评估出现与抗epcr自身抗体的存在相关的病理的危险度和素因的方法

专利名称：评估出现与抗epcr自身抗体的存在相关的病理的危险度和素因的方法
技术领域：
本发明涉及通过检测和体外定量在样品中检测高水平针对内皮蛋白C/活化蛋白C受体(EPCR)的自身抗体的方法。
背景技术：
自身免疫疾病自身免疫疾病的特征在于有免疫反应的存在，其中某些因素诱导针对宿主组织的免疫反应，并且有攻击这些组织的异常抗体(自身抗体)的产生。这些自身免疫疾病包括诸如抗磷脂综合征(APLS)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身性自身免疫血管炎等等的疾病。
APLS是以与抗磷脂抗体的存在有关的血管血栓形成(静脉、动脉或微血管)和孕期并发症(胎死、早产或多发性自发流产)为特征。这些抗体是异质的，并且识别多种磷脂组合、磷脂结合蛋白或二者。最常检测到的抗磷脂抗体亚型包括所谓的抗凝血狼疮抗体(ACL)、抗心磷脂抗体和抗糖蛋白Iβ2抗体。当前研究了不包括在经典实验室标准中的其它抗磷脂抗体。这类抗体靶向不同于心磷脂的如磷脂酰乙醇胺的磷脂或靶向诸如膜联蛋白V和蛋白S的磷脂结合蛋白。但是，人们却几乎不知抗磷脂抗体的存在与血管血栓形成及流产间相关的机制。
血管疾病根据涉及的血管类型(动脉、静脉或微循环的小内径血管)，血管病存在三种主要类型。对于动脉血管疾病，管壁硬化会降低通过血管腔的血流，因而长期减少由受损血管供血区域的血供给。这种动脉粥样硬化损伤可遭受并发症，导致在动脉内形成血栓，完全堵塞动脉，因而完全阻塞血流。在这种情况下，导致组织梗死。这种现象最常见的实例为当血栓形成影响到冠状动脉时的心肌梗塞，或者，当受影响的血管为脑部动脉时的中风。对于静脉血管疾病，血栓形成使回心血流变得错综复杂。当血栓的静脉壁中的血栓碎片脱落时，碎片将会在血流中迁移，一直到达肺静脉循环回路中才滞留下来-产生急性肺衰竭(称为肺栓塞的情况)。微循环疾病继炎症和/或不同器官中微循环血管的血栓形成而出现，且表现为微循环损伤的器官衰竭。血管疾病在西方国家是发病率和死亡率的重要原因。特别是，来自于InstitutoNacional de Estadistica(INE)(西班牙国家统计研究所)的数据表明，2000年心血管疾病是西班牙的第一死亡原因(约占总死亡率的35.0％)。在最常见的心血管系统疾病中，心脏血管或动脉血栓疾病(主要是急性心肌梗塞)构成第一死亡原因。目前，许多分子危险因素已得到鉴定，它们是一些患者中出现血栓形成的原因。其中一个这样的危险因素为存在所谓的抗磷脂抗体。最初认为这些自身抗体靶向阴离子磷脂；但是，后来表明许多这些自身抗体靶向诸如糖蛋白Iβ2或凝血酶原的蛋白质和磷脂之间形成的复合物。最近，发现其它具有抗凝结功能的蛋白质也有参与，如蛋白C(PC)、蛋白S、血栓调节蛋白或膜联蛋白V-这样就解释了为什么自身抗体的存在倾向于血栓形成。
产科并发症产科并发症基本上包括妊娠第10周后胎死、婴儿早产、妊娠第10周前自发性流产、宫内生长迟缓、子痫和先兆子痫。
EPCR活化的蛋白C(APC)是主要的凝血级联调控蛋白之一。APC的酶原PC被与内皮细胞表面的血栓调节蛋白结合的凝血酶活化。与蛋白S(它的非酶辅因子)组合的APC通过蛋白水解活化的因子V和VIII发挥它的抗凝结作用。在静脉和/或动脉血栓形成的患者体内检测到血栓调节蛋白、PC和蛋白S的基因性缺陷和获得性缺陷。内皮PC/活化PC受体(EPCR)是在内皮细胞膜上表达的，具有特异性和高亲和性结合PC和APC的糖蛋白。为使EPCR具有功能，它必须与稳定其三维结构的磷脂分子结合。PC与EPCR的结合显著增强了内皮细胞表面的凝血酶-血栓调节蛋白复合体对它的活化。EPCR的任务是将PC聚集到内皮表面，并将其呈递给凝血酶-血栓调节蛋白复合体-从而利于PC的有效活化。在体内，EPCR诱导了内皮细胞表面PC活化指标近乎9倍的增加-结果造成90％循环水平的APC。此外，只有当APC结合到EPCR上时，它才可活化蛋白酶活化的受体-1，这产生“保护细胞”的细胞信号，并阻止调亡。
EPCR主要由静脉和动脉内皮表达，尤其是由那些大和中内径的静脉和动脉内皮表达。另外，合胞体滋养层也大量表达EPCR。在这些地方，EPCR阻止血栓形成和促进内皮和合胞体滋养层良好的细胞功能。愈来愈多的有力证据表明EPCR参与妊娠维持，因为，在基因敲除小鼠中，EPCR基因缺失引起这些小鼠的胎盘血栓和早期胚胎死亡。
发明概述本发明涉及在来自个体的样品中测定抗EPCR自身抗体(IgG，IgA和IgM)的方法。另一方面，已证实这些自身抗体存在于经诊断为自身免疫疾病(APLS和播散性红斑狼疮)的患者、存在于血管疾病(静脉和动脉血栓形成)的患者和产科并发症女性患者体内。除了其它方面之外，伴随本说明书的实施例还阐明了以下事实在自身免疫疾病的患者(在APLS或播散性红斑狼疮患者中确定)中，在患有诸如动脉血栓形成，如心肌梗塞(在APLS和非APLS患者中确定)的血管疾病、或局部缺血性中风(在APLS患者中确定)或静脉血栓形成(在APLS患者中确定)的患者中，以及患有诸如胎死(在患有APLS和未患有APLS的女性中确定)或多次流产(在APLS患者中确定)的产科并发症的患者中，在血清或血浆中抗EPCR自身抗体的水平会增加。
本发明的创作者发现，自身免疫疾病患者、和/或血管疾病患者和/或产科并发症患者的血清或血浆中抗EPCR自身抗体的水平，与不受这些疾病的影响的健康个体的样品相比有增加。这些证据使得所述抗EPCR自身抗体成为有用的标记物，用于在体外评估个体出现与存在增加水平的针对EPCR的自身抗体相关疾病的危险度和素因，这些疾病例如为自身免疫疾病、血管疾病或产科并发症。
对APLS患者体内抗EPCR自身抗体的存在及其与胎死的关系作了研究。也评估了这些自身抗体对内皮表面APC生成的影响。然后，在配对病例-对照研究中研究了抗EPCR自身抗体与胎死的关联性。得到的结果支持了抗EPCR自身抗体构成胎死了的危险因素这一观点。阻止PC在表达EPCR的细胞表面的活化可能是这些自身抗体发挥它们的病理作用的一种机制。
附图简述

图1显示rhsEPCR在Pichia pastoris中的表达。rhsEPCR从稳定转化的P.pastoris细胞上清中纯化出，如材料与方法部分所述(见实施例)。将含有rhsEPCR的3组分每种10μl进行SDS-PAGE分离，使用GELCODE Blue检测蛋白(A)或采用单克隆的抗myc抗体(Invitrogen)进行Western印迹检测蛋白(B)。
图2比较在诊断为APLS的患者及对照者体内的抗EPCR自身抗体水平。显示了抗EPCR自身抗体的水平。IgM同种型抗体对照(中值＝45AU，任意单位)，患者(中值＝57AU)；IgA同种型抗体对照(中值＝31AU)，患者(中值＝39AU)；和IgG同种型抗体对照(中值＝72AU)，患者(中值＝75AU)。
图3显示抗EPCR自身抗体对内皮细胞生成APC的影响，其中在患者C中可观察到在同种型M抗EPCR自身抗体存在时的APC的生成，并与抗体不存在时和非抑制性抗体存在时APC的生成比较。每种情况都进行了2-4次独立的实验。
发明详述定义为方便理解本发明申请，下面对本发明上下文中使用的一些术语和表述的含义进行解释。
术语“个体”指哺乳动物物种的成员，并且包括但不限于家养宠物、灵长类和人类；个体优选是任何年龄或种族的人(男性或女性)。
表述“自身免疫疾病”指那些免疫系统针对宿主组织进行反应、产生广泛机体紊乱的病症。出于说明目的，这样的疾病包括(除其它状况外)APLS、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫血管炎，等等。
表述“血管疾病”指那些影响血管的病症。当涉及动脉时，由该血管所供血的附属区域就缺乏灌注；这种情况通常继发于归属于管壁的动脉粥样硬化损伤或血栓形成或二者同时存在的动脉阻塞。而静脉受累由来源于受影响的外周区域的回心血液的复杂化定义，并且通常是静脉血栓形成导致血管阻塞的结果。当影响到微循环时，它是以器官损伤为特征，该器官的微循环在行使其功能方面受到影响。作为实例，这样的疾病包括(除其它病症外)诸如心肌梗塞、中风、暂时性脑血管意外、四肢局部缺血、动脉粥样硬化、动脉瘤等动脉血管障碍，以及诸如浅表静脉和深层静脉血栓形成、肺栓塞等的静脉血管疾病和在感染期或自身免疫疾病情况下观察到的器官衰竭形式的微循环病理(血栓形成)。
表述“产科并发症”是指那些影响妊娠进行的病症，如涉及妊娠母体及胚胎或胎儿。其实例包括流产、胎死、早产、宫内生长迟缓、子痫和先兆子痫。
术语“自身抗体”是指由个体产生并靶向(或特异于)宿主结构和自产生机体的组织的抗体，如抗血小板自身抗体、抗甲状腺自身抗体、针对红血球的自身抗体，等等。在此意义上，术语“抗EPCR自身抗体”是指由个体产生并且特异性靶向他或她自身组织的EPCR的免疫球蛋白或抗体。
本发明中所用的术语“抗原表位”，是指蛋白的抗原决定簇，例如能被所述抗体所识别的其氨基酸序列。
术语“肽”和“多肽”是指代表蛋白质片段的氨基酸分子链。术语“蛋白质”和“多肽”用起来无明显区别。
本发明是基于以下观察结果自身免疫疾病患者，和/或血管疾病患者，和/或产科并发症患者与来源于无此类疾病的健康个体的样品相比，抗EPCR自身抗体的产生增加了。此证据将抗EPCR自身抗体可作为有用的标记物，用于在体外评估给定的个体出现与针对EPCR的自身抗体的高水平存在相关的病理的危险度和易感性。
此说明书中用到的表述“高水平抗EPCR自身抗体”是指AU(任意单位)水平等于或超过正态总体的百分位50，例如包括AU水平等于或超过正态总体的百分位60、等于或超过正态总体的百分位70、等于或超过正态总体的百分位80、等于或超过正态总体的百分位90、等于或超过正态总体的百分位95。由于个体间差异(如种族相关方面等)，很难(如果不是完全不可能)建立适用于所有个体的指示高水平抗EPCR自身抗体的绝对值。通过涉及测试一组正常个体(即，在测试时未诊断出自身免疫疾病，或未有血管疾病或产科并发症病史的人)的抗EPCR自身抗体水平的常规程序，很容易就可计算得出这样的百分位。
抗EPCR自身抗体的测定可以采用任何常规方法完成，如“材料与方法”中描述的ELISA(实施例1)。逻辑上，每个个体都会呈现出一定的抗EPCR自身抗体水平(AU)，并且会确定这样的具体的抗EPCR自身抗体水平，在此水平以上发现被分析总体的50％。这个值为百分位50。显然，这样的值(AU)也存在，即在其之上可发现40％的正常被检个体-该值对应于百分位60。依次地，也可以定义其它值，在它们之上可发现30％、20％、20％、10％和5％的正常被检个体-分别对应于百分位70、80、90、95。
本发明提供了在样品中检测存在高水平的针对内皮蛋白C/活化蛋白C受体(EPCR)的自身抗体的方法，特征在于包括在体外定量来自个体的所述样品中的针对EPCR的自身抗体。这些高水平的自身抗体与选自自身免疫疾病(如，APLS、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫血管炎等)、血管疾病(如，动脉血管疾病，如心肌梗塞、中风、暂时性脑血管意外、四肢局部缺血、动脉粥样硬化、动脉瘤、血栓形成等；或静脉血管疾病，如浅表或深层静脉血栓形成、肺栓塞；或微循环血管疾病)和产科并发症(如，流产、胎死、早产、宫内生长迟缓、子痫、先兆子痫等)的病理相关。因而，本发明的主题方法适用于在给定时间间隔检测抗EPCR自身抗体水平的变化。本发明的检测目的可通过它们与抗EPCR自身抗体的正常水平比较来完成。
所述方法包括从个体采集样品的步骤，如血清或血浆样品，它们可用诸如血液采集的任何常规方法获得。
样品可从先前诊断为或未诊断为患有自身免疫疾病或血管病症或产科并发症的个体中取得。样品也可从正在进行治疗的个体或以前治疗过此类疾病或并发症的个体中获得。
考虑到本发明方法的性质，对这些抗EPCR自身抗体的检测和定量通过与标记物连接的免疫测试方法进行，此标记物使得能检测和定量特异性抗原-抗体复合物的形成，该测试方法例如免疫层析法检测(乳胶、胶体金等)、以荧光、同位素、重金属、酶、发光标记物、化学发光标记物和生色团标记物为标记物的免疫检测，等等。
广泛的众所周知的测试法都可使用于本发明，包括使用未标记抗体(第一抗体)和标记抗体(第二抗体)。这些技术包括Western-印迹或Western转移、ELISA(酶联免疫吸附分析)、RIA(放射性免疫分析)等。
在具体实施方案中，本发明方法中能够检测和/或定量这些抗EPCR自身抗体的优选免疫检测是ELISA测试，其包括a)将包括EPCR氨基酸序列或其片段的多肽固定于固体载体，所述片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位；b)将所述被固定的多肽和来自于所述个体的怀疑含有抗EPCR自身抗体的样品孵育足够的时间，以使抗体结合到被固定的多肽，并形成多肽-抗EPCR自身抗体复合物；c)除去多余的未与被固定的多肽结合的样品；d)将所述多肽-抗EPCR自身抗体复合物与酶连接的第二抗体孵育，其中所述第二抗体能与所述抗EPCR自身抗体结合。
该包含EPCR氨基酸序列或其含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位的片段的多肽可为包括全长EPCR的氨基酸序列的多肽，或包括EPCR片段的氨基酸序列并且含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位的多肽。在具体实施例中，所提及的多肽是融合蛋白，它包括i)区域A，其由含有EPCR氨基酸序列或其片段的多肽组成，所述片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位；以及ii)区域B，其由含有用于分离或纯化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于将所提及的融合蛋白锚定到固体载体的氨基酸序列的多肽组成。
此区域B可与区域A的氨基末端或区域A的羧基末端结合。
在具体实施方案中，区域A包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
区域B包括用于分离或纯化先前定义的融合蛋白的氨基酸序列，和/或用于将提及的融合蛋白固定于固体载体的氨基酸序列。实际上能用于分离或纯化融合蛋白的任何氨基酸序列(一般指“标签”肽)，和/或能用于将融合蛋白固定于固体载体的任何氨基酸序列都可出现在区域B中。有时，用于分离或纯化融合蛋白的氨基酸也可用作用于将所提及的融合蛋白固定到固体载体的氨基酸序列，反之亦然。在具体实施方案中，区域B包括用于分离或纯化融合蛋白的氨基酸序列和用于将融合蛋白固定到固体载体的氨基酸序列。
作为例子，这种用在分离或纯化融合蛋白中的氨基酸序列和/或用在将融合蛋白固定到固体载体的氨基酸序列可为Arg-标签、His-标签、FLAG-标签、Strep-标签、能被抗体识别的抗原表位，该抗原表位例如为c-myc-标签、SBP-标签、S-标签、钙调节蛋白结合肽、纤维素结合域、甲壳质结合域、谷胱甘肽S-转移酶-标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-标签等。(Terpe K.，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2003)，60523-525)，如Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO4)(2、4和8拷贝)、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO5)、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO6)(6次重复)、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白(YTDIEMNRLGK)等的氨基酸序列。
在具体实施方案中，所述区域B由包括能被抗体识别的抗原表位的多肽(如c-myc抗原表位，被抗c-myc抗体所识别)和组氨酸尾(His-标签)所组成。
在伴随本说明书的的实施例中，公开了名为rhsEPCR的多肽的产生，该多肽由包含人EPCR(hsEPCR)可溶性部分的氨基酸序列、对应于c-myc抗原表位的氨基酸序列和组氨酸尾的融合蛋白组成-氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。
本发明方法中所用的多肽可由常规方法获得，如通过适宜的表达系统表达。
用在前述ELISA实验中的第二抗体是免疫球蛋白同种特异性抗体，它来源于不同于本研究个体的种属，因而能够表征抗EPCR自身抗体的同种型。举例而言，特异于给定免疫球蛋白同种型的该第二抗体选自抗人IgG抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体，及它们的混合物。在具体实施方案中，第二抗体与使得能检测复合物的诸如酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶等)的标记物结合。
另一方面，本发明提供了评估个体出现与所述个体内抗EPCR自身抗体的高水平存在相关的病理的危险度和易感性的方法，包括在体外定量来自所述个体的样品中针对EPCR的自身抗体。
在具体实施方案中，与针对EPCR的自身抗体的高水平存在相关的病理选自自身免疫疾病，例如APLS、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫血管炎等；血管疾病，例如动脉血管疾病，如心肌梗塞、中风、暂时性脑血管意外、四肢局部缺血、动脉粥样硬化、动脉瘤、血栓形成等，或静脉血管病，如浅表或深层静脉血栓形成、肺栓塞，或微循环血管病，如微循环血栓形成、在感染或自体免疫疾病期间发生的器官衰竭等；以及产科并发症，如流产、胎死、早产、宫内生长迟缓、子痫、先兆子痫等。
本发明所提供的方法是基于以下事实诊断患有自身免疫疾病或患有血管疾病或患有产科并发症的个体与无此类疾病或产科并发症临床史的个体内的相应水平相比，前者具有水平高抗EPCR自身抗体。
本发明所提供的用于评估(评定)个体出现与自身抗体的高水平存在相关的疾病的危险度和易感性的方法是通过将本研究个体样品中的自身抗体水平与正常水平(定义为那些在正常个体群体中发现的水平，如上述表述“高水平”的定义中所提及的)比较而完成。所述方法是基于此部分先前所描述的免疫分析。
另一方面，本发明涉及在体外监测对表现出与抗EPCR自身抗体的高水平存在相关的病理的个体的治疗效果，该方法包括在体外定量所提及个体样品中的抗EPCR自身抗体。该方法以如上所述的方式进行，尽管此时样品源自以前诊断有某些自身免疫疾病或血管疾病，或表现出某些产科并发症，接受治疗的个体。此方法可以评估应用于正在接受治疗的个体的治疗效果，即指，治疗的有效性和作用，目的(例如)在于维持治疗或修正治疗。
另一方面，本发明涉及抗EPCR自身抗体在评估来自个体的样品中存在高水平针对EPCR的自身抗体的方法中的用途。在具体的实施方案中，所述抗EPCR自身抗体的高水平存在与选自自身免疫疾病、血管疾病和产科并发症的病理学相关。个体中增加水平的抗EPCR自身抗体和出现与抗EPCR自身抗体的高水平存在相关的病理的增加的危险度或易感性相关，该病理例如为自身免疫疾病、血管疾病和/或产科并发症。
另一方面，本发明涉及一种多肽在评估样品中存在针对内皮受体EPCR的自身抗体的方法中的用途，其中该多肽包括EPCR氨基酸序列或其含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位的片段。所述方法包括监测和在体外定量所述样品中的抗EPCR自身抗体。在具体实施方案中，这种与抗EPCR自身抗体的高水平存在有关的病理选自自身免疫疾病、血管疾病和产科并发症。
在具体实施方案中，所提及包括EPCR氨基酸序列或其片段(该片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位)的多肽如先前在描述用以监测和/或定量抗EPCR自身抗体的ELISA试验中所定义的多肽。在具体实施方案中，此多肽是所谓的rhsEPCR(见实施例)，它由包含人EPCR(hsEPCR)可溶性部分的氨基酸序列、对应于c-myc抗原表位的氨基酸序列和组氨酸尾的融合蛋白所组成-氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。
另一方面，本发明涉及用于在体外评估高水平抗EPCR自身抗体的试剂盒，其包括具有EPCR氨基酸序列或其片段(该片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位)的多肽。在具体的实施方案中，该包括EPCR氨基酸序列或其片段(该片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位)的多肽如先前在描述用以监测和/或定量抗EPCR自身抗体的ELISA试验中所定义的多肽。在具体的实施方案中，此多肽是所谓的rhsEPCR(见实施例)，它由包含人EPCR(hsEPCR)可溶性部分的氨基酸序列、对应于c-myc抗原表位的氨基酸序列和组氨酸尾的融合蛋白所组成-氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。
在另一方面，所述试剂盒被用于在体外评估个体出现与抗EPCR自身抗体的高水平存在相关的病理的危险度和易感性，所述病理选自自身免疫疾病、血管疾病和产科并发症。
以下实施例解释本发明。
实施例1应用抗EPCR自身抗体作为个体出现与自身抗体的高水平存在相关的病理的危险度和易感性的标记物I.材料和方法患者1.APLS患者及对照本研究包括了共43名患者[年龄44±11岁(平均年龄±标准偏差(SD))，39名女性和4名男性]，依据1998年2月至2002年3月间国际诊断标准[Wilson WA，Gharavi AE，Koike T，Lockshin MD，BranchDW，Piette JC，Brey R，Derksen R，Harris EN，Hughes GR，Triplett DA，Khamashta MA.International consensus statement on preliminaryclassification criteria for definite antiphospholipid syndromereport of aninternational workshop(对用于定义抗磷脂综合征的初步分类标准的国际统一陈述国际研讨会报道).Arthritis Rheum.1999；421309-11；Brandt JT，Barna LK，Triplett DA.Laboratory identification of lupusanticoagulantsresults of the Second International Workshop forIdentification of Lupus Anticoagulants.On behalf of the Subcommittee onLupus Anticoagulants/Antiphospholipid Antibodies of the ISTH(狼疮抗凝剂的实验室鉴别第二次国际狼疮抗凝剂鉴别研讨会结果。代表ISTH的狼疮抗凝剂/抗磷脂抗体小组委员会).Thromb Haemost.1995；741597-603]他(她)们诊断为患有抗磷脂综合征(APLS)。所有的患者特征在于存在抗凝血狼疮抗体(ACL)以及静脉血栓形成(n＝17)、动脉血栓形成(n＝13，其中4人涉及急性心肌梗塞(AMI)，7人存在脑血管血栓疾病(CVTD)，2人在其它区域表现出疾病)或二者[n＝13，都存在深部静脉血栓形成和CVTD(n＝8)、AMI(n＝1)、CVTD和AMI(n＝3)或肠系膜区的动脉血栓形成(n＝1)]的个人史。其中27名患者诊断患有系统性红斑狼疮(SLE)。在ACL阳性期和至少在最后一次血栓事件的3个月后收集血清样品。直到抗EPCR自身抗体检测进行前，样品一直储存于-80℃。
对照组由43名无血栓形成或ACL病史的健康志愿者组成。所有的患者和对照都作出参加此研究的知情同意。
2.具胎死的女性及对照对胎死进行了配对病例-对照研究。由于在无月经的第10周内且发生于她们的末次妊娠的首次胎死事件，共87名年龄在19至31岁之间(平均年龄27岁)的女性被纳入1996年9月至2002年9月的研究中。该研究排除了具有血栓先例、慢性传染病或某种已知的系统性疾病、糖尿病史或具有其它类型的妊娠病理(自发性流产、子痫、限制性子宫内胎儿发育)先例的女性，以及排除了由于染色体异常影响到染色体组型的，或由于胎儿形态畸形的胎死病例。有58名女性在首次妊娠中发生胎死，21名女性在第二次妊娠中发生胎死，剩余8名女性在第三次妊娠中发生胎死；在75名女性中胎死发生在10周和22周之间，而剩余12名女性中胎死发生在22周至36周之间(平均值17周)。
建立了有87名健康母亲的对照组，按年龄、妊娠次数和末次妊娠经历的时间分组；她们都符合应用于具胎死的女性组的排除标准。为了系统的医学检验，从同一家医院的妇科的门诊病人中同期吸收对照者。
本研究经过了发明者协会伦理委员会的批准和取得所有个体的知情同意。患者和对照者的知情同意和血样的采集发生在胎死后至少6个月(范围6-12个月)。依据常规程序采集、处理血样并储存于-80℃。取样方法在所有的病例及对照中是一致的。
重组人可溶性EPCR的表达为了以可溶性形式表达人重组EPCR(rhsEPCR)，以来源于内皮细胞的cDNA作模板，采用在5’和3’末端分别增加了ClaI限制性酶切位点和另一NotI位点的引物对SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了人可溶性EPCR(hsEPCR)序列，包括无信号肽的胞外结构域或跨膜和胞内结构域(Entrez-Protein 21730830，1-193残基，编号对应于信号肽处理后的蛋白质的成熟形式)。这些修饰使rhsEPCR序列可连接到质粒pPICZαC(Stratagene，La Jolla，CA)的Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)因子α的分泌信号下游的ClaI和NotI位点，该分泌信号使许多蛋白从酵母细胞内部有效分泌进入到胞外培养基。
插入物被克隆至载体pPICZαC的阅读相中，此阅读相具有c-myc抗原表位和6-组氨酸标签。由于在克隆过程中rhsEPCR氨基端添加了丝氨酸残基和异亮氨酸残基，该rhsEPCR氨基端表达为融合到其羧基末端，形成含有c-myc抗原表位和6-组氨酸的尾巴或标签，以利于纯化和经抗c-myc单克隆抗体将rhsEPCR锚定到微板孔的底部。通过直接测序，证实插入物和载体序列是正确的。SEQ ID NO3显示由此获得的从DNA序列推断的rhsEPCR序列，它包括由所用的克隆技术添加的残基、人rhsEPCR胞外区域残基、c-myc抗原表位和6-组氨酸标签。
采用先前制备的表达载体并利用限制性酶PmeI将后者线性化后，通过化学方法(Easy Comp，Invitrogen)转化Pichia pastoris细胞，经由同源重组产生rhsEPCR编码序列整合进甲醇反应性内源启动子中。转化产物在zeocine存在下培养，以筛选用含有rhsEPCR编码序列的载体转化的P.pastoris菌落，而该载体含有编码zeocine抗性的基因。简而言之，转化的酵母培养在补加了1％(v/v)甘油的4ml BMY培养基[1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、100mM(pH6.0)磷酸钾、1.34％(w/v)具有硫酸铵的酵母氮源、4×10-5％(w/v)的生物素](BMGY)中，28-30℃搅拌孵育约18小时。室温下2000g离心5min收集细胞。弃上清，用1％甲醇诱导rhsEPCR的表达18h。具体地，细胞重悬于3ml补加了0.5％(w/v)甲醇的BMY中，接着是剧烈搅拌下约28-30℃孵育18h。诱导之后，将取自条件培养基的样品加载至12％NuPAGEBis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，使用抗myc单克隆抗体通过Western印迹(Invitrogen)检测rhsEPCR。对于大规模生产，筛选最高浓度分泌rhsEPCR的菌落。基于菌落的rhsEPCR的高产量所筛选的菌落，进行了菌落甲醇代谢(代谢快或代谢慢)的研究，这样可以判定适于大多数可用菌落的最佳表达条件。优化培养条件和甲醇诱导之后，对于产生大量的rhsEPCR来说，增加了规模。
重组sEPCR的纯化由于P.pastoris几乎不分泌蛋白质到培养基中，在培养基中发现有高比例对应于rhsEPCR的蛋白质-实际上大大简化了其纯化。简而言之，通过3步纯化的方法从酵母培养物上清中纯化rhsEPCR，该方法包括金属亲和层析、阴离子交换和胶过滤层析。具体地，浓缩培养物上清，并对100mM磷酸钠，10mM NaCl，pH7.6的溶液透析，然后是载有铜的5-ml Hitrap柱(Amersham Biosciences，Little Chalfont，英国)中的金属亲和层析。与柱结合的部分用含乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液洗脱，然后对不含NaCl的Tris-HCl 20mM(pH7.6)透析。再在Resource Q柱(Amersham Biosciences)中进行阴离子交换层析，使用20倍柱体积0.0-300mM梯度的NaCl洗脱。收集被洗脱下来的包含rhsEPCR的部分并且采用离心超滤法浓缩，然后将样品加载到Superdex 75-HR10/30柱(Amersham Biosciences)进行凝胶过滤。使用BCA总蛋白试验(Pierre，Rockford，IL)及标准牛血清白蛋白(BSA)检测纯化蛋白的浓度。为了检测纯化的rhsEPCR，将样品加载到12％NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在还原条件下电泳，然后进行考马斯蓝染色。将一份胶用于电印迹，使用抗myc单克隆抗体(Invitrogen)检测rhsEPCR。在每次电泳胶中使用分子量标准物用以估算rhsEPCR的分子量。
检测血清或血浆中抗EPCR自身抗体的ELISA分别测定对应于同种型IgG、IgA或IgM的抗EPCR自身抗体的水平，因为这些是自身免疫改变患者中最常见的形式，在这些患者中检测到靶向一些宿主结构的抗体(自身抗体)。
在所有三种情况下，96孔微孔板(Costar，Acton，MA，USA)都用pH9.6的Na2CO3溶液(100mmol/l)中浓度为1.5μg/ml的抗c-myc单克隆抗体(Invitrogen，USA)100μl/孔包被，4℃过夜。这种抗体作为俘获抗体，靶向添加在rhsEPCR中的c-myc标签。这样，rhsEPCR就被锚定于孔中，且保留了胞外抗原表位。TB(Tris 20mM，NaCl 150mM，0.05％ of Tween-20，pH7.4)洗涤后，在室温(RT)下4.5h内用TB中3％(w/v)BSA封闭非特异性结合位点。随后，将在补加了1％BSA的TB(TB1)中含有3μg/ml rhsEPCR的溶液以100μl/孔加入，接着在轻微摇晃下室温孵育2h。平行地，空白孔用不合rhsEPCR的TB1孵育。用TB洗涤后，每孔加入100μl 1∶100(血浆或血清)稀释于TB1中的样品，然后4℃孵育过夜。再用TB洗涤孔，采用连接了过氧化物酶的鼠抗人IgA多克隆抗体(Biotrend)、连接了过氧化物酶的鼠抗人IgM多克隆抗体(Zymed)或连接了碱性磷酸酶的鼠抗人IgG多克隆抗体(Zymed)检测保留下来的吸附于孔底的抗EPCR自身抗体。在轻微摇晃下室温孵育2h后，洗涤。
为检测IgA或IgM同种型的抗EPCR自身抗体水平，加入100μl的邻苯二胺溶液(Kodak)(0.4mg/ml)，此溶液含有Na2HPO40.07M，柠檬酸钠0.04M和0.02％(v/v)的H2O2，pH5.0。对于IgA和IgM分别在背光处反应5分钟和8分钟，然后加入100μl H2SO4终止反应，5分钟后在微孔板读数器(iEMS REader，Labsystems，Finland)在492nm处读出结果。
在用于检测IgG同种型的抗EPCR自身抗体的板上，加入100μl0.1M二乙醇胺中的4-硝基苯基磷酸酶(Sigma)(1ng/ml)溶液，pH10.3。15分钟后，加入100μl 1M NaOH终止反应，待颜色稳定后在微孔板读数器(iEMS REader)中在405nm处记录吸收值。所有样品在不同实验中至少测试2次。
为确保每个板上所有测量的吸收值都对应于线性范围，对每种同种型都采用连续稀释记录到最高吸收值的样品来构建曲线。为允许板间比较，在每个板中选择进行检测的样品(标准样品)-这样可以引入校正系数。任意单位(AU)定义如下通过减去空白孔的吸收值，再乘以1000，并乘以对应于标准样品在给定板(参照板)和研究样品测试板中检测的比吸光度之间的比例的校正系数，对每个患者样品(研究样品)计算比吸光度。对于评估板间与板内变异系数(CV)，采用5个样品测试5次用于板间变异系数(不超过5％)，采用3个不同时间用于板间变异系数(不超过10％)。
培养的内皮细胞中APC的生成采用EA.hy926细胞系，此细胞系是保留血栓调节蛋白和EPCR表达能力的转化的人内皮细胞(Stearns-Kurosawa DJ，Kurosawa S，Mollica JS，Ferrell GL，Esmon CT.The endothelial cell protein C receptoraugments protein C activation by the thrombin-thrombomodulincomplex(内皮细胞蛋白C受体通过凝血酶-血栓调节蛋白复合物增强蛋白C的活性).Proc Natl Acad Sci USA.1996；9310212-6)。在96孔板上孵育此细胞，5x104细胞/孔，其中含有0.02U/ml凝血酶(0.17nM)(ERL，Swansea，United Kingdom)和在pH7.4的20mM Tris缓冲液中浓度在50-1000nM不断增加的PC(Baxter，Deerfield，IL，USA)，该缓冲液中补加了NaCl 150mM、CaCl25mM、MgCl20.6mM、1％BSA、0.001％ Tween-20和0.02％ NaN3。室温下45分钟后，添加来匹卢定至终浓度为0.2μmol/L，以抑制凝血酶；3-4分钟后，加入生色底物S-2366(Chromogenix，Milan，Italy)至终浓度为0.4mM，用以监测其酶被APC蛋白水解。用微孔板读数器(iEMS REader，Labsystems，Finland)动态记录405nm处吸收值的增加。使用Enzfitter程序(Biosoft，Cambridge，United Kingdom)进行曲线数据至Michaelis-Menten方程式的拟合，其计算在那些条件下PC活性的Km值。需要时，在加入凝血酶和PC的同时添加45μg/ml从患者纯化的抗EPCR自身抗体(见下)。这样，就可以分析抗EPCR自身抗体对PC活性的影响。
抗EPCR抗体的纯化1.IgM抗体的纯化1ml含抗EPCR自身抗体的血清样品稀释于磷酸盐缓冲液(PBS)(磷酸钠100mM，NaCl 0.15M，pH＝7.4)，用0.45μm孔径的滤器过滤。滤出液加至被NHS HP(Amersham Biosciences)活化的HitTrap柱，此柱先前已固定了鼠抗人IgM多克隆抗体(Maruyama S，KubagawaH，Cooper MD.Activation of human B cells and inhibition of theirterminal differentiation by monoclonal anti-murine antibodies(人B细胞的活化和抗鼠单克隆抗体对它们的终端分化的抑制).J Immunol.1985；135192-9)。用5ml 0.1M，pH2.5的甘氨酸洗脱人IgM，收集在100μl 1M，pH9.0的Tris中。浓缩含有人IgM的部分，并对补加了CaCl25mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TB透析。
2.IgA抗体的纯化1ml的血清样品稀释于PBS中，并手动加至jacaline柱(Pierce)。被吸附的部分用2ml 0.1M溶于PBS的mellibiose洗脱，然后对PBS透析。由于后面纯化步骤所需，样品加至HiTrap蛋白G HP亲和柱(Amersham Biosciences)中以除去污染的IgG。含有IgA的未结合产物对50mM，pH7.0的KH2PO4透析，最后应用HiTrap Blue HP亲和柱(Amersham Pharmacia Biotech)去白蛋白。收集含纯化IgA的未结合物质，并对补加了CaCl25mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TB缓冲液透析。
3.IgG抗体的纯化取1ml含抗EPCR自身抗体的血清样品稀释于磷酸盐缓冲液(PBS)(磷酸钠100mM，NaCl 0.15M，pH＝7.4)，用0.45μm孔径的滤器过滤。滤出液加至HitTrap蛋白G HP柱(Amersham Biosciences)中进行处理，用5ml 0.1M，pH2.5的甘氨酸稀释人IgG，收集在100μl 1M，pH9.0的Tris中。收集含有人IgG的部分，并以添加CaCl25mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TB溶液透析。
rhsEPCR亲和柱的制备依据厂家说明书将rhsEPCR(在3ml 100 mM，pH8.5的NaHCO3中含的2mg)结合至HitTrap NHS-活化HP亲和柱(AmershamBiosciences)。一旦加入0.1M甘氨酸终止反应，用2M NaCl彻底冲洗rhsEPCR柱。这样rhsEPCR柱能结合补加了CaCl220mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TBS中的PC。使用补加了EDTA的TBS可将PC从柱上洗脱下来(数据未示出)。由于结合到柱上的rhsEPCR保留了它的吸附PC的能力，故它必定能保留它的天然构象及能被自身抗体识别的抗原表位。因而，如此制备的柱子足以用于除去血清或血浆样品中的抗EPCR自身抗体。
统计学方法在APLS病例和对照的研究中，患者(病例)与对照的抗EPCRIgM、IgA和IgG抗体高水平的机率的比较采用卡方检验进行。计算优势比(OR)(Martinez-González MA，of Irala-Estevez J&Guillén GrimaF，(1999)， Qué es una odds ratio？，Medicina Clínica，112，11416-422)和95％的置信区间(95％CI)作为APLS和抗EPCR自身抗体间关联的计量。
在胎死的配对病例-对照研究中，病例与对照连续变量的比较和分类分析分别采用配对样品的t-检验以及McNemar检验进行。基于连续变量和分类变量曼-怀二氏检验的相关系数评估对应于同种型IgG和IgM的抗EPCR自身抗体与ACL以及与IgM同种型的抗心磷脂抗体水平间的关系。
为评估与高水平IgG和IgM同种型的抗EPCR自身抗体相关的胎死危险度，用病例-对照对中进行了多重回归分析。依据这些免疫球蛋白在对照中的分布，主独立变量就是相应于分类数据同种型IgG和IgM的抗EPCR自身抗体水平。不同的边界点用于确定与更高危险度相关的水平。进行单一变量和多变量分析，拟合已知的胎死危险因子。在完全模型中不可能包括Leiden(FVL)和ACL；因而，考虑使用两个模型检测抗EPCR自身抗体的作用(1)同时引入相应于同种型IgM和IgG的抗EPCR自身抗体水平、IgM同种型的抗心磷脂抗体、ACL和凝血酶原G20210A；以及(2)与模型1一致的，但调整为FVL的存在/不存在，代替ACL。
模型(1)用于评估抗心磷脂抗体和ACL作为标记物，而不是病因学因子的假说，此假说表明血栓前状态由抗EPCR自身抗体引起。所有的计算均使用SPSS，10.0版统计学软件包(SPSS Inc.)完成。
II.结果以调查血浆和血清中的抗EPCR自身抗体的存在为目的，首先采用酵母P.pastoris表达系统产生rhsEPCR。基于描述的方法，从P.pastoris培养物中可以纯化出超过5mg的rhsEPCR。采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳和利用抗myc单克隆抗体的Western印迹分析，rhsEPCR以单一和轻微异质的条带出现，反映出有不同程度的糖基化，如以前的文献所报道(Fukudome K，Kurosawa S，Stearns-Kurosawa DJ，He X，Rezaie AR，Esmon CT.The endothelial cellprotein C receptor.Cell surface expression and direct ligand binding bythe soluble receptor(内皮细胞蛋白C受体。细胞表面表达和可溶性受体的直接配体结合).J Biol Chem.1996；27117491-8)[见图1]。
在凝血试验中，rhsEPCR可抑制APC的抗凝血活性，如先前所描述的(Regan LM，Stearns-Kurosawa DJ，Kurosawa S，Mollica J，Fukudome K， Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor.Inhibition of activated protein C anticoagulant function withoutmodulation of reaction with proteinase inhibitors(内皮细胞蛋白C受体。不用蛋白酶抑制剂调节反应时活化蛋白C的抗凝血功能的抑制).JBiol Chem.1996；27117499-503)(数据未显示)。除了以所预期的亲和性结合PC(见下)以外，在内皮细胞表面凝血酶对PC的活化以51±10nM的Km为特征。在2μM rhsEPCR存在下，其活化作用大大降低(Km约等于1000nM)，这意味着Ki约为70nM，且表明rhsEPCR结合PC与天然EPCR与PC的结合有着相似的效果，这在以前已有报道(Fukudome K，Kurosawa S，Stearns-Kurosawa DJ，He X，Rezaie AR，Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor. Cell surfaceexpression and direct ligand binding by the soluble receptor(内皮细胞蛋白C受体。细胞表面表达和可溶性受体的直接配体结合).J Biol Chem.1996；27117491-8；Regan LM，Stearns-Kurosawa DJ，Kurosawa S，Mollica J，Fukudome K，Esmon CT.The endothelial cell protein Creceptor.Inhibition of activated protein C anticoagulant function withoutmodulation of reaction with proteinase inhibitors(内皮细胞蛋白C受体。不用蛋白酶抑制剂调节反应时活化蛋白C的抗凝血功能的抑制).JBiol Chem.1996；27117499-503)。这些证据强有力地表明了rhsEPCR活性与构象的正确性-这样可以用于针对人EPCR的抗体的检测中。
APLS患者中的抗EPCR自身抗体取高水平代表每一对照组高于百分位97的那些，对应于同种型IgM、IgA或IgG的高水平的抗EPCR自身抗体与APLS相关联[OR＝4.47；95％CI1.15-17.40](见表1)。只在诊断为APLS的个体中检测到极高水平的抗EPCR自身抗体(见图2)3名患者表现出很高水平的IgM同种型抗EPCR自身抗体(患者A＝407AU，患者B＝301AU，患者C＝293AU)，2名患者表现出很高水平的IgA同种型抗EPCR自身抗体(患者D＝795AU，患者B＝475AU，他也表现出高水平的IgM同种型抗EPCR自身抗体)，以及2名患者表现出高水平的IgG同种型抗EPCR自身抗体(患者E＝230AU和患者F＝220AU)。这6名患者是有过血栓形成病史(这是选择标准之一)的女性(患者A、C、D和F有中风；患者E有心血管疾病；患者A、B、D和F有静脉血栓形成)。最令人关注的发现是呈现同种型IgM和IgA抗EPCR自身抗体的所有女性(除患者B外，该患者证明不可评估)都曾有过多次胎死事件。
考虑到此发现，分析结果直接导向抗EPCR自身抗体与胎死之间可能的相关性。
表1APLS与抗EPCR自身抗体相关的OR

抗EPCR自身抗体的生化特性从1ml血清中纯化来源于具有极高水平的患者的同种型IgM、IgA和IgG的抗EPCR自身抗体组分。患者C的IgM同种型抗EPCR自身抗体组分在凝血酶的存在下能减少培养的内皮细胞的产生APC(20％的残留PC活化能力，p＝0.02)。抑制效果是剂量依赖性的。为证明APLS患者的IgM同种型抗EPCR自身抗体组分的此效果归因于针对EPCR的特异性抗体，将样品加载到已固定rhsEPCR的亲和柱上，完全除去样品中特异性抗EPCR自身抗体。如此获得的组分丧失了它抑制APC产生的作用(87.6％的PC生成)，这意味着造成该现象的试剂必定是特异性抗EPCR自身抗体。从APLS患者中纯化的其它组分都不能改变内皮细胞产生APC的能力(图3)。
有胎死的女性中的抗EPCR自身抗体患者组和对照组中以前涉及胎死的危险因素的几率和抗EPCR自身抗体的几率显示于表2中。
表2胎死与研究的不同变量间关系的单变量OR及它们的置信区间

对照组百分位95％的IgM同种型抗EPCR自身抗体水平为99AU。87名患者中，16名(18％)表现出超过此边界值，与之相比，对照组中有3名(n＝87)。与那些表现出较低值的相比IgM同种型抗EPCR自身抗体水平超过百分位95的患者中未对胎死进行调整的OR为14(95％置信区间(CI)1.8-106.4)。当将边界点设在90％的百分位(83AU)时，OR是5.2(95％CI1.8-15.3).
对照组百分位95的IgG同种型抗EPCR自身抗体水平是94AU。87名患者中，13名(15％)表现出值超过此边界点，与之相比，对照组有4名。IgG同种型抗EPCR自身抗体水平超过95％百分位的患者中未对胎死进行调整的OR是4.3(95％CI1.2-15.2)。当将边界点设在90％的百分数(88.4AU)时，OR是2.3(95％CI0.9-5.6)。
另外，进行多变量分析用于调整潜在的混杂因素。如上所述，在同一多变量模型中，不可能包括FVL和ACL-因此要考虑两个模型模型(1)经过对抗磷脂抗体(也就是ACL和抗心磷脂抗体)和凝血素G20210A的调整；和模型(2)包括FVL，但不包括ACL。模型(1)中与超过百分位95的IgM同种型抗EPCR自身抗体相关的OR是23.1(95％CI2-266.3)，但在模型(2)中，该值是31.0(95％CI2-384.3)。模型(1)中与超过百分位95的IgG同种型抗EPCR自身抗体相关的OR是6.8(95％CI1.2-38.4)。依据包括Leiden的因子V，而不是ACL的模型(2)，超过百分位95的IgG同种型抗EPCR自身抗体相关的OR是11.0(95％CI1.6-73.5)。结果见表3。
表3胎死与高水平的抗EPCR自身抗体间关系的多变量ORs及95％置信区间

这些结果表明IgM和IgG同种型抗EPCR自身抗体对于胎死是独立的危险性因素。但是，在这一女性组中，高水平的IgA与胎死的相关性并不显著。
III.讨论实现了可以检测针对人EPCR的自身抗体的存在的方法(尤其是ELISA测试)。运用此系统，对以血栓形成和ACL为特征的APLS患者组进行研究，证实了(第一次在人的病理学上)同种型IgM、IgG和IgA特异性抗EPCR自身抗体的存在。该研究集中于APLS和ACL患者亚群，因为他们与增加的血栓形成危险度相关；因而，这些个体很可能表现出直接与临床症状相关的自身抗体。事实上，许多患者被发现具有很高水平的抗EPCR自身抗体。
这些自身抗体可为APLS患者上所见的血栓形成和流产提供解释。首先，EPCR是一种在大型血管的内皮和滋养层表达的分子。IgM和IgG免疫球蛋白可结合并活化补体；如果这些抗体靶向EPCR，它们可能活化内皮上的补体并且损伤后者-这样就促进了这个水平上的血栓形成；第二，已表明具有高水平IgM同种型抗EPCR自身抗体患者的IgM组分在凝血酶的存在下能大大减少由上皮细胞产生的APC。在通过使IGM组分共同经过EPCR亲和柱，特异性消除靶向EPCR的IgM之后，这种抑制效果就消失了-这意味着这种抑制效果归因于IgM同种型抗EPCR自身抗体。这种抗体可能在体内导致APC的低水平-自身构成血栓形成的强危险性因素的情况。
依据静脉和/或动脉血栓形成的标准筛选患者时，不可能评估与抗EPCR自身抗体相关的血栓形成的危险度。相反，相对于无先例的女性，在有胎死病史的女性中可检测到抗EPCR自身抗体的水平增加，尤其是IgM同种型。考虑到初步研究中的这些结果，决定进行配对病例-对照研究，以评估在与抗EPCR自身抗体的存在相关的女性的一般群体中，无法解释的第一次胎死事件的危险度。发现对于第一次胎死事件，IgM同种型抗EPCR自身抗体的高水平(定义为超过对照个体值分布的百分位95的值)构成一个强危险性因素，与低水平相比，相对危险性为23或31。IgG同种型抗EPCR自身抗体的高水平也构成强危险性因素，尽管低于IgM同种型的情况，依据所使用的数学模型相对危险度是7或11。在单变量分析中，IgM同种型的ACL和抗心磷脂抗体与增加的胎死危险度相关联，尽管这种关联在多变量模型中有所减弱-可能是因为由经典的抗磷脂抗体提供的信息可归于相关的抗EPCR自身抗体，这可能代表了胎死的病原学因素，而不是简单的危险性标记物。同样地，对FVL和凝血素G20210A进行了研究，最近它们与增加的晚期胎死危险度相联系-在单变量和多变量分析中鉴定出的与这种多态性相关联的增加的危险度。这种危险度在统计学上是不显著的，但是，可能是由于本研究中所涉及的患者数目的原因。
总之，本研究首次揭示了APLS和血栓形成患者中抗EPCR自身抗体的存在。IgM和IgG同种型抗EPCR自身抗体的存在增加了首次胎死事件的危险度。这些自身抗体可能内在地有助于APLS患者和一般群体的血栓形成和胎死。
实施例2心肌梗塞女性中抗EPCR自身抗体的检测研究组142名患有心肌梗塞的女性(年龄39±5岁，平均值±标准偏差)和142健康女性(年龄39±5岁)，按年龄和地理来源配对。研究了经典的心肌梗塞危险性因素(高血压、高胆固醇血症、糖尿病、吸烟和口服避孕药)。对血浆样品中的抗EPCR自身抗体IgG、IgM和IgA进行分析，按照“材料和方法”(实施例1)描述ELISA测试方法进行。
结果抗EPCR自身抗体的高水平与增加的心肌梗塞危险度相关，此高水平定义为超过对照组抗EPCR抗体水平分布的百分位93的值。在多变量分析中，对于IgA来说抗EPCR抗体的高水平与调整的优势率(OR)3.5相关，置信区间(95％CI)为1.4-8.9，而对于IgM，数值为OR＝3.0；95％CI1.2-7.5。
结论抗EPCR自身抗体的高水平构成女性心肌梗塞独立的危险因素。
序列表<110>西玛生物医学信息公司<120>评估出现与抗EPCR自身抗体的存在相关的病理的危险度和素因的方法<160>6<170>PatentIn version 2.0<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>寡核苷酸引物<400>1agcttggcat atcgattagc caagacgcct cagatg36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>寡核苷酸引物<400>2tattctatgc ggccgccgaa gtgtaggagc ggcttg36<210>3<211>222<212>PRT<400>3Ser Ile Ser Gln Asp Ala Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu1 5 10 15
Gln Ile Ser Tyr Phe Arg Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn20 25 30Ala Ser Leu Gly Gly His Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr35 40 45Asn Thr Thr Ile Ile Gln Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp50 55 60Ala Arg Thr Gln Ser Gly Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly65 70 75 80Leu Val Arg Leu Val His Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr85 90 95Ile Arg Cys Phe Leu Gly Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala100 105 110His Val Phe Phe Glu Val Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe115 120 125Arg Pro Glu Arg Ala Leu Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly130 135 140Val Val Thr Phe Thr Leu Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg145 150 155 160Tyr Glu Leu Arg Glu Phe Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln165 170 175Lys His Ile Ser Ala Glu Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser180 185 190Tyr Thr Ser Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu195 200 205
Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His210 215 220<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>锚定蛋白1<400>4Ala His Gly His Arg pro1 5<210>5<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>锚定蛋白2<400>5Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser1 5 10<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>锚定蛋白3<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(6)<223>必需的氨基酸<400>6Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys1 权利要求
1.评估样品中的针对内皮PC/活化PC受体(EPCR)的自身抗体的高水平存在的方法，其特征在于包括在体外定量来自个体的所述样品中的针对EPCR的自身抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述针对EPCR的自身抗体的高水平存在与选自自身免疫疾病、血管疾病和产科并发症的病理学相关。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述自体免疫病选自抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和自身免疫血管炎。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述血管疾病选自动脉血管疾病、静脉血管疾病和微循环血栓形成。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述血管疾病选自心肌梗塞、脑中风、暂时性脑血管意外、肢体局部缺血、动脉粥样硬化、动脉瘤、血栓形成、浅表静脉血栓形成、深层静脉血栓形成和肺栓塞。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述产科并发症选自流产、胎死、早产、宫内生长迟缓、子痫和先兆子痫。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于所提及的样品是血清或血浆样品。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于所提及的个体是人。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于这些抗EPCR自身抗体的定量通过偶联了标记物的免疫分析手段进行的。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于这些抗EPCR自身抗体的定量是通过ELISA检测手段进行的，所述手段包括a)包括EPCR氨基酸序列或其片段的多肽的固体载体固定，所述片段至少含有一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位；b)将被固定的多肽和来自于所述个体的怀疑含有抗EPCR自身抗体的样品孵育足够的时间，以使所述抗体与所述被固定的多肽结合，并形成多肽-抗EPCR自身抗体复合物；c)除去多余的未与被固定的多肽结合的样品；d)将所述多肽-抗EPCR自身抗体复合物和与酶连接的第二抗体孵育，其中所述第二抗体能与这些抗EPCR自身抗体结合。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所提及的多肽选自以下两种a)包括全长EPCR氨基酸序列的多肽；以及b)包括EPCR片段的氨基酸序列的多肽，所述片段含有至少一个能被抗EPCR抗体识别的抗原表位；
12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其特征在于所述多肽是融合蛋白，包括a)区域A，其由含有EPCR氨基酸序列或其片段的多肽组成，所述片段含有至少一个能被抗EPCR抗体识别的抗原表位；以及b)区域B，其由包含用于分离或纯化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于将所提及的融合蛋白锚定到固体载体的氨基酸序列的多肽组成。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述区域B与区域A的氨基末端结合。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述区域B与区域A的羧基末端结合。
15.如权利要求12-14任一项所述的方法，其特征在于所述区域A包含人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
16.如权利要求12-14任一项所述的方法，其中区域B中用于分离或纯化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于将所述融合蛋白锚定到固体载体的氨基酸序列，包括选自Arg-标签、His-标签、FLAG-标签、Strep-标签、能被抗体识别的抗原表位、SBP-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合域、甲壳质结合域、谷胱甘肽S-转移酶-标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-标签、Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO4)(2、4和8拷贝)、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ IDNO5)、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO6)(6次重复)、β-半乳糖苷酶和VSV-糖蛋白的氨基酸序列。
17.如权利要求12-16任一项所述的方法，其特征在于区域B由包含能被抗c-myc抗体识别的c-myc抗原表位和组氨酸尾(His-标签)的多肽组成。
18.如权利要求12-17任一项所述的方法，其特征在于所述多肽为包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列、对应于c-myc抗原表位的氨基酸序列和组氨酸尾(His-标签)的融合蛋白。
19.如权利要求12-18任一项所述的方法，其特征在于所述多肽为氨基酸序列显示在SEQ ID NO3中的融合蛋白。
20.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述第二抗体是来源于不同于被检样品个体的物种的免疫球蛋白同种型特异性抗体。
21.如权利要求10或20所述的方法，其特征在于所述第二免疫球蛋白同种型特异性抗体选自抗人IgG抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体，以及它们的混合物。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于所述第二抗体与选自过氧化物酶和碱性磷酸酶的酶连接。
23.如权利要求1-22所述的方法，其特征在于它还包括将源自所述个体的样品中检测的抗EPCR自身抗体水平与正常水平比较。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于检测抗EPCR自身抗体水平在给定时间段的变化。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于所述样品源自先前诊断患有自身免疫或血管疾病的个体，或患有产科并发症的个体并接受治疗处理的。
26.针对EPCR的自身抗体在评估样品中针对EPCR的自身抗体高水平存在的方法中的用途。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于所提及的样品中针对EPCR的自身抗体的高水平存在与选自自身免疫疾病、血管疾病和产科并发症的病理相关联。
28.包含EPCR氨基酸序列或其片段的多肽在样品中针对EPCR的自身抗体的高水平存在的方法中的用途，所述片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位，其特征在于包括在体外在所述样品中定量针对EPCR的自身抗体。
29.如权利要求28所述的用途，其特征在于所述与针对EPCR的自身抗体高水平存在相关的病理学选自自身免疫疾病、血管疾病和产科并发症。
30.如权利要求28所述的用途，其特征在于所述多肽是融合蛋白，包括a)区域A，由含有EPCR氨基酸序列的多肽或其片段的多肽组成，所述片段含有至少一个能被抗EPCR抗体识别的抗原表位；以及b)区域B，由包含用于分离或纯化所述融合蛋白的氨基酸序列和/或用于将所述融合蛋白锚定到固体载体的氨基酸序列组成。
31.如权利要求30所述的多肽的用途，其中所述区域A包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
32.如权利要求30或31任一项所述的用途，其特征在于所述多肽为包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列、对应于c-myc抗原表位的氨基酸序列和组氨酸尾(His-标签)的融合蛋白。
33.如权利要求30-32任一项所述的多肽的用途，其特征在于所述多肽为具有显示在SEQ ID NO3中的氨基酸序列的融合蛋白。
34.在体外评估样品中针对EPCR的自身抗体高水平存在的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括含有EPCR氨基酸序列或其片段的多肽，所述片段含有至少一个能被抗EPCR自身抗体识别的抗原表位。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其特征在于所述多肽是融合蛋白，包括i)区域A，由含有EPCR氨基酸序列的多肽或其片段的多肽组成，所述片段含有至少一个能被抗EPCR抗体识别的抗原表位；以及ii)区域B，由包含用于分离或纯化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于将所述融合蛋白锚定到固体载体的氨基酸序列组成。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述区域A特征在于包含人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
37.如权利要求35或36任一项所述的试剂盒，其特征在于所述多肽为包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列、对应于c-myc抗原表位的氨基酸序列和组氨酸尾(His-标签)的融合蛋白。
38.如权利要求35-37任一项所述的试剂盒，其特征在于所述多肽为具有显示在SEQ ID NO3中的氨基酸序列的融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及检测针对蛋白C/活化蛋白C内皮受体(EPCR)的自身抗体的高水平存在的方法。本发明的特征在于它包括在体外检测和定量样品中的抗EPCR自身抗体。
文档编号C07K14/705GK1954216SQ200580006853
公开日2007年4月25日 申请日期2005年2月3日 优先权日2004年2月6日
发明者何塞·埃米达桑托斯, 拉蒙·蒙特斯迪亚斯, 韦罗妮卡·乌尔塔多利纳雷斯 申请人:西玛生物医学信息公司