专利名称：糖尿病自身抗体谱免疫印迹试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属糖尿病血清学诊断技术范畴，具体为1型糖尿病自身抗体谱血清学免疫印迹 试剂盒的研发，可用于1型糖尿病的诊断、疗效和预后判断及与其它类型糖尿病的鉴别诊 断的医学临床领域。
背景技术：
糖尿病(DM)是以高血糖为特征的一组疾病的总称。按病因和发病机理分为l型糖尿 病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)及其它少见的类型。前者多年轻发病、胰岛素(INS)分 泌绝对缺乏而需INS治疗，临床常以此作分型判断。但多数2型糖尿病(T2DM)患者或早或 晚也会进入INS分泌绝对缺乏阶段，加之近年来T2DM有发病年轻化的趋势，故两型DM诊断 和鉴别诊断逐渐成为临床较为困惑的问题。有鉴于此，甚有学者提出取消两型DM的鉴别诊 断。但由于两型DM的病因学和遗传背景区别甚大，临床防治措施有所不同，故目前国际和 国内糖尿病防治指南仍规定需予区分。
在病因上，TlDM是一种胰岛e细胞特异性自身免疫病，血循环中存在有自身抗体。因 此探测这些自身抗体的存在与否，有可能使其血清学分型诊断成为可能。
事实上目前已有三种胰岛自身抗体常规用于临床T1DM的诊断——胰岛细胞抗体 (ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GDA)和胰岛素自身抗体(IAA)。 ICA是应用最早的T1DM免 疫学标志(1974年)，随病程延长而诊断价值下降较快是其致命的缺陷(病程2-5年患者阳 性率仅20%) ; GAD是TlDM自身免疫反应的启动耙抗原，其阳性在一定程度上反映e细胞损 害程度较重,它在体内以稳定的浓度维持较长时间，甚至在诊断10 20年仍可检出，但阳 性率不高(54-68%) ; IAA不是T1DM的特异性抗体,在胰岛素自身免疫综合征、甲状腺疾病 等也可重叠出现，甚至在正常人群中也有高达33%的阳性率。显然此三种自身抗体的检测 缺陷是明显的。由于联合检测可互补单独检测的优缺点，故有人试图联合检测三种抗体提 高检测效能，3项标联合检测的特异性性达90.9 % ,阳性率为92.1 %。
为克服上述临床问题，科研上开始研究一些新的糖尿病自身抗体。如IA-2A (酪氨酸 磷酸酶抗体)，其属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，与GAD相似，IA-2A见于神经组织和其 它内分泌组织包括垂体。在新发的1型糖尿病IA-2A阳性率大于60%。 2006年Chimienti等首次研究出一种特异性胰岛锌转运子ZnT8的功能和特性胰岛富含锌，因其是胰岛素结 晶过程所必需的，而ZnT8 (e-细胞特异性锌转运体8)可能是此过程中的关键蛋白，对胰 岛素的分泌有调控作用。2007年Wenzlau等报道了利用研究中较为经典的放免技术，对ZnT8 自身抗体血清学检测结果。223例新发T"M血清样本检测阳性率为63M、特异性高达98%。更 难得的是ZnT8自身抗体在GADA、 IAA和IA-2阴性的T1DM样本中有37. 5%阳性率，在ICA阴性 的TlDM样本中有26.3y。的阳性率。联合检测的结果是阳性率高达96%。 ZnT8早从2岁开始出 现，同时小样本调査的情况表明，其阳性率有随年龄和病程增加而增加的趋势。
单一抗体用于筛查1型糖尿病以ICAs敏感性最高，用于诊断则各抗体在不同人群 敏感性不同。目前国际上已逐渐达成一种共识，即联合检测多种抗体可提高l型糖尿病诊 断和筛查的敏感性、特异性和准确性。而胰岛自身抗体阳性的种类数对于预测发病较之单 一抗体的特异性更有意义。当前胰岛自身抗体的检测方法极不统一 ，这种多样性造成了统 一评价研究结果的困难性。如果所有这些抗体联合检测可能改进这些问题，但检测技术方 法不一样、无法同时、同一批检测等不一致因素，造成的差异增加而无法到达联合检测优 势互补"谱"检测的目的。
现有血清学检测技术中，最常采用的是ELISA法和放免法或免放法以及化学发光法。 ELISA法只能进行单一自身抗体的检测，而且操作过程复杂，单个指标检测需要4小时以上， 结果判断利用酶促瀑布效应间接判断而正确性差，同时需要价格昂贵的酶标仪等实验室非 通用设备。放免法同样只能进行单一自身抗体的检测，单个指标检测也需要2-4小时，也 需要价格昂贵的R-计数器等专用设备，且存在放射性衰减和污染。前者导致需制备质控曲 线而增加操作复杂性并影响检测准确，同时使试剂盒货架时间短。后者是对人身安全和环 境的污染。化学发光法检测时间短且灵敏度高，但与上述两种方法一样仍是标记方法的间 接判读结果，未引入分子量等更为客观的结果判读体系，检测正确度不理想，对每种指标 的检测需专供设计，如多种抗体的检测存在检测时间长、成本较高的问题，不利于基层临 床开展。
因此，研究和开发高价值的T1DM血清学标志和检测手段是DM研究中迫切问题。不但 可以准确的区分出1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)，缓解糖尿病分型诊断的窘 迫现状；还便于在临床工作中大力推广，作为1型糖尿病高危人群中的筛査，及对1型 糖尿病的病情监测及预后有一定指导意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，
本发明的目的在于提供一种一次同时检测全部上述己知的糖尿病自身抗体，同时灵敏度特异性等检测效能高，方法简便且费用低廉而便于推广， 可用于1型糖尿病的诊断、疗效和预后判断及与其它类型糖尿病的鉴别诊断的检测手段， 并以"糖尿病自身抗体谱血清学免疫印迹试剂盒"实物形式来表述。
本发明的目的是这样实现的 一种糖尿病自身抗体谱血清学免疫印迹试剂盒，将ICA、
IAA、 GAD、 IA-2A和ZnT8五种抗原用SDS-PAGE按分子量大小依次分开，再通过印迹技术 转移至印迹膜上，其印迹膜上即含有按分子量大小不同的各种胰岛细胞自身抗原成分。将 膜切成小条，配合显色液等试剂制成试剂盒,按说明书仅利用小型离心机这样的基层实验 室通用设备即可进行检测。
检测判断如果被检血清有相应抗体，就会在抗原的相应位置出现显色区带，与标准 对照即可判断其抗体种类和数量及强度。因引入分子量区分系统，且多种自身抗体检测一 次完成，检测效能提高。
相比现有糖尿病自身抗体检测手段，本发明具有如下优点
1、 糖尿病的诊断和鉴别诊断五种抗体一次同时联合检测，达到"谱"检测目的， 同时引入直接客观的分子量区分检测系统，从而使该试剂盒检测效能大大提高。对1型糖
尿病诊断的阳性率可高达98%;特异度高达98%以上，可望成为1型糖尿病诊断的金标准
而准确与其它类型糖尿病鉴别。
2、 预防、疗效和预后评估胰岛内I3细胞的免疫性破坏是潜隐性过程，在出现临床
症状前多年即可存在，对无临床症状人群的糖尿病自身抗体联合检测，能够对l型糖尿病 有很高的预测价值，同时可进行免疫干预，从而达到治疗和预防作用。对于已发症状的1 型糖尿病患者，可通过治疗后自身抗体谱变化评估疗效及预后。
3、 本发明试剂盒相比其他检测技术，具有多种自身抗体检测一次完成，操作简单， 耗时少(5种抗体可一次性全部检测，只需2小时左右)等优点。
4、 无半衰期的问题，因而货架时间长而，安全性好。
5、 使用成本较低，病人费用大大减少。
6、 对于其他自身免疫性疾病，有一定的诊断参考价值。
具体实施例方式
一种糖尿病自身抗体谱免疫印迹试剂盒，将ICA、 IAA、 GAD、 IA-2A和ZnT8五种抗原 用SDS-PAGE按分子量大小依次分开，再通过印迹技术转移至印迹膜上，其印迹膜上即含 有按分子量大小不同的各种胰岛细胞自身抗原成分。将膜切成小条，配合酶标抗体及显色 液试剂(底物)制成试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对的特异性抗体。
本发明采用通用的基因工程方法制备抗原，采用二十世纪分子生物学领域的三大发现
之--免疫印迹技术，将ZnT8、 IA-2A、 ICA、 IAA和GAD五种抗原用SDS-PAGE (变性聚
丙烯酰胺不连续凝胶电泳)方法，按分子量大小依次分开，再通过印迹技术转移至印迹膜 上，其印迹膜上即含有按分子量大小不同的各种胰岛细胞自身抗原成分。所述糖尿病自身 抗体免疫印迹试剂盒的制备方法采用现有技术，包括载体构建、表达和抗原纯化 SDS-PAGE检测方法建立；以及试剂盒的制备。
检测判断如果被检血清有相应抗体，就会在抗原的相应位置出现显色区带，与标准 对照即可判断其抗体种类和数量，从而可省去单抗制备、包板等繁杂过程，因引入分子量 区分机制，故可多种自身抗体检测一次完成，检测效能提高。
通过实验证明，该试剂盒检测的检测效能较其它方法好，同时在检测简便程度、检测 时间、货架时间、制备成本等方面综合优势明显(参见下表)。
方法敏感性特异性单次检测 血清抗体专用设备操作时间成本
免疫印迹法98%99.6%多种无需2小时(全 部指标)40元/指标/ 人份
ELISA40%-90%95%_99%单一酶标仪等2-4小时(单 个指标)56元/指标/ 人份
放免法40%-90%90%-95%单一R-计数器等2-4小时(单 个指标)60元/指标/ 人份
经过临床血清学标本检测、结果汇总和统计学分析发现，该试剂盒在糖尿病诊断分型、
鉴别诊断、预警和病情监测中有很好的应用价值，为临床T1DM诊断及鉴别诊断以及疗效 预后判定提供一种新的高效血清学检测手段。
本发明糖尿病自身抗体谱血清学免疫印迹试剂盒，包括印迹膜在内的成套试剂及使用 规范。具有如下特点1.检测对象涵盖有ZnT8、 ICA、 IM、 GAD和IA-2A五种糖尿病自身 抗体；2.利用准确度高的分子量大小的区分手段判读结果；3.采用改良实用性的SDS-PAGE 技术；4.所有五种糖尿病自身抗体检测一次同时完成，达到特有的"谱"检测目的；6.检
测效能指标高于现有同类试剂盒。
权利要求
1、糖尿病自身抗体谱免疫印迹试剂盒，其特征在于，将ICA、IAA、GAD、IA-2A和ZnT8五种糖尿病抗原用SDS-PAGE按分子量大小依次分开，再通过印迹技术转移至印迹膜上，其印迹膜上即含有按分子量大小不同的各种胰岛细胞自身抗原成分；将膜切成小条，配合酶标抗体及显色液试剂制成。
全文摘要
本发明提供一种糖尿病自身抗体谱血清学免疫印迹试剂盒。将目前已知的糖尿病所有自身抗体如ICA、IAA、GAD、ZnT8和IA-2A的相应抗原，采用SDS-PAGE技术按分子量大小依次分开转移至印迹膜上，如果被检血清有相应的糖尿病自身抗体，即会在印迹膜相应位置出现显色区带，与标准对照即可判断出这些自身抗体的种类、数量和强度，使多种糖尿病自身抗体检测同时一次完成。避免了现有的糖尿病自身抗体检测试剂盒的缺点，如检测抗体单一或不全面而不能达到“谱”的覆盖，或方法繁杂费时费力和费用增加，或试剂贮存及放射性安全性问题，或手段及检测时差的不一致造成的差异增加，使灵敏度、特异性等检测指标下降，而最终导致检测效能不足而无法适应临床需求。
文档编号G01N33/66GK101539579SQ200910103708
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者玥 吴, 玲 张, 静 徐, 兵 陈 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院