性症状。每周测量的体重作为动物 健康和发育停止的指标。在整个研究过程中，所有组中的平均体重均增 加(图10)。在第13天至第"天，对照组的平均重量增加3.39 g (17.4%), AR47A6.4.2治疗组增加1.7 g (8.6%)。在治疗期间以及第77天，即末次 剂量后的第20天，各组的平均体重之间没有显著差异。
总之，AR47A6.4.2在该人胰腺癌异种移植模型中被良好地耐受，并 几乎完全抑制了肿瘤的生长。AR47A6.4.2治疗相对于緩沖液治疗还显示 出增加的存活率。因此，AR47A6.4.2在人胰腺癌的两种不同模型中均显示出疗步丈。
实施例6
体内预防性PC-3细胞肿瘤试验
实施例3、 4和5表明AR47A6.4.2对两种不同的人胰腺癌异种移植 模型有抗癌特性。为了测定AR47A6.4.2对不同人癌异种移植的模型的疗 效，在PC-3前列腺癌异种移植模型上测试该抗体。参考图11、 12和13， 颈背皮下注射的100 pi PBS溶液中的5百万个人前列腺癌细胞(PC-3)植入 到8至10周龄的雌性SCID小鼠。这些小鼠被随机分成2个治疗组，每 组10只。才直入后第一天，每组小鼠腹腔给予300 /il的AR47A6.4.2测试 抗体(20 mg/kg)或緩冲液对照，所述给予的液体由含2.7 mM KC1 、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂将々者存液稀释后得 到。随后，在研究期间，抗体样本和对照样本每周给药一次。大约每7 天用测径器测量胂瘤生长。在给予8次剂量后结束研究。在研究过程中， 一周记录一次动物的体重。研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有 的动物都采取安乐死。
AR47A6.4.2抑制人前列腺腺癌细胞的PC-3预防性体内模型中的肿 瘤生长。当对照治疗组和抗体治疗组中所有小鼠几乎均存活时，如在第 32天，即抗体治疗5剂之后的第5天所测量的，相对于緩冲液治疗组， 采用ARIUS抗体AR47A6.4.2的治疗减少了 PC-3肺瘤生长60.9% (p=0.00037， t-试验)(图ll)。在第47天，即末次剂量之前的3天，由于 肿瘤体积/损伤的原因，对照组中的全部小鼠已经从该研究中移除。然而， 在第77天，即抗体的末次剂量后的第27天，该研究仍在进行，其中， AR47A6.4.2治疗组中40%的小鼠仍存活(图12)。
研究过程中，没有明显的临床毒性症状。每周测量的体重作为动物 健康和发育停止的指标。在整个研究过程中，所有组中的平均体重保持 相对的恒定(图13)。在治疗期间或第32天，即给予抗体5次后，各组平 均体重之间没有显著差异。
总之，AR47A6.4.2在该人前列腺癌异种移植模型中被良好地耐受， 并显著抑制了肿瘤的生长。抗体治疗相对于对照组还显示出生存益处。AR47A6.4.2对两种不同的人癌症胰腺癌和前列腺癌，均显示出疗效。 实施例7
体内预防性的MCF-7细胞肺瘤实验
实施例3、 4、 5和6表明AR47A6.4.2对两种不同的人胰腺癌异种移 植模型以及前列腺癌异种移植才莫型有抗癌特性。为了测定AR47A6.4.2对 另一种人癌异种移植模型的疗效，在MCF-7癌异种移植模型上测试该抗 体。参考图14、 15和16，照射Balb/C棵鼠24小时(2.5Gy， Co6G),然后 在该小鼠右侧腹皮下注射200 ]Lil RPMI 1640中的2千万个人乳腺癌细胞 (MCF-7)。这些小鼠被随机分成2个治疗组，每组12只。植入后第一天， 每组小鼠以每20 g小鼠200 pl的体积经腹腔给予20 mg/kg的AR47A6.4.2 测试抗体或緩冲液对照。随后，在研究期间，抗体样本和对照样本以相 同方式每周给药一次。大约每周2次用测径器测量肿瘤生长。在注射抗 体8次后结束研究。在研究过程中， 一周记录2次动物的体重。当肿瘤 体积达到2000 ,3时处死小鼠，并且所有余下的小鼠在研究的第91天 4皮处死。
AR47A6.4.2抑制人乳腺癌的MCF-7预防性体内才莫型中的肿瘤生长。 采用八111118抗体八1147六6.4.2的治疗导致显著的胂瘤生长延迟。在治疗 的第18至35天，AR47A6.4.2诱导低于42%的T/C百分比值，并在第49 天时接近42%(在第18天为10.9。/。的最佳T/C百分比值)(图14)。在第53 天，治疗结束后，仍观察到57%T/C的AR47A6.4.2的治疗疗效。研究结 束时(第91天)，来自AR47A6.4.2治疗组的2只小鼠仍没有肿瘤。
研究过程中，没有临床毒性症状。体重每周测量2次并且作为动物 健康和发育停止的指标。仅在AR47A6.4.2治疗组中的第一周治疗期间观 察到体重增加的减少。之后，AR47A6.4.2治疗组和緩冲液对照组之间未 检测到显著体重变化(图15)。治疗期结束时，各组之间没有显著差异。
治疗后的生存益处(图16)与AR47A6.4.2给药相关。在治疗后第85 天，i爰沖液对照组达到100%的死亡率，而在治疗后第91天，仍有33.3% 的AR47A6.4.2治疗的小鼠存活。
总之，AR47A6.4.2在该人乳腺癌异种移植模型中被良好地耐受，并提供了生存益处。AR47A6.4.2对三种不同的人类癌症胰腺癌、前列腺 癌和乳腺癌，均显示出疗效。
实施例8
体内预防性的Colo 205细胞肿瘤实验
实施例3、 4、 5、 6和7表明AR47A6.4.2对两种不同的人胰腺癌异 种移植模型、人前列腺癌异种移植模型以及乳腺癌异种移植模型有抗癌 特性。为了测定AR47A6.4.2对另一种人癌异种移植模型的疗效，在Colo 205结肠癌异种移植—模型上测试了该抗体。参考图17和18，右侧腹皮下 注射的100 /il PBS溶液中的5百万个人结肠癌细胞(Colo 205)植入到8至 10周龄的雌性SCID小鼠。这些小鼠被随机分成2个治疗组，每组10只。 植入后第一天，每组小鼠腹腔给予300 ]Ul的AR47A6.4.2测试抗体(20 mg/kg)或缓冲液对照，所述给予的液体由含2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂将储存液稀释后得到。随后， 在前两周，抗体样本和对照样本每周给药一次并在另外的3周每周给药 两次。大约每3至4天用测径器测量肿瘤生长。在给予8次抗体后结束 治疗。在研究过程中，测量肺瘤时记录动物的体重。研究结束时，依据 CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
AR47A6.4.2抑制人结肠直肠腺癌细胞的Colo 205预防性体内冲莫型中 的胂瘤生长。如在第27天，即末次给予抗体前的第4天所测量的，相对 于緩冲液治疗组，采用ARIUS抗体AR47A6.4.2的治疗减少了 60.2%的 Colo 205肿瘤生长(p二0.0003851, t-试验)(图17)。
研究过程中，没有明显的临床毒性症状。每周测量的体重作为动物 健康和发育停止的指标。在治疗期间，各组之间的平均体重没有显著差 异(图18)。
总之，AR47A6.4.2在该人结肠癌异种移植模型中被良好地耐受，并 显著抑制了肿瘤的生长。AR47A6.4.2对4种不同的人类癌症胰腺癌、 前列lt癌、乳&装癌和结肠癌，均显示出疗效。在几种 iH人的人癌症疾病 模型中观察到了治疗益处，表明了该抗体在治疗包括人的其它哺乳动物 中的药理和药学益处。实施例9
通过免疫印迹对结合蛋白的鉴定
为了鉴定由抗体AR47A6.4.2识别的抗原，将细胞膜制备物进行十二 烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并转移至膜。用抗体 AR47A6.4.2作为探针检测该膜以使被所述抗体检测到的蛋白可视化。
1. 制备全部膜部分
从MDA-MB-231 (MB-23l)乳腺癌细胞的汇合培养物中制备全细胞 膜。从细胞培养室中移走培养基并且用磷酸緩沖盐(PBS)冲洗细胞。用解 离液(Gibco-BRL; Grand Island, NY)在37。C的平^反振荡器上解离细月包20 分钟。收集细胞并在4。C以900g离心10分4f。离心后，通过将细胞团 重悬在PBS中洗涤并将其在4。C以900g再次离心IO分钟。然后将细胞 团储存在-80。C备用。为了制备膜，将细胞团解冻并以每克细胞3 mL緩 沖液的比例重悬在匀浆缓沖液中，所述匀浆缓沖液含有每50 mL l片的 完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche; Laval QC)。在水上使用polytron匀浆器 将该细胞悬浮液进行匀浆，其目的是裂解细胞。将该细胞匀浆物以15,000 g在4。C离心IO分钟以除去核颗粒。收集上清液，分入试管中，然后在 4°C以75,600 g离心90分钟。小心移除上清液并将每个膜团重悬于约5 mL的匀浆i爰冲液中。合并所有试管中的膜团，再分一次，并在4。C以 75,600 g离心90分钟。小心移除上清液并将膜团称重。以每克膜团3mL 緩冲液的比例将含有1% TritonX-100的溶解緩冲液加入到所述膜团。通 过在水上的平板振荡器上以300rpm摇动1小时使膜溶解。将该膜悬浮液 以75,600 g离心分离以使不溶物成团。将含有溶解的膜蛋白的上清液从 试管中小心除去，分析蛋白浓度并在-80。C下储存。
2. 免疫沉淀反应， 一维SDS-PAGE和免疫印迹
如下进行AR47A6.4.2抗原的免疫沉淀反应用含有蛋白酶抑制剂的 IX RIPA緩沖液将全部膜部分稀释至1 mg/mL的最终蛋白浓度。将与 8A3B.6同种型对照抗体化学偶联的蛋白G琼脂糖珠(以每1 /xL沥干的珠 2 pg抗体的比例偶联)加入全部膜部分并在搅拌下于4°C孵育3小时。随 后，该样本以20000 x g离心8秒钟。除去上清液(未结合的部分)并将所 述珠置水上储存。将相同体积的、与AR47A6.4.2偶联的蛋白G琼脂糖珠(以每1 pL沥干的珠2pg抗体的比例偶联)加入来自前一步骤的TM蛋白 混合物上清液。在搅拌下于4°C将该样本孵育3小时。孵育后，如上所 述地离心分离该样本并保存所述珠。然后，用1 mL的RIPA緩冲液洗涤 所述同种型对照和AR47A6.4.2珠3次，并用IX PBS漂洗。通过在非还 原性样本緩冲液中煮沸这两种样本以及相同体积的AR47A6.4.2和 8A3B.6蛋白G琼脂糖偶联的珠('模拟IP'样本)以用于SDS-PAGE。通过 分别为5。/。的积层凝胶和10%的分离凝胶上的一维SDS-PAGE (1 D SDS-PAGE)分离来自MB-231细月包的全部膜部分的蛋白。通过电印迹将 蛋白在4。C过夜转移至PVDF膜(Millipore; Billerica, MA)。通过评估膜上 转移的预染分子量标志物来确定完全转移。转移后，在室温(RT)下用 TBST中的5。/。(w/v)脱脂乳封闭所述膜1小时，然后如下检测两个重复印 迹 一个印迹用抗体AR47A6.4.2 (5 mg/mL，在TBST中的5%脱脂乳中) 作为探针检测，重复的印迹用IgG2a同种型对照(5 mg/mL，在TBST中 的5%脱脂乳中)作为探针检测。在TBST中洗涤印迹3次，每次IO分钟， 然后用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgG (Fc) (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA)在室温下孵育1小时。用TBST洗涤3次后(每 次10分钟)，按照厂商的说明书，用ECL PlusTM试剂盒(GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)使该印迹显 影。用水漂洗该印迹，通过凝胶成像系统(Bio-Rad; Hercules, CA)获得影 像。在照相机焦距、光圈和图象获取时间相同的条件下使印迹成像。
在图19中，当抗体AR47A6.4.2用作蛋白印迹的探针时，与MB-231 细胞的全部膜部分中具有约50kDa的表观分子量的蛋白明显结合，但未 与PC-3细胞或CCD-27sk细胞的全细胞裂解物结合。在图20中，抗体 AR47A6.4.2特异识别来自MB-231全部膜部分的通过AR47A6.4.2偶联的 蛋白G琼脂糖珠免疫沉淀的、表观分子量为约50kDa的蛋白。能够观察 到由探针AR47A6.4.2识别的条带与观察到的通过单独的二抗的交叉反应 产生的条带明显不同，所述二抗代表从蛋白G珠漏出的IgG和IgG重链。
化作用。在非还原性条件下，用酶去糖基化试剂盒(Prozyme, San Leandro， CA)或^f又用去糖基化緩冲液处理通过与AR47A6.4.2或与同种型对照抗体免疫沉淀从MB-231全部膜部分获得的免疫复合物，所述酶去糖基化试 剂盒包含除去特定糖类基团的糖肽酶F、 O-聚糖酶、唾液酸酶、风l-4)半 乳糖苷酶和^-N-乙酰氨基葡萄糖苦酶的混合物。在37。C孵育24小时后， 将该样本进行ID SDS-PAGE和蛋白印迹。预期如果某些酶除去占由抗体 AR47A6.4.2识别的抗原的质量的很大部分的一部分糖类，则可通过 SDS-PAGE4企测出该差异。图21显示糖苷酶处理从MB-231 TM部分获 得的免疫复合物导致所识别的抗原的质量显著降低。这表明由 AR47A6.4.2抗体识別的抗原包含至少一种糖蛋白。
实施例10
鉴别被AR47A6.4.2结合的抗原
1.大规冲莫免疫沉淀来自MB-231全部膜部分的抗原
通过用含有蛋白酶抑制剂混合物的IX RIPA缓冲液将其稀释为1 mg/mL的终浓度制备来自MB-231细胞的全部膜部分提取物(9.4 mg)。通 过在搅拌下于4°C与蛋白G-琼脂糖珠(5 mL沥千的珠)孵育2小时而预清 除全部膜部分提取物。离心分离后除去所述珠并加入储存液牛血清白蛋 白(BSA) (10 mg/mL)成为0.5 mg/mL的最终BSA浓度。当提取物被预清 除时，用1 mL 0.5 mg/mL的BSA通过在4°C孵育2小时来封闭 AR47A6.4.2和8A3B.6同种型对照抗体偶联的蛋白G-琼脂糖珠(与60 pl 蛋白G琼脂糖化学交联的120 /xg抗体)。封闭后，用IX RIPA緩沖液洗 涤抗体偶联的珠两次，每次5分钟。然后用同种型对照(8A3B.6)偶联的蛋 白G-琼脂糖珠(60 /il沥干的珠，120 pg IgG)在直立圆筒旋转器上于4。C 搅拌下与全部膜提取物孵育2小时。在4。C、以20,000 g离心分离10秒 钟后，移走并保存上清液(未结合的部分)，并洗涤所述珠3次，每次5分 钟，每一洗涤步骤都用lmLRIPA緩冲液。然后用1.5mLPBS漂洗所述 珠一次，接着在水上储存。然后在搅拌下于4。C将保存的上清液(未结合 的部分)与AR47A6.4.2偶联的蛋白G-琼脂糖珠(60 沥干的珠，120 IgG)孵育2小时。在4。C、以20,000 g离心分离IO秒钟后，移走并保存 上清液(未结合的部分)，并洗涤所述珠3次，每次5分钟，每一洗涤步骤 都用1 mL RIPA緩冲液。然后用1.5 mL PBS漂洗所述珠一次，在-80。C保存TM部分提取物，同时在水上储存所述珠。同种型对照珠和两个含 有AR47A6.4.2蛋白G-琼脂糖偶联珠的等分试样(一个用于免疫沉淀步骤 而第二个等分试样包含相同体积的珠但不用于IP (称为"模拟"IP))。然
后所述珠在-85。C储存过夜。为了制备用于SDS-PAGE的样本，每个含 有抗体偶联蛋白G-琼脂糖珠的样本(样本AR47A6.4.2 IP、 AR47A6.4.2 "模 拟"IP和8A3B.6同种型对照IP)分为两个30 /il的等分试样。将60 jtd的 IX非还原性SDS-PAGE样本緩冲液加入每个样本的一个等分试样。煮沸 4分钟后，该样本緩冲液被移去并转移至含有来自同一样本的第二个等分 试样的试管中。然后将该集中的样本煮沸4分钟。在水上冷却后，将每 个样本载入两个分离的凝胶(所述样本的1/10在一个凝胶中，用于通过蛋 白印迹的检测，余下的9/10在另一凝胶上，用于通过用胶体蓝染色的抬r 测)。将用于蛋白印迹的凝胶以320 mA转移2小时至PVDF膜上，用去 离子水洗涤，在室温下用溶于TBST的5%奶封闭1小时，然后同样在室 温下用溶于TBST的5%奶孵育2小时。印迹在TBST中洗涤3次，每次 10分钟，并在室温下用溶于TBST的5%奶中的辣根过氧化物酶偶联的 Fc-特异性山羊抗小鼠IgG(l:50000)孵育1小时。然后洗涤印迹3次，每 次IO分钟，并按照厂商的推荐通过使用增强的化学发光检测系统使所述 印迹显影。用于蛋白染色的凝胶与考马斯胶体蓝染色液孵育过夜并用超 纯水脱色48小时。 2.通过质谱的肽图分析和抗原鉴定
通过以上试验，使用来自分子量标志物的条带作为参考比对蛋白印 迹和考马斯胶体蓝染色凝胶的图像(图22)。使用巴斯德玻璃吸管，将来
条带取出中心部分。如图23所示，所有对照泳道(AR47A6.4.2 '模拟IP' 和8A3B.6同种型对照IP)的等同区域以及来自不含任何样本的凝胶区的 等同区域也被取出中心部分，其中左侧组和右侧组分别为在取出中心部 分前和后的凝胶图像。将凝胶块(gel plugs)分为含有相似量凝胶块的两等 份。 一套等分部分在4。C储存，同时重复的等分部分用商品化的试剂盒 (Pierce, Rockford, IL)进行凝胶内胰蛋白酶消化。
来自每一种消化物的等分部分均在SELDI-TOF Ciphergen PBSIIc阅读器(Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA)上进4亍质i普分冲斤。简言之， 来自每一种消化物的等分部分均手动点样至H4芯片上(Ciphergen Biosystems Inc.， Fremont, CA)。干燥后，将CHCA基质(a-氰基4-羟基肉 桂酸；Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA)的等分部分加入芯片上的 相同的点上并使其干燥。然后在PBSIIc阅读器上分析该样本。将来自同 种型对照泳道和空白凝胶区的平行区域的相似大小的条带与来自 AR47A6.4.2IP的凝胶块并行处理，以便能够测定通过由AR47A6.4.2免 疫沉淀的抗原的消化而产生的独特肽片段(图24)。使用PROFOUND检索 这些独特肽片段的质量，所述PROFOUND是使用来自质镨图信息检索 蛋白序列数据库的公众可利用的在线工具。然后，将来自AR47A6.4.2 IP 消化的样本中的独特肽在QSTAR (Applied Biosystems, Foster City, CA)上 进行MS/MS分析，所述QSTAR配有能够分析之前在PBSIIc阅读器上分 析的相同样本点的界面。然后用MASCOT分析MS/MS数据，所述 MASCOT是使用来自MS/MS谱图信息检索蛋白数据库的公众可利用的 在线工具。提示为推定候选物的、具有很高可信度的唯一的蛋白是 TROP-2。图25是来自MASCOT索的概要。示出了 SEQIDNO:9。被鉴 定具有高概率度的唯一蛋白是TROP-2，支持之前通过MS肽质量指紋分 析的鉴定。
3. AR47A6.4.2抗原ID的确认
通过确定已知的抗人类TROP-2单克隆抗体(克隆77220.11, R&D Systems, Minneapolis, MN)是否与由AR47A6.4.2免疫沉淀的蛋白反应来 确认AR47A6.4.2的推定抗原的ID。还通过由转染真核细胞纯化的重组 人TROP-2的免疫印迹进行进一步的确定。通过ID SDS-PAGE及随后的 免疫印迹分析用单克隆抗体AR47A6.4.2和8A3B.6 IgG2a同种型对照制 备的溶于IXRIPA緩冲液中的MB-231全部膜部分提取物的免疫沉淀物， 以及AR47A6.4.2 '模拟IP'阴性对照(如上所述)。在重复凝胶上分析来自各 免疫复合物样本的等体积部分。电印迹至PVDF膜上后，对来自重复凝 胶的印迹用单克隆抗体AR47A6.4.2、抗人TROP-2作为探针与用IgG2a 同种型对照作为探针并行检测。图26显示来自交叉IP试验的结果，其 中通过免疫印迹分析由测试单克隆抗体AR47A6.4.2免疫沉淀的物质。单克隆抗体AR47A6.4.2和抗人TROP-2克隆7220.11的每一种都特异地与 由AR47A6.4,2免疫沉淀的相似抗原发生交叉反应。然而，同种型对照抗 体8A3B.6不与任何特异性条带发生交叉反应。此外，用于探测蛋白印迹 的抗体不与任何阴性对照免疫复合物上的条带发生交叉反应。该数据表 明，由AR47A6.4.2抗体识别的抗原决定簇包含于TROP-2抗原内。
为了进一步确定AR47A6.4.2与人TROP-2抗原直接结合，通过针对 包含人TROP-2的细胞外域和人IgGl的Fc区的重组融合多肽的免疫印 迹对AR47A6.4.2的反应性进行评估，并且通过小鼠骨髓瘤细胞系NSO (R&D Systems, Minneapolis, MN)来表达。
如图27所示的结果表明AR47A6.4.2特异识别人TROP-2的重组形 式(由AR47A6.4.2作为探针检测的泳道1的印迹)并且不识别人CD63的 细胞外域2的重组GST-融合构建体(GST-EC2)。观测到的可商购的抗-人 TROP-2抗体(克隆77220.1 l)也识别相近大小的条带并且不识别人CD63 的GST-EC2结构域的结果，进一步确定该抗体对重组人TROP-2的特异 性。此外，抗人CD63抗体(克隆1A245.6)特异识别人CD63的GST-EC2 融合构建体但不能识别重组人TROP-2蛋白。以上结果表明AR47A6.4.2 识别人TROP-2且直接结合于人TROP-2，并且特异地与其含有氨基酸 27-274的细胞外域结合。
实施例11
去糖基化研究
为了确定结合AR47A6.4.2的糖基化作用，按照厂商(Enzymatic Deglycosylation Kit (酶性去冲唐基4b试剂盒)，Prozyme， San Leandro， CA)的 说明书在变性条件和非变性条件下进行去糖基化反应。对于变性反应， 用水将0.4昭重组TROP-2 (rhTROP-2; R&D Systems, Minneapolis, MN) 或100吗MDA-MB-231膜蛋白(如上述分离)稀释至30 |il。加入10 pi孵 育緩冲液(5X， 0.25 M NaH2P04, pH 7.0)和2.5 变性溶液(2% SDS， 1 M (3-巯基乙醇)，并将反应物煮沸5分钟。 一旦反应物冷却至室温，力口入2.5|^1 去垢剂溶液(15% NP-40)以及1微升下述每种酶N-聚糖酶⑧N-糖酰胺酶 F5 U/mL)、唾液酸酶ATM (2 5 U/mL)、 O-聚糖酶 (2 1.25 U/mL)、 (3(1-4)半乳糖苷酶(3 U/mL)和]S-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(40 U/mL)。包括了含有5 gl 水而不是去糖基化酶的对照反应。对于非变性反应，用水将0.4 jLtg rhTROP-2或100 /ig MDA-MB-231膜蛋白稀释至35 /d。加入10 /xl孵育 緩沖液，以及1 /il以上所列的每种酶。包括了含有5 /il水而不是去糖基 化酶的对照反应。所有反应在37°C下孵育24小时。
去糖基化后，准备SDS-PAGE的反应。将16.7 gl还原性的或非还原 性的加样緩冲液(4X)分别加入变性的和非变性的反应。将样本煮沸5分 钟，然后冷却至室温。取每种反应的16.7/!l加栽到分为4块相同的12% 的SDS-PAGE凝胶中。在150 V处跑胶直至染料前沿跑出。40 V过夜将 蛋白转移至PVDF膜。所述膜用由TBST(0.05% Tween-20的Tris緩冲生 理盐水)制备的5%奶封闭1小时，然后与一抗孵育2小时。将每种一抗 在5%奶中稀释至5 jUg/mL，抗-人TROP-2除外，其被稀释至2 /xg/mL。 将印迹与AR47A6.4.2、抗-人TROP-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 或IgG同种型对照中的一种粹育。聘育完一抗后，用TBST将印迹洗3 次，每次10分钟。用在5%奶中稀释至1:50,000的山羊抗-鼠IgGFcHRP 二抗孵育印迹1小时，然后用TBST清洗3次，每次10分钟。用ECL Plus 蛋白印迹牙企领'H式剂(GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences; Piscataway， NJ)和X-射线显影剂将印迹显影。
图28-30分别显示了用AR47A6.4.2、抗-人TROP-2和IgG同种型对 照作为探针检测的3个印迹的结果。图28 (用AR47A6.4.2作为探针检测 的印迹)在泳道l(非变性的和非去糖基化的MB-231全部膜部分)的-52 kDa处显示弱条带。该条带在图29 (用抗-人TROP-2作为探针检测的印 迹)中^r测不到。来自泳道2 (非变性且去糖基化的MB-231全部膜部分) 的样本的反应条带显示为迁移至约37 kDa并且被AR47A6.4.2 (图28)和 商品化的抗-TROP-2抗体(图29)印迹所识别，但不被同种型对照(图30) 识别。在任何这些印迹中，未在泳道5或泳道6 (变性的且非去糖基化的 和去糖基化的MB-231全部膜片段)中检测到条带，这表明在还原性条件 下抗体没有与全部膜部分中的靶蛋白可检测地结合。
在图28和29中(分别为AR47A6.4.2和抗-人TROP-2)，重组人 TROP-2在第3泳道和第4泳道(分别为非变性非去糖基化的和去糖基化的rhTROP-2)显示出很强的、很高分子量的条带(表观分子量高于220 kDa),其与二硫键连接的rhTROP-2的多聚体相对应。在图28 (用 AR47A6.4.2作为探针检测的印迹)中，在第3泳道(非变性非去糖基化的 rhTROP-2)的约70 kDa处以及在第4泳道(非变性的且去糖基化的 rhTROP-2)约55 kDa处出现强度较弱的条带，并且其与rhTROP-2的单体 形式相对应。多聚体条带和单体条带的表观分子量分别从高于220 kDa 和高于70 kDa至低于220 kDa和低于55 kDa的迁移(第3泳道和第4泳 道)是由去糖基化造成糖类基团的缺失所形成的。在还原性条件下(第7泳 道和第8泳道)，^义;险测到rhTROP-2较小的单体多肽，在用糖苷酶混合 物处理后表观分子量降低约20 kDa (图29)。图30 (用同种型对照抗体作 为探针检测的印迹)在任何泳道中均未显示出反应性。
在用糖苷酶的混合物处理之前和之后，使用的两种抗-人TROP-2抗 体(AR47A6.4.2和商品化的抗-人TROP-2抗体)识另"出在来自 MDA-MB-231的全部膜制备物中的人TROP-2抗原和纯化的重组人 TROP-2。该结果表明抗体可以识别非糖类抗原决定簇，可能为多肽抗原 决定簇，尽管不可能排除可能发生的与不能由本试验使用的特定糖苷酶 混合物除去的糖类基团的结合。
实施例12
竟争试验
为了进一步表征AR47A6.4.2和AR52A301.5(内部产生的另 一抗体， 其也结合TROP-2)的结合特性，通过蛋白印迹进行抗体竟争试验以确定 AR47A6.4.2和AR52A301.5是否识别更小的或不同的TROP-2抗原决定 簇。使用跨越两种10%聚丙烯酰胺凝胶的每一种的全部长度的制备孔梳， 将2 /xg由鼠骨髓瘤细胞系NS0 (R&D Systems, Minneapolis, MN)表达的包 含人TROP-2的细胞外域和人IgGl的Fc区的重组融合多肽在非还原性 条件下进行SDS-PAGE。在40V、约17小时、4。C的条件下，将凝胶上 的蛋白转移至PVDF膜。在室温下的转台上用溶于TBST中的5%脱脂乳 封闭该膜1小时。用约20mLTBST洗涤该膜两次并将其置于Western多 屏设备中，形成20条分离的通道，在其中应用不同的探针溶液。先前，使用EZ-Link NHS-PEO固相生物素化试剂盒(Pierce， Rockford, IL)已经制 备出生物素化的AR47A6,4:2和AR52A301.5。通过将生物素化的 AR47A6.4.2或生物素化的AR52A301.5与不同浓度的非生物素化的抗体 混合制备一抗溶液。特别地，制备的溶液含有溶于TBST中的3%脱脂乳 中的0.05 ]Ug/mL的生物素化的AR52A301.5,加上0.5 /xg/mL、 5 /ig/mL、 50 jiig/mL、 500 ]Ug/mL或1000 /xg/mL的非生物素化的抗体。使用的所述 非生物素化的抗体为AR52A301.5、 AR47A6.4.2和对照抗体8A3B.6 (抗 蓝舌病病毒；IgG2a， k，内部纯化)。用与上述相同的浓度的非生物素化 的抗体AR52A301.5、 AR47A6.4.2和对照抗体1B7.11 (抗-TNP; IgGl， k， 20 jWg/mL，内部纯化)制备含有0.05 jtig/mL的生物素化的AR47A6.4.2的 溶液。将由TBST中3%脱脂乳组成的阴性对照溶液加入每张膜上的两个 通道。
在摇动平台上，将一抗溶液在膜上的单独通道中于室温下孵育2小 时。在摇动平台上用TBST洗涤各通道3次，每次10分钟。将由溶于TBST 的3%脱脂乳中的0.01 /xg/mL过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素(Jackson Immunoresearch， West Grove PA)组成的第二溶液加到所述膜上的各个通 道，每张膜上的只加溶于TBST中的3%乳作为阴性对照的一个通道除外。 在室温下的摇动平台上，所述膜在第二溶液中孵育1小时。在摇动平台 上用TBST洗涤各通道3次，每次10分钟。将所述膜从多屏设备上移走 并按照厂商的说明与增强的化学发光检测溶液(GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)卵孚育。然后将所述 膜暴露于胶片并显影。
图31和32显示抗体竟争试验的结果。在非生物素化的AR52A301.5 的浓度为50 jtig/mL和更高时(超过1000X;图31第3-7泳道)，生物素化 的AR52A301.5的结合被完全抑制，而在非生物素化的AR47A6.4.2的浓 度为500 jUg/mL和更高时(超过10000X;图32第9-13泳道)，AR47A6.4.2 的结合被完全抑制。在含有IgG2a同种型对照抗体的任何样本中，生物 素化的AR52A301.5的结合均未被抑制(图31第泳道)，并且在含有 IgGl同种型对照抗体的任何样本中，生物素化的AR47A6.4.2的结合均 未^皮抑制(图32第15-19道)。这表明观察到的与相同的非生物素化的抗合位点的占用，而不是单独的过量抗体的非特异性相互作用。在含有
AR47A6.4.2的任何样本中，生物素化的AR52A301.5的结合均未净皮完全
抑制，并且在含有AR52A301.5的任何样本中，生物素化的AR47A6.4.2
的结合均未被完全抑制。然而，在两种蛋白印迹中，在5 Ag/mL、 50 /ig/mL、
500 /ig/mL和1000 /xg/mL的另一种非生物素化的TROP-2抗体存在下，
各生物素化的TROP-2抗体的反应性的强度弱于过量同种型对照抗体的
对应的泳道。这些结果表明AR52A301,5的结合没有阻止AR47A6.4.2与
TROP-2的结合，反之亦然。总之，竟争蛋白印迹的结果表明，由
AR47A6.4.2和AR52A301.5识别的TROP-2分子抗原决定簇互不相同， 虽然一种抗体的结合的确影响另一种的结合。
实施例13
人正常组织染色
分布(先前的试验显示该抗体与福尔马林固定的组织没有反应性)。将载玻 片在冷的(-20。C)丙酮中后固定10分钟，然后使其达到室温。将载玻片在 4°C冷的磷酸緩冲盐(PBS)中清洗3次，每次2分钟，接着通过在3%过氧 化氢中清洗10分钟而封闭内源性过氧化物酶的活性。然后将载玻片在 PBS中清洗3次，每次5分钟，接着在通用封闭液(Dako， Toronto, Ontario) 中于室温下孵育5分钟。将AR47A6.4.2、抗-人肌肉肌动蛋白(Clone HHF35， Dako， Toronto, Ontario),抗-TROP-2克隆77220.11 (R&D System Inc., MN， USA)或同种型对照抗体(针对黑曲霉(vl^^g/〃^ Mge。葡萄糖氧化酶，在 哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako, Toronto, Ontario)在抗体 稀释緩冲液(Dako, Toronto, Ontario)中稀释至其工作浓度(除了抗-肌动蛋 白为0.5 pg/mL以及商品化的抗-TROP-2为1 /xg/mL夕卜，每种抗体均为5 /ig/mL)并在室温下过夜孵育1小时。用PBS洗涤该载玻片3次，每次2 分钟。在室温下用提供的HRP偶联的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)检测/观察一抗的免疫反应性30分钟。该步骤后，用PBS洗涤载 玻片3次，每次5分钟，通过加入DAB(3， 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako, Toronto, Ontario)生色团底物溶液，在室温下进行免疫过氧化物酶 染色10分钟，发生颜色反应。在自来水中冲洗载玻片终止显色反应。与 Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville, ON)复染后，将所述载玻片用 梯度乙醇脱水并用二曱苯透明。使用封固剂(Dako Faramount， Toronto, Ontario)在该载玻片盖上盖玻片。使用Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进行显微检查并用Northern Eclipse成像软件(Mississauga， ON)获取并储存数字影像。由组织病理学家对结果进行读取、评分和解释。 使用人正常组织筛选阵歹l)(Biochain, CA, USA)使抗体与12种人类正 常器官进行结合，所述12种人类正常器官为卵巢、胰腺、甲状腺、脑(大 脑、小脑)、肺、脾、子宫、宫颈、心脏、皮肤和骨骼肌。所述阵列包括 20种正常人类器官；然而，这些器官中仅12种在染色后是可解释的。图 33示出人类正常组织阵列的AR47A6.4.2染色结果的汇总。AR47A6.4.2 抗体表现出主要与上皮组织(血管内皮、曱状腺的滤泡上皮、胰腺的腺泡 上皮细胞及导管上皮细胞、肺的肺泡上皮以及皮肤的表皮角质形成细胞) 结合。该抗体还表现出与脾的淋巴组织的疑似结合以及与脑的神经组织 的结合(图34)。细胞定位是胞浆的和细胞膜的，呈现弥散染色模式。与 商品化的抗-TROP-2 (克隆77220.1 l)相比较时，AR47A6.4.2显示出相似 的结合模式。
实施例14
人多肿瘤组织染色
进行IHC研究以表征AR47A6.4.2抗原在冷冻的人类癌切片中的普遍 性。将载玻片从-80。C转至-20。C。 l小时后，将载玻片在冷的(-20。C)丙酮 中后固定10分钟，然后其达到室温。将载玻片在4。C冷的磷酸緩冲盐(PBS) 中清洗3次，每次2分钟，接着通过在3%过氧化氢中清洗10分钟而封 闭内源性过氧化物酶的活性。然后将载玻片在PBS中清洗3次，5分钟， 接着在通用封闭液(Dako, Toronto, Ontario)中于室温下孵育5分钟。将 AR47A6.4.2 、抗-人肌肉肌动蛋白(Clone HHF3 5, Dako, Toronto, Ontario)、 抗-细胞角蛋白-7克隆OV-TL 12/30 (Dako, Toronto, Ontario)或同种型对照 抗体(针对黑曲霉葡萄糖氧化酶，在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako， Toronto, Ontario)在抗体稀释緩冲液(Dako， Toronto, Ontario) 中稀释至其工作浓度除了抗-肌动蛋白为0.5 jwg/mL以及备用的抗-细胞 角蛋白-7,每种抗体为5jLtg/mL。在室温下将一抗和载玻片一起孵育1小 时。用PBS洗涤载玻片3次，每次2分钟。在室温下用供应的HRP偶if关 的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)^r测/观察一抗的免疫反 应性30分钟。该步骤后，用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，通过加 入DAB (3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako, Toronto, Ontario)生色团底物 溶液，在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟，发生颜色反应。在自 来水中冲洗载玻片终止显色反应。与Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville, ON)复染后，用梯度乙醇(75%至100%)使载玻片脱水并用二曱苯 透明。使用封固剂(Dako Faramount， Toronto, Ontario)在该载玻片盖上盖玻 片。对于胰腺阵歹ll(TriStar, Rockville,MD)，除了以下的改变外遵循相同 的方案。首先在室温下将组织切片风干2小时，然后在用丙酮固定后再 风干30分钟。用乙醇中的3%过氧化氢封闭内源过氧化氢15分钟；该步 骤在一抗孵育后完成。
使用Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进行显微检 查并用Northern Eclipse成像软件(Mississauga， ON)获取并储存数字影像。 由病理学家读取、评分并解析结果。
图35显示了 AR47A6.4.2染色多种人肺瘤及其相应的正常组织切片 的结果汇总(10例结肠肿瘤和1例正常结肠，7例卵巢肿瘤和1例正常卵 巢，11例乳腺肺瘤和3例正常乳腺，14例肺部肿瘤和3例正常的肺，13 例前列腺肿瘤和3例正常前列腺，以及13例胰腺肿瘤和4例正常减J^)。 所述组织被分配在3个不同的组织微阵列上(Tri Star, Rockville， MD)。该 抗体显示出与结肠肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、肺部肿瘤、前列腺肺瘤 和胰腺肿瘤分别为5/10 (50%)、 6/7 (86%)、 10/11 (91%)、 11/14 (79%)、 13/13 (100%)和2/13 (15%)的中度结合至强结合。此外，分别在2/10(20%)、 1/11 (9%)、 3/14 (21%)和2/13 (15%)的结肠肿瘤、乳腺肿瘤、肺部肿瘤和胰腺 肺瘤切片中观察到疑似结合至弱结合(图36)。在所有测试的肿瘤中，所 述结合对肿瘤细胞是特异的。对于相应的正常组织，所述抗体显示出与 0/1、 0/1、 3/3、 3/3、 3/3和4/4的正常结肠组织、卵巢组织、乳^^组织、肺部组织、前列腺组织和胰腺组织结合。然而，该结合主要是与正常器 官的上皮组织的结合。阳性对照抗体抗-细胞角蛋白-7或抗-肌动蛋白分别
显示出与上皮组织和肌肉组织预期的阳性结合。阴性IgG同种型对照显
示出与任何测试的組织没有可检测的结合。
实施例15
多物种组织染色
进行IHC研究以表征AR47 A6.4.2抗原在冷冻的多种物种的正常组织 中的交叉反应性，目的是选择临床前毒理学模型。将SCID小鼠正常组织 的切片(内部收集的)、小鼠正常组织阵列(Biochain，CA，USA)的切片、多 物种脑阵列(Biochain， CA， USA)的切片以及多物种肝阵列(Biochain, CA， USA)的切片从-80。C转至-20。C。 1小时后，将载玻片在冷的(-20。C)丙酮 中后固定10分钟，然后使其达到室温。将载玻片在4。C冷的磷酸緩冲盐 (PBS)中清洗3次，每次2分钟，接着通过在3%过氧化氢中清洗10分钟 而封闭内源性过氧化物酶的活性。然后将载玻片在PBS中清洗3次，5 分钟，接着在通用封闭液(Dako， Toronto, Ontario)中于室温下孵育5分钟。 将AR47A6.4.2、抗-Grp94 (Stressgen， Victoria, BC, Canada)、抗隱人肌肉肌 动蛋白(Clone HHF35, Dako, Toronto, Ontario)或同种型对照抗体(针对黑 曲霉葡萄糖氧化酶，在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako， Toronto, Ontario)在抗体稀释ll沖液(Dako, Toronto, Ontario)中稀释至其工 作浓度(除了抗-肌动蛋白为0.5 ]Ltg/mL外，每种抗体为5 /xg/mL)并在室温 下孵育1小时。用PBS洗涤该载玻片3次，每次2分钟。在室温下用供 应的HRP偶联的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)才全测〃见察 一抗的免疫反应性30分钟。该步骤后，用PBS洗涤载玻片3次，每次5 分钟，通过加入DAB (3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako， Toronto, Ontario) 生色团底物溶液，室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟，发生颜色反 应。在自来水中冲洗载5皮片终止显色反应。与Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)复染后，用梯度乙醇(75%至100%)使载玻片脱 水并用二曱苯透明。使用封固剂(Dako Faramount， Toronto, Ontario)将该载 玻片封片。对于人、食蟹猴、兔、仓鼠和恒河猴的单独的切片(Biochain， CA,USA),除了以下的改变外遵循相同的方案。对于第一步，在室温下将组 织切片风干30分钟，然后用冷的PBS沖洗，无需丙酮固定(该切片是由 厂商用丙酮固定的)。用乙醇中的3%过氧化氢将内源过氧化氢封闭20分 钟；该步骤在一抗孵育后完成。
在室温下用供应的抗-鼠HRP偶联的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)检测/观察一抗的免疫反应性30分钟。使用Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进行显微检查并用Northern Eclipse 成像(Mississauga, ON)获得并储存数字影像。由病理学家读取、评分并 解析结果。
测定所述抗体与一组SCID小鼠正常组织(内部收获的)，大鼠、豚鼠、 山羊、绵羊、小鸡、母牛、马、狗和猪的脑组织(Biochain，CA，USA)，大 鼠、山羊、小鸡和母牛的肝组织(Biochain，CA，USA)，以及人、食蟹猴、 恒河猴、兔、仓鼠和豚鼠的单独的组织切片(Biochain,CA，USA)的结合。 阳性对照抗体抗-肌动蛋白(Clone HHF35, Dako， Toronto, Ontario)显示出 预期的与肌肉组织的特异性结合。阴性对照抗体抗-Grp94 (Stressgen, Victoria, BC)显示出预期的主要与上皮组织的阳性结合。同种型阴性对照 抗体(Dako, Toronto, Ontario)显示出与测试的组织普遍没有可检测的结 合。将阴性对照中显示明显的背景染色的组织切片从解析中排除。
图37示出人类和多种物种正常组织的AR47A6.4.2染色的表格式的 结果。AR47A6.4.2与测试的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、仓鼠、小 鸡、母牛、马或猪的正常组织未显示出可^r测的结合。对于正常兔组织 和狗组织，存在与相应人组织中所观察到的不同的结合。对于食蟹猴正 常组织，AR47A6.4.2在除了卵巢和睾丸的所有测试器官中，均显示出与 在相应人正常组织观察到的相似的组织特异性(图38)，其中，对于食蟹 猴切片，在所述卵巢和睾丸中未观察到可检测的结合。对于恒河猴正常 组织，AR47A6.4.2显示出与相应人正常组织中观察到的相似的组织特异 性(图38)。应注意的是恒河猴正常组织的组小于受测试的食蟹猴的组。 基于该染色特征，食蟹猴和恒河猴均可纟皮考虑为AR47A6.4.2的合适的毒 理学模型。实施例16
AR47A6.4.2鼠科序列
1.0将可变区基因克隆入测序载体
为了便于制备抗体嵌合体，将编码重链和轻链的可变区的基因分别 克隆入商品化的测序载体pGEM-T easy:(Promega Corp. Madison WI)。 1.1 mRNA的分离
使用PolyATract系统1000 mRNA提取试剂盒(Promega Corp., Madison， WI)从汇合的主细胞库(AR47A6.4.2)杂交瘤细胞的培养物中分 离信使核糖核酸(mRNA)。将mRNA储存在-80。C备用。 1.2可变区基因的RT-PCR扩增
分别进行反应以扩增轻链和重链的可变区。逆转录酶聚合酶链反应 (RT-PCR)从mRNA模板中合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)然后特异地扩 增靶基因。
对于k轻链，将5.0 /tl mRNA与1.0 /il的20 pmol/^l MuIgG/cVL-3^1 物OL040和5.5 /zl不含核酸酶的水(Promega Corp,, Madison, WI)混合。对 于X轻链，将5.0 ]Ltl mRNA与1.0 /il的20 pmol/pl MuIgG入Vr3'引物OL042 和5.5 /xl不含核酸酶的水(Promega Corp., Madison, WI)混合。对于？重链， 将5.0 jwl mRNA与1.0的20 pmol/pl MuIgGV『3'引物OL023和5.5 不含核酸酶的水(Promega Corp., Madison, WI)混合。将所有3种反应混合 物置于设定在70。C的热循环仪的预热模块5分钟。然后，将反应混合物 在冰上冷却5分钟，随后在每一种混合物中加入4.0 pi ImPromII 5x反应 缓冲液(Promega Corp., Madison， WI)、 0.5 RNasin核糖核酸酶抑制剂 (Promega Corp., Madison, WI)、 2.0 /il 25 mM MgCl2 (Promega Corp" Madison, WI)、 1.010幽dNTP混合物(Invitrogen, Paisley, UK)以及1.0 jul Improm II逆转录酶(Promega Corp., Madison, WI)。将这些反应混合物 在室温下孵育5分钟，然后转入设定在42。C的预热的PCR才莫块1小时。 此后，通过在PCR模块中于70°C下孵育15分钟将所述逆转录酶热灭活。
然后，使用引物库(参见图39的引物序列；SEQ ID NOS: 10-47)特异 性扩增重链序列和轻链序列。所述引物的工作溶液由下述物制备
1. 5'单引物(MuIgVH5'-A和B; MuIgKVLh5'-A、 B和C; MuIgXVL5'-A),其包含浓度为20 juM的各个引物；
2. 5'引物库(MuIgVH5'-C至F; MuIgKVLh5'-D至G),其包含浓度为5 /^M的各个组成的引物。
扩增重链和轻链的cDNA序列。通过将37.5 /xl 10x高保真扩增PCR 緩沖液(Roche， Mannheim, Germany) 、 7.5 /xl 10 mM dNTP混合物 (Invitrogen, Paisley, UK)和3.75 /xl高寸呆真扩增DNA聚合酶(Roche, Mannheim, Germany)加入到273.75 /xl不含核酸酶的水中而制备PCR主混 合物。在水上将该主混合物以21.5 /xl的等分试样分配至15个薄壁PCR 反应管中。将2.5 MuIgVH-3'逆转录反应混合物和1.0 jid重链5'引物混 合物A至F加入其中的6个反应管。将2.5 MuIgxVL-3'逆转录反应物 和1.0 pl轻链5'引物混合物A至G加入另外7个反应管。将2.5 pd MuIg入Vir3'逆转录反应物和1.0 X轻链引物MuIgXVL5'-A加入最后的反 应管。将反应置于热循环仪模块中并加热至95。C2分钟。聚合酶链反应 (PCR)的反应进行94°C 30秒、55°C 1分钟和72°C 30秒的40个循环。最 后在72。C加热该PCR产物5分钟，然后在4。C储存。使用QIAquick PCR 純化试剂盒(QIAGEN， Crawley, UK)纯化PCR产物。
图40显示RT-PCR反应的结果。重链反应(第2-7道)显示在500 bp 处使用MuIgVH 5'-C (第4道)和MuIgVH 5'-E (第6道)扩增的强条带。轻 链反应(第8-15道)显示出使用引物Mulg/(VL5'-A (第8道)和MuIgKVL5'-G (第14道)正向引物扩增的强的450 bp产物条带。使用QIAquick PCR纯 化试剂盒(QIAGEN， Crawley, UK)纯化来自这些反应的PCR产物。 1.3克隆入测序载体
使用pGEM-T easy载体系统I (Promega Corp., Madison, WI)将轻链A 和G以及重链C和E纯化的PCR产物分别克隆入pGEM-T easy载体。 通过将3.0 /xl纯化的PCR产物加至5.0 jul 2x连4妄緩沖液、1.0 /xl pGEM-T easy载体和1.0 jbd T4 DNA连接酶中而准备轻链和重链的反应。根据厂商 的说明，将质粒转化入亚克隆级的XLl-blue感受态大肠杆菌(Stratgene, LaJolla, CA)。对轻链和重链的转化，使用2.0/zl的连接反应。
将来自各个反应的100 pi转化的细胞铺至含有50 jitg/mL氨卡西林 (Sigma, Poole， UK)的Luria肉汤琼脂(Q-Biogene, Cambridge, UK)4反上。将该板倒置并在37°C孵育过夜。
选择来自4个板中每一个的8个克隆并用于接种20 W无菌水。通过 将513.6 fil无菌水、34.0 /xl 二甲基亚硫酰亚胺(Dimethyl Sulphoximide) (Sigma， Poole， UK) 、 68.0 0x Taq緩冲液(Invitrogen, Paisley, UK) 、 13.6 /il 10 mM dNTP混合物(Invitrogen, Paisley, UK)、 6.8 50 pmol//il引物 OL001 、 6.8 /il 50 pmol/jLd引物OL002和3.4 /d Taq DNA聚合酶(Invitrogen， Paisley, UK)混合而制备PCR主混合物。将该主混合物以19 ^等分试样 分至32个PCR反应管中。在每个反应管中加入1.0 /xl接种的菌落悬浮液。 将PCR反应置于热循环仪的模块中并加热至95°C 5分钟。聚合^^反应 (PCR)的反应进行94。C 1分钟、55°C 1分钟和72°C 1分钟的25个循环。 最后在72。C加热该PCR产物5分钟。然后取各反应中的5 gl在1%琼脂 糖凝胶内电泳。
图41示出来自8个AR47A6.4.2 VH-C菌落和8个AR47A6.4.2 VH-E 菌落的PCR筛选反应。AR47A6.4.2 VH-E菌落8个中的3个，VHE-2 (第 ll道)、VhE-4(第14道)和VhE-7(第17道)显示650bp产物条带阳性， 表明500 bp产物成功克隆入pGEM-T easy载体。余下的5个VHE和全部 8个VH-C反应产生较低分子量的条带，表明500bp插入物的阴性结果。
图42示出来自8个AR47A6.4.2 VL-A菌落禾口 8个AR47A6.4.2 VL-G 菌落的PCR筛选反应。全部8个VLA菌落(第2-9道)和8个VLG菌落中 的3个，VlG-1(第10道)、VlG-3(第12道)和VlG-5(第14道)显示600 bp 产物条带阳性，表明450bp产物成功克隆入pGEM-Teasy载体。余下的 5个VL-G反应产生不同分子量的条带，表明450 bp插入物的阴性结果。
从每种连接中选择多达4个阳性菌落以接种含有50 mg/L氨千西林 (Sigma, Poole， UK)的5 mL 2YT (Sigma, Poole， UK)肉汤。在37°C、搅拌 下过夜孵育培养物。7吏用Qiagen， QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen, Cmwley， UK)从各培养物中提取质粒DNA。 1.4DNA测序
通过Geneservice Ltd. DNA测序设备(Cambridge， UK)对来自9个 AR47A6.4.2 Vl和Vh克隆(VlA-1、 VlA-2、 VlA-5、 VlA-6、 VlG-1、 VL G-3、 VH E-2、 VH E-4和VH E-7)的质粒DNA进行测序。在图43和图44中列出了具有标有下划线的互补决定区(CDR)的序列。图43示出具有 指定为SEQ ID NOS:4-6的标有下划线的CDR的SEQ ID NO:8。图44示 出具有指定为SEQIDNOS: 1-3的标有下划线的CDR的SEQ ID NO:7。 按照Kabat d a/. (1991)完成CDR的确定和氨基酸序列编号。Kabat编号 在图43和44中的氨基酸序列上方列出。
在由5'引物MuIgKV^-A扩增的全部4个克隆中发现正确的 AR47A6.4.2 Vl序列。使用5'引物MuIg/cV匸G扩增的2个Vl克隆包含弄 常免疫球蛋白基因。在由5'引物MuIgVH-E扩增的全部3个克隆中发现正 确的AR47A6.4.2 VH序列。
实施例17
竟争性结合剂的分离
给定抗体，本领域普通技术人员能够制备竟争性抑制的CDMAB, 例如识别相同抗原决定蔟的竟争性抗体(Belanger L " a/. C7/m'ca C/n>m'ca 爿cto48: 15-18 (1973))。 一种方法要求用表达由抗体识别的抗原的免疫原 免疫。样本可包括但不限于组织、分离的蛋白或细胞系。可以用诸如 ELISA、 FACS或Western印迹的竟争分析来筛选产生的杂交瘤，所述竟 争分析能鉴定抑制所测试抗体结合的抗体。另 一方法可以利用噬菌体展 示抗体库，淘选识别所述抗原的至少 一种抗原决定簇的抗体(Rubinstein JL & a/, ^wa/ 5!'oc/iem 314:294-300 (2003))。在任一种情况下，抗体的选择 都是基于它们能够取代原始标记的抗体与其耙抗原的至少一个决定簇的 结合。因此，这样的抗体会具有识别原始抗体识别的抗原的至少一个抗 原决定簇的特征。
实施例18
AR47A6.4.2单克隆抗体的可变区的克隆
已测定了来自由AR47A6.4.2杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链 (VH)和轻链(VO的可变区的序歹i)(实施例16)。为了产生嵌合的和人源化的 IgG，可以将可变的轻链域和可变的重链域亚克隆入合适的表达载体。
在另一实施方案中，通过在转基因动物中表达编码抗体的核酸产生AR47A6.4.2或其去免疫的、嵌合的或人源化的形式，以^f更表达该抗体并 且能够回收该抗体。例如，能够以便于回收和纯化的组织特异性的方式 表达抗体。在这样的实施方案中，在哺乳期用于分泌的乳腺中表达本发 明的抗体。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。 (i)单克隆抗体
使用常规方法(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链 的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码单克隆抗体的DNA (如实施例l所述)，并对其进行测序。杂交瘤细胞是这样的DNA的优选 来源。所述DNA—旦被分离，就可就可以被置于表达栽体内，然后将所 述载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞或骨髓瘤细胞的宿主细胞以在重组的宿主细胞内实现单克隆抗体的 合成，否则这些细胞不产生免疫球蛋白。。还可通过例如将人重链和轻 链的恒定区的编码序列代替同源的鼠科序列来修饰DNA。还可使用合成 蛋白质化学中公知的方法体外制备嵌合的或杂交的抗体，包括涉及交联 剂的方法。例如，使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键可构建免疫 毒素。用于此目的的合适的试剂的实例包括亚氨基疏醇盐和曱基-4-巯基 丁酰亚胺盐(methyl隱4-mercaptobutyrimidate)。 (H)人源化的抗体
人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些 非人类的氨基酸残基经常被称为"输入，，残基，其通常来自"输入"可变区 依照Winter和合作者的方法，可以通过用啮齿类CDRs或CDR序列替代 人抗体的相应序列进行人源化操作(Jones & a/.， Nature 321:522-525 (1986); Riechmann e^/"Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen d a/， Science 239: 1534-1536 (1988);在Clark， Immunol. Today 21 :397-402 (2000)中被综述)。
可以通过亲代序列和多种概念上的人源化产物的分析方法，利用亲 代序列和人源化序列的三維模型来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模 型通常是可得到的并为本领域的技术人员所熟悉。可利用计算机程序示 例和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检验这 些显示能够分析残基在候选的免疫球蛋白序列中可能的作用，即分析影 响所述候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，FR残基可以从共有序列和输入序列中被选择和结合，以实现所需的抗体特性，诸如增
加对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接和最大程度上参与对抗原结
合的影响。
(iii)抗体片段
已开发了多种技术制备抗体片段。这些片段能够通过重组宿主细胞 产生(在Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little et al.， Immunol. Today 21:364-370 (2000)中被综述)。例如，Fab'-SH片段能够从 大肠杆菌中直接回收且化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter et al.， Biotechnology 10: 163-167 (1992))。在另一实施方案中，使用亮氨酸4i链 GCN4以促进F(ab')2分子的装配来形成F(ab')2。根据另一方法，Fv、 Fab 或F(ab') 2片段能够从重组宿主细胞培养物中直接分离。
实施例19
含有本发明所述抗体的组合物
本发明的抗体能够用作预防/治疗癌症的组合物。含有本发明抗体的 预防/治疗癌症的组合物是低毒的，并且能够在它们是液体制剂的形式时 或作为合适制剂的药物组合物经口或经胃肠外(例如，血管内、腹腔、皮 下等)给予人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、犬、猿猴 等)。本发明的抗体可单独给药，或可以作为合适的组合物给药。用于给 药的所述组合物可包含药理学可接受的载体以及本发明的抗体或其盐、 稀释剂或赋形剂。以适于口服或肠胃外给药的药物制剂的形式提供这样 的纟且合物。
用于肠胃外给药的组合物的实例为可注射的制剂、栓剂等。所述可 注射的制剂可包括诸如静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、 静脉滴注、关节内注射等的剂型。可通过公知的方法制备这些可注射的 制剂。例如，可以通过在常规用于注射的无菌水介质或油介质中溶解、 悬浮或乳化本发明的抗体或其盐来制备可注射的制剂。作为用于注射的 水介质，例如，生理盐水， 一种含有葡萄糖和其它辅助剂等的等渗液， 其可与诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子 型表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80、 HCO-50 (氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)的合适的增溶剂结合使用。使用例如芝麻油、豆油等作为油 介质，其可与诸如苯曱酸苄酯、苯曱醇等增溶剂结合使用。这样制备的 注射剂通常装入合适的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可通过将本发明所 述的抗体或其盐与常规的栓剂基质混合而制备。用于口服的组合物包括
固态或液态的制剂，具体地，片剂(包括糖4t剂和薄膜包衣片剂)、丸剂、
颗粒剂、粉剂、胶嚢(包括软胶嚢)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的组 合物通过公知的方法制备并且可以包含常规用于药物制剂领域的载体、 稀释剂或赋形剂。用于片剂的所述载体或赋形剂的实例为乳糖、淀粉、 蔗糖、硬脂酸镁等。
有利地，上述用于口服或胃肠外使用的组合物被制备成药物制剂， 所述药物制剂的单位剂量被调适到适合活性成分的一次剂量。这样的单 位剂量制剂包括，例如，片剂、丸剂、胶嚢、注射剂(安瓿)、栓剂等。含
有前述化合物的量通常为每剂量单位形式5 mg至500 mg;包含的上述抗 体优选为约5mg至约100mg,特别是以注射剂形式，对于其它形式，优 选为10 mg至250 mg。
含有本发明所述抗体的上述预防/治疗试剂或调节剂的剂量可根据给 药对象、目标疾病、状况、给药途径等而变化。例如，当用于治疗/预防 诸如成人乳腺癌时，本发明所述抗体以约0.01 mg/kg体重至约20 mg/kg 体重、优选约0.1 mg/kg体重至约10 mg/kg体重且更优选约0.1 mg/kg体 重至约5 mg/kg体重的剂量、约1次/天至5次/天、优选约1次/天至3次 /天经静脉内给药是有利的。在其它的肠胃外给药和口服给药中，所述药 剂能够以对应于以上给出的剂量的剂量给药。当状况特别严重时，可根 据状况增加剂量。
本发明所述的抗体可以单独给药或以适当的组合物形式给药。用于 给药的组合物可包含药理学上可接受的载体以及前述的抗体或其盐、稀 释剂或赋形剂。以适于口服或肠胃外给药(例如，血管注射、皮下注射等) 的药物制剂形式提供这样的组合物。上述各组合物还可包含其它活性成 分。此外，本发明所述的抗体可与其它药物耳关合使用，例如，烃化剂(例 如，环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如，氨曱蝶呤、5-氟尿嘧 啶等)、抗肿瘤抗体(例如，丝裂霉素、阿霉素等)、源自植物的抗肿瘤剂(例如，长春新碱、长春地辛、紫杉酚等)、顺铂、卡波铂、依托泊苷、依立 替康等。可以将本发明的抗体和上述的药物同时给予患者或在不同的时 间给予患者。
本文所述的治疗方法，特别是用于癌症的治疗方法，还可在给予其
它抗体或化学治疗剂的情况下进行。例如，还可给予针对EGFR的抗体， 例如ERBITUX (西妥昔单抗)，特别是当治疗结肠癌时。已经表明 ERBITUX 用于牛皮癣的治疗是有效的。联合使用的其它抗体包括 Herceptin (曲妥单抗)，特别是当治疗乳腺癌时；AVASTIN ,特别是当 治疗结肠癌时；以及SGN-15，特别是当治疗非小细胞肺癌时。可以将本给药。
使用的化学治疗剂/其它抗体的方案包括任何被认为最适合患者状况 治疗的方案。不同的恶性肿瘤需要使用特定的抗肿瘤抗体和特定的化学 治疗剂，这将基于不同患者而确定。在本发明优选的实施方案中，与抗 体治疗同时或更优选地，在抗体治疗之后进行化学治疗。然而，应强调， 本发明不限于任何特定的给药方法或给药途径。
此优势i正据表明AR47A6.4.2通过与存在于TROP-2中的抗原决定簇 连才妄而介导抗癌效应并延长生命。在实施例9、 10和11中已表明， AR47A6.4.2抗体能够用于免疫沉淀来自诸如MDA-MB-231细胞的表达 细胞的同源抗原。实施例1、 2和13至15中还表明，使用例如但不限 于FACS、细胞ELISA或IHC的技术，AR47A6.4.2抗体能够用于检测 表达TROP-2抗原部分的细胞和/或组织，所述TROP-2抗原部分与所述 抗体特异性结合。
因此，这表明使用FACS、细胞ELISA或IHC分析，免疫沉淀的 AR47A6.4.2抗原能够抑制AR47A6.4.2与所述细胞或组织的结合。此外， 与AR47A6.4.2抗体一样，其它抗-TROP-2抗体能够用于免疫沉淀和分离 其它形式的TROP-2抗原，并且使用相同类型的分析方法，所述抗原也 能够用于抑制那些抗体与表达该抗原的细胞或组织的结合。
本说明书中提到的全部专利和公开出版物均代表了本发明所属领域 的技术人员的水平。其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限 定在本文所描述和显示的特定形式或布局 对本领域的技术人员显而易 见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化，且不应当 认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员很容 易看出使本发明较好地适合实现所描述的目的并获得提及的结果和益 处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生 物相关化合物、方法、流程和技术都是优选实施方案中有代表性的，其 目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到 包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的 范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解
描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而 易见的，均在所附权利要求书的范围内。加拿大国际保藏机构
加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
电话(204)789-6030 传真(204)789-2018
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015
R3E 3R2_
国际IDAC/BP/4表
微生物保藏证明(译文)
(根据布达佩其斤条约第7.1条发布)
所附文件为原始保藏合同与存活声明的副本
1. 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物
保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址 ARIUS Research Inc.. 55 York Street. Suite 1600, Toronto. ON. M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司) 提交日期2005年12月14日
2. 保藏的标识
保藏人对培养物指定的名称和符号
AR47A6.4.2
由该国际保藏机构给予的保藏号
141205-05
以上标识的保藏附有
□科学性描述
□建议的分类指定
3.国际保藏机构IDAC授权代表签！
日期2005年12月14日
微生物保藏证明1/1 文件号084(05)加拿大国际保藏机构
加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015 R3E 3R2_
国际IDAC/BP/9表
微生物保藏存活证明译文
(根据布达佩其斤条约第10.2条发布)
致
姓名s Ferris Lander
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美国佛罗里达)
1. 保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址ARIUS Research Inc.. 55 York Street, Suite 1600, Toronto. ON, M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司)
2. 保藏标识
由国际保藏机构给予的保藏号141205-05
保藏日期(或最近相关日期)2005年12月14日
3. 存活检测
于(最近检测日期)对以上标识的微生物进行存活检测
在以上指出的日期，所述微生物
0存活
□不再存活
进行存活检测的条件(在已请求该信息且检测结果为阴性时填写)
4.国际保藏机构授权代表签字:
闩期2006年1月09 R
电话(204)789-6030 传真(204)789-2018
微生物保藏存活证叨i/i
84
文件'小.084(05)加拿大国际保藏机构
加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015
电话(204)789-6030 传真(204)789-2018
R3E 3R2
P示IDAC/BP/4表
微生物保藏证明(译文)
(根据布达佩斯条约第7.1条发布)
所附文件为原始保藏合同与存活声明的副本
1. 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物
保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址 ARIUS Research Inc., 55 York Street. Suite 1600, Toronto. ON. M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司) 提交日期2005年12月14日
2. 保藏的标识
保藏人对培养物指定的名称和符号
AR52A301.5
由该国际保藏机构给予的保藏号:
141205-03
以上标识的保藏附有
□科学性描述
□建议的分类指定
3.国际保藏机构IDAC授权代表签！
日期2005年12月14日
微生物保藏证明1/1 文件号084(05)加拿大国际保藏机构
加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015 R3E 3R2_
国际IDAC/BP/9表
微生物保藏存活证明译文
(根据布达佩斯条约第10.2条发布)
致
姓名r Ferris Lander
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美国佛罗里达)
1. 保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址ARIUS Research Inc.. 55 York Street, Suite 1600. Toronto. ON. M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司)
2. 保藏标识
由国际保藏机构给予的保藏号141205-03 保藏日期(或最近相关日期)2005年12月14日
3. 存活检测
于(最近检测日期)对以上标识的微生物进行存活检测
在以上指出的日期，所述微生物
0存活
□不再存活
进行存活检测的条件(在己请求该信息且检测结果为阴性时填写)
4.国际保藏机构授权代表签字:
R期2006年1月09闩
电话(204)789-6030 传真(204)789-2018
微生物保藏存活证叨i/i
86
文件',h 084(05)
权利要求
1. 由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体，该杂交瘤保藏于IDAC，保藏号为141205-05。
2. 由以保藏号141205-05保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单
3. 由以保藏号141205-05保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单
4. 分离的杂交瘤细胞系，其以保藏号为141205-05保藏于IDAC。
5. 引发抗体诱导的选自人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卯巢肿瘤、前列腺 肿瘤或结肠肿瘤的组织样本中癌细胞的细胞毒性作用的方法，所述方法 包括提供来自所述人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卵巢肺瘤、前列腺肿瘤或结 肠肿瘤的组织样本；提供由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的 单克隆抗体、由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分 离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号141205-05保藏于IDAC 的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或上述抗体的 CDMAB,该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆 抗体与其靶抗原结合的能力；和将所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或所 述其CDMAB与所述组织样本接触；其中所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或 所述其CDMAB与所述组织样本的结合诱导细力包毒性。
6. 如权利要求1所述的分离的单克隆抗体的CDMAB。
7. 如权利要求2所述的人源化抗体的CDMAB。
8. 如权利要求3所述的嵌合抗体的CDMAB。
9. 如权利要求1、 2、 3、 6、 7或8所述的分离的抗体或其CDMAB 与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标 部分或报告分子部分以及造血细胞的成员偶联。
10. 减小对抗体诱导的哺乳动物中细胞毒性作用敏感的人乳腺肿 瘤、胰腺肿瘤、卵巢胂瘤、前列腺胂瘤或结肠肺瘤的方法，其中所述 人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卯巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肺瘤至少表达 一种特异性结合于由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生 的分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力， 所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肺瘤负荷降低的量的所述单 克隆抗体或所述其CDMAB。
11. 如权利要求IO所述的方法， 胞毒性部分偶联。
12. 如;^又利要求11所述的方法， 同位素。
13. 如权利要求10所述的方法， CDMAB活化补体。其中所述分离的单克隆抗体与细其中所述细胞毒性部分是放射性其中所述分离的单克隆抗体或其
14.如权利要求IO所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
15. 如权利要求IO所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的人源化抗体。
16. 如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的嵌合抗体。
17. 特异性结合于一个或多个抗原决定簇的单克隆抗体，所述抗 原决定簇与由以保藏号141205-05保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的 单克隆抗体结合的抗原决定簇相同。
18. 减小哺乳动物内人乳腺肿瘤、胰腺肺瘤、卵巢肺瘤、前列腺 肿瘤或结肠肺瘤的方法，其中所述人肿瘤至少表达一种抗原决定簇， 所述抗原决定簇与由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生 的分离的单克隆抗体或其CDMAB特异性结合，该CDMAB的特征在 于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所 述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的乳腺肺瘤、胰 腺肿瘤、卵巢肺瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤负荷降低的量的所述单克 隆抗体或所述其CDMAB。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细 胞毒性部分偶联。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性 同位素。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB活化补体。
22. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
23. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05 ^f呆藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的人源化抗体。
24. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的嵌合抗体。
25. 减小哺乳动物内人乳腺肿瘤、胰腺肺瘤、卯巢肺瘤、前列腺 肿瘤或结肠肿瘤的方法，其中所述人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、 前列腺肿瘤或结肠肺瘤至少表达一种抗原决定簇，所述抗原决定簇与 由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗 体或其CDMAB特异性结合，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制 所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所 述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、 前列腺肿瘤或结肠胂瘤负荷降低的量的、与至少 一 种化学治疗剂联用 的所述单克隆抗体或所述其CDMAB。
26. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细 胞毒性部分偶联。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性 同位素。
28. 如^5l利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB活化补体。
29. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
30. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的人源化抗体。
31. 如权利要求25所迷的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的嵌合抗体。
32. 确定癌细胞在选自人肿瘤的组织样本中存在的结合分析，所 述癌细胞被IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产 生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交 瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141205-05保 藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性地结 合，所述分析包括提供来自所述人肿瘤的组织样本；提供至少一种所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌 合抗体或上述抗体的CDMAB,其识别的一种或多种抗原决定簇与 AR47A6.4.2杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体识别的抗原决定簇相 同，该杂交瘤细胞系在IDAC的保藏号为141205-05;将至少一种所述提供的抗体或其CDMAB与所述组织样本接触；和确定所述至少一种提供的抗体或其CDMAB与所述组织样本的结合；由此指示所述癌细胞在所述组织样本中的存在。
33. 用于降低人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卯巢肺瘤、前列腺肺瘤或结肠肿瘤负荷的单克隆抗体的用途，其中所述人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、 卵巢肿瘤、前列腺肺瘤或结肠胂瘤至少表达一种抗原决定簇，所述抗原决定簇与由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离 的单克隆抗体或其CDMAB特异性结合，该CDMAB的特征在于具有 竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述用途 包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的人乳腺肿瘤、胰腺肿 瘤、卯巢肿瘤、前列腺肺瘤或结肠肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗 体或其CDMAB。
34. 如;K利要求33所述的方法， 胞毒性部分偶联。
35. 如权利要求34所述的方法， 同位素。
36. 如权利要求33所述的方法， CDMAB活化补体。其中所述分离的单克隆抗体与细其中所述细胞毒性部分是放射性其中所述分离的单克隆抗体或其
37. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
38. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的人源化抗体。
39. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的嵌合抗体。
40. 用于降低人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卯巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠胂瘤负荷的单克隆抗体的用途，其中所述人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、 卯巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤至少表达一种抗原决定簇，所述抗原决定簇与由以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离 的单克隆抗体或其CDMAB特异性结合，该CDMAB的特征在于具有 竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述用途 包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的人乳腺肺瘤、胰腺肿 瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤负荷降低的量的、与至少一种 化学治疗剂联用的所述单克隆抗体或其CDMAB。
41. 如;f又利要求40所述的方法， 胞毒性部分偶联。
42. 如权利要求41所述的方法， 同位素。
43. 如权利要求40所述的方法， CDMAB活化补体。其中所述分离的单克隆抗体与细其中所述细胞毒性部分是放射性其中所述分离的单克隆抗体或其
44. 如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
45. 如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的人源化抗体。
46. 如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-05保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的嵌合抗体。
47. 有效治疗人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤的组合物，其包含下列组合如权利要求1、 2、 3、 6、 7、 8、 17、 49、 50、 54、 55或56中任 一权利要求所述的抗体或CDMAB;所述抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒性部分、酶、放射性化 合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞的成 员的偶联物；和需要量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对治疗所述人乳腺肺瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、 前列腺肺瘤或结肠肿瘤是有效的。
48. 检测人癌性肺瘤存在的分析试剂盒，其中所述人癌性肺瘤至 少表达一种抗原决定簇，所述抗原决定簇与由以保藏号141205-05保 藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB特异性结 合，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与 其靶抗原结合的能力，所述试剂盒包括由保藏于IDAC、保藏号为 141205-05的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA，以及4全测 所述的单克隆抗体或其CDMAB是否结合于多肽的装置，所述多肽在 特定临界水平的存在对于所述人类癌性肿瘤的所述存在具有诊断价 值。
49. 分离的单克隆抗体或其CDMAB，其特异性结合人TROP-2， 其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与人TROP-2的一个或多个 抗原决定簇反应，所述抗原决定簇与由IDAC保藏号为141205-05的 杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体与之反应的抗原 决定簇相同；所述分离的单克隆抗体或其CDMAB的特征在于具有竟 争性地抑制所述分离的单克隆抗体与其人TROP-2靶抗原结合的能 力。
50. 分离的单克隆抗体与其CDMAB,其与由IDAC保藏号为 141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或多个抗原决定簇；所述单克隆抗体或其CDMAB的特征 在于具有竟争性地抑制所述分离的单克隆抗体与其一个或多个靶抗原 决定簇结合的能力。
51. 减小至少表达人TROP-2抗原的一种抗原决定簇的人乳腺肿 瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤的方法，所述抗原 决定簇被由IDAC保藏号为141205，05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产 生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括给予患有所述人肿瘤的个体至少一种分离的单克隆抗体或其 CDMAB，所述单克隆抗体或其CDMAB与由IDAC保藏号为 141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体结合 相同的 一个或多个抗原决定簇；其中所述一个或多个抗原决定簇的结合导致乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、 卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤负荷的降低。
52. 减小至少表达人TROP-2抗原的一种抗原决定簇的人乳腺肿 瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤的方法，所述抗原 决定簇被由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产 生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括给予患有所述人肿瘤的个体至少一种分离的单克隆抗体或其 CDMAB,所述单克隆抗体或其CDMAB与由IDAC保藏号为 141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体结合 相同的一个或多个抗原决定簇，所述分离的单克隆抗体是由IDAC保 藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的；所述单克隆抗 体或其CDMAB与至少 一种化学治疗剂联用；其中所述给药导致肿瘤负荷的降低。
53. 确定表达TROP-2的细胞的存在的结合分析，所述TROP-2 被由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体特异性地识别或被从所述分离的单克隆抗体产生的抗原结合片段特异性地识别，所述分析包括提供细胞样本；提供由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体或从所述分离的单克隆抗体产生的所述抗原结 合片段；将所述分离的单克隆抗体或抗原结合片段与所述细胞样本接触；和确定所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样本的 结合；由此确定表达TROP-2抗原的细胞的存在，所述TROP-2抗原与 所述分离的单克隆抗体或所述抗原结合片段特异性结合。
54. 单克隆抗体，其与由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞 系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体结合的抗原决定簇相同的人 TROP-2的一个或多个抗原决定簇特异性结合，包括含有SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的互补决定区 氨基酸序列的重链可变区；含有SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的互补决定区氨基酸序列的轻链可变区；或其人TROP-2结合片段。
55. 单克隆抗体，其与由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞 系AR47A6.4.2产生的分离的单克隆抗体结合的抗原决定簇相同的人 TROP-2的一个或多个抗原决定簇特异性结合，包括含有SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的互补决定区 氨基酸序列的重链可变区；和含有SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的互补决定区氨基酸序列的轻链可变区；以及来自人抗体或人 抗体共有框架的重链和轻链的可变域框架区；或其人TROP-2结合片段。
56. 与人TROP-2特异性结合的单克隆抗体或其人TROP-2结合片段，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变区氨基酸序列； 和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列。
57. 通过治疗哺乳动物中人乳腺肺瘤、胰腺肺瘤、卯巢肿瘤、前列腺 肺瘤或结肠肿瘤延长存活并延緩疾病进展的方法，其中所述肿瘤表达与 由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离 的单克隆抗体或从所述分离的单克隆抗体产生的抗原结合片段特异性结 合的抗原，所述方法包括以有效降低所述哺乳动物肺瘤负荷的量给予所 述哺乳动物所述单克隆抗体，由此延緩疾病进展并延长了存活。
58. 通过治疗哺乳动物中人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺 胂瘤或结肠肿瘤延长存活并延緩疾病进展的方法，其中所述肿瘤表达与 由IDAC保藏号为141205-05的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的分离 的单克隆抗体或从所述分离的单克隆抗体产生的TROP-2结合片段特异 性结合的TROP-2，所述方法包括以有效降低所述哺乳动物肿瘤负荷的量 给予所述哺乳动物所述单克隆抗体，由此延緩疾病进展并延长了存活。
59. 有效治疗人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肺瘤、前列腺肿瘤或结肠 肺瘤的组合物，其包含下列组合如权利要求1、 2、 3、 6、 7、 8、 17、 49、 50、 54、 55或56中的 4壬一项所述的抗体或CDMAB;和 需要量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对治疗所述人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肺瘤、 前列腺肿瘤或结肠肿瘤是有效的。
60. 有效治疗人乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或结 肠胂瘤的组合物，其包含下列组合如4又利要求1、 2、 3、 6、 7、 8、 17、 49、 50、 54、 55或56中的 任一项所述的抗体或CDMAB与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合 物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞的成员的偶联物；和需要量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对治疗所述人乳腺胂瘤、胰腺肿瘤、卯巢肺瘤、 前列腺肿瘤或结肠肿瘤是有效的。
全文摘要
本发明涉及使用新型筛选模式制备癌性疾病调节抗体的方法。所述方法利用癌细胞细胞毒性作用作为指标来分离抗癌抗体，使制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助肿瘤分期和诊断，并且可以用于治疗原发性肿瘤和肿瘤转移。所述抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞偶联。
文档编号A61K38/19GK101426904SQ200780014360
公开日2009年5月6日 申请日期2007年2月23日 优先权日2006年2月24日
发明者戴维·S·F·扬, 海伦·P·芬德利, 艾莉森·L·费里, 苏姗·E·哈恩, 路易斯·A·G·唐克鲁兹 申请人:阿里乌斯研究公司