专利名称：用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于生物医学技术领域的检测方法，具体地说，是一种用于免疫介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法。
背景技术：
糖尿病分型诊断是按照糖尿病病因进行的。糖尿病分为4种类型，即1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病，他们对患者的危害和治疗方法截然不同，治疗前诊断分型对患者非常重要。1型糖尿病又叫青年发病型糖尿病，这是因为它常常在35岁以前发病，占糖尿病的10％以下，患者体内胰腺产生胰岛素的细胞已经损坏，胰岛素绝对缺乏，患者从发病开始就需要使用胰岛素治疗，并且终身使用。由于1型和2型糖尿病不仅发病原因、遗传倾向、临床表现不同，而且治疗也不同，因此在治疗前对糖尿病进行准确的分型诊断并选择治疗方式和估计预后对于糖尿病病人是十分重要的。尤其是1型糖尿病患者，需要尽可能早地进行诊断和治疗，在分型上出现错误将可能给病人带来无法挽回的后果。早在80年代，就有人观察到在被诊断的2型糖尿病患者血液中可检出具有特异性的胰岛素细胞自身抗体，这类患者易出现继发性的口服降糖药治疗失效、必须依赖胰岛素治疗的现象。随后的大量研究表明，这类患者实际属于1型糖尿病(LADA)，起病原因为自身免疫紊乱，但由于临床表现与2型糖尿病患者很难鉴别，又无相关抗体的检测手段，通常误诊为2型糖尿病，而按2型糖尿病治疗，会严重损害患者健康和生命。1997年美国糖尿病协会(ADA)在对糖尿病的诊断与分类中指出，1型糖尿病是由于自身免疫介导所致。近十多年来已陆续发现并确认了多种针对胰岛β细胞内蛋白分子的自身抗体。包括GAD65、IA2、Phogrin、ICA69、Insulin、GM2-1等多种自身抗原的抗体。前三种抗体在1型糖尿病发病前或刚发病时总阳性率可达80％，ICA69单独测定的阳性率是20-43％。
经对现有技术的文献检索发现，以Roche GAD或IA2抗体测定试剂盒为例，在其产品说明书(Diaplets Anti-GAD Roche Instruction Manual 2April 2000，抗GAD抗体酶联免疫测定法操作手册，罗氏产品，2002年4月2日；DiapletsAnti-IA-2Roche Instruction Manual 2 April 2000抗IA2抗体酶联免疫测定法操作手册，罗氏产品，2002年4月2日)中提到的抗体的测定方法1.取出霉链亲和素包被的酶标板，加入生物素化的GAD反应1小时。2.洗板3次。3.加入待测样品反应1小时。4.洗板3次。5.加入过氧化物酶标记的抗人IgG试剂反应1小时。6.洗板3次。7.加入ABTS显色反应半小时。8.加入终止液后作读数测定。其不足之处为只能针对1型糖尿病病人中GAD65、IA2等多个自身抗体的单一测定，虽然在一定程度上可预测和诊断该疾病，但每个抗体测定需花费100-150元，诊断率相对较低，联合检测两种或两种以上的抗体费用昂贵，且操作步骤多、时间长，对于测定者和被测定者都是不小的负担。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，使其能够一次检测抗GAD65、IA2、Phogrin、ICA69抗体中的任意一种或多种，同时由于采用双抗原夹心法(抗原-抗体-检测抗原一步反应方法)，达到整个操作过程简捷、准确，并显著提高1型糖尿病的诊断率，缩短检测时间、降低医疗费用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤(1)用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出目标蛋白；(2)用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱及GST亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成两部分；(3)抗原的包被将四种抗原混合在包被缓冲液内，在每个酶标孔中加入包被缓冲液，放置；(4)封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入封闭缓冲液，放置，洗板后保存备用；
(5)用双抗原夹心法测定抗体。
所述的mRNA是指含有IA2、Phogrin、ICA69的总mRNA和用于GAD65蛋白表达的为基因公司商品化的人脑海马体的mRNA；所述的目标DNA，是指GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA；所述的目标蛋白是指GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白。
所述的步骤(2)中，将每一种纯化了的表达蛋白分成两部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用。
所述的抗原的包被，是指将四种抗原混合在pH 8.5的包被缓冲液内，在每个酶标孔中加入60μl包被缓冲液，10℃放置1小时。
所述的步骤(4)中，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用。
所述的双抗原夹心法，其方法是取出备用的酶标板，在测定孔中加入用于抗体检测的稀释到工作浓度的检测抗原，所加检测抗原可按需要加含有任意一种、任意二种、任意三种或全部四种以测定相对应的抗体，加入待测品，摇床上反应；倒去反应液，加入链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应；洗板，显色，终止显色，读数。
所述的双抗原夹心法，具体是指在测定孔中加入25μl用于抗体检测的稀释到工作浓度的检测抗原。
所述的双抗原夹心法，具体是指加入25μl待测品，60rpm摇床上22-25℃反应1小时。
所述的双抗原夹心法，具体是指加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟。
所述的洗板，具体是指机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；所述的显色，具体是指加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；所述的终止显色，具体是指加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；所述的读数，具体是指于450nm处读取测定值。
通常利用抗原测定抗体的方法有很多种例如放射免疫法、荧光测定法、酶联免疫法等。而酶联免疫抗体测定法的传统方法是抗原-抗体-第二抗体的间接测定法，其操作步骤多过程长、容易产生假阳性、误差大；放射免疫法由于测定试剂盒保存期短、易对环境造成污染等原因不方便大范围的推广使用；荧光测定法对仪器要求高、操作成本高也不利于用作常规测定。所以本法选取了双抗原夹心法，就是利用每一个抗体具有二条结合臂，且二条结合臂上的可变区相同。在抗原抗体反应过程中，抗体的一条结合臂和包被抗原特异性相结合，另一条结合臂和检测抗原(生物素化抗原)特异性相结合从而形成抗原-抗体-抗原的桥联形式。在加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物后，链霉亲和素又和检测抗原上的生物素发生特异性结合。过氧化物酶作用于能够产生显色反应的底物，最后通过显色反应的高低来判断出抗体的浓度，作以此达到抗体的检测目的。多抗体联合检测的工作原理将四种糖尿病自身抗原包被于同一个酶标孔内，如果抗体测定时加入的是四种混合了的检测抗原，那么当加入糖尿病病人的血清样品后，那些抗体阳性的样品中，只要含有任何一种和包被抗原相对应的抗体，就会产生特异性的抗原抗体结合。通过显色反应就能得出是否有抗体阳性的结论；如果加入的检测抗原是四种里的三种，那么测定过程中就能检测出这三种抗体阳性与否；如果加入检测抗原中的任何二种，则可变为二种抗体的测定；如果只加入单一的检测抗原，那就和目前商品化的试剂盒一样，作单一的抗体检测。
为了简化测定过程，减少操作时间，同时降低假阳性的产生，在此双抗原夹心法的基础上成功地研究出有利于快速测定的一步反应法，以及相对成功的异抗原的双抗原夹心法。异抗原的双抗原夹心法的测定原理和普通的双抗原夹心法的区别在于普通的双抗原夹心法采用的包被抗原和检测抗原是完全相同的抗原，而异抗原是指用于目标抗体检测的抗原部分相同，但融合蛋白部分不同。因为在蛋白表达时，为了使被表达的蛋白具有活性，在表达系统中必须引入一个具有较好水溶性的融合蛋白，它和被表达的目标蛋白在一级结构上是相连的。如果采用普通的双抗原夹心法，因为融合蛋白也相同，在被测定的样品中一旦含有抗融合蛋白部分的抗体，就会在测定中产生融合蛋白-抗体-融合蛋白的桥联形式，这样测定就会以假阳性的形式而表现。要防止这种形式的出现可以采取二种方法一是采用异抗原的双抗原夹心法；二是测定系统中加入过量的游离的和融合蛋白部分相同的蛋白，利用竞争性抑制而防止融合蛋白-抗体-融合蛋白的桥联形式的产生。
本发明的有益效果是1.提高了1型糖尿病的检出率由于增加了二个自身抗体的测定，使得不是因为由GAD65和IA2这二种比较常见的自身抗体引起的自身免疫性糖尿病也能得以检出。2.简捷由于四个自身抗体可以作一次性测定，免去了多个抗体分别测定所要多耗费的时间。3.快速准确由于采用了双抗原夹心一步测定法，使采用Roche试剂盒所需的6小时缩短为2.5小时。又因反应步骤的减少使得操作误差也相应减少。4.所有的批间批内抗体测定的变异系数都小于10％，稳定性完全都符合抗体测定要求。
具体实施例方式
实施例一抗GAD65、IA2、Phogrin、ICA69抗体的测定1、四种抗原的制备(1)从1克新鲜的胰脏组织中提取mRNA，用于IA2、Phogrin、ICA69的蛋白表达；而用于GAD65蛋白表达的mRNA为商品化的人脑海马体mRNA(Clontech公司Cat No 6578-1)。
(2)RNA逆转录采用的是GIBCO公司的THERMOSCRIPT逆转录试剂盒。
(3)各目标基因的PCR扩增各目标基因扩增所用的引物GAD65P1ACAGGATTGGCATCTCCG，P2GGTCGACTTGGTGAGCAAGGTTAICA69P1GAAGGATTCTTGTCAGGACACA，P2GGTGTCGACTCATGCATTGAGCAIA2P1GGATCCCATGGTGACACTAC，P2AAGCTTACACAGAGATGCTCACACAGPhogrinP1TCATCGGATCCCTCCGCCATAGCTC，P2GATCAAGCTTCCTGACAACATC用高保真DNA扩增系统(PLATINUM Taq DNA Polymerase High FidelityGIBCO公司)对各逆转录产物进行DNA扩增，合成出相应的cDNA。
(4)各扩增的目标基因克隆入复制质粒各cDNA产物立即与pGEM-Teazy(Promega公司Cat No A1360)连接，转化入JM109进行兰白斑筛选。取白斑并用质粒提取试剂盒提取各带有目标基因的质粒。
(5)各个经复制的目标基因用DNA内切酶酶切后再一次克隆入表达质粒各提取的质粒用DNA内切酶进行酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖电泳后用QIAGEN胶DNA回收Kit(QIAGEN Cat No 28704)作目标DNA回收。回收的DNA利用连接试剂盒(Promega公司Cat No A1360)和蛋白表达质粒pMALTM-c2x连接并转化入TB1感受态细胞(蛋白表达系统Biolabs公司CatNo #E4122S)。另外为了使将来抗体测定取得更加好的效果，各目标基因还与蛋白表达质粒pET-42a连接并转化到JM109DE3感受态细胞(蛋白表达系统Novegen公司Cat No 70561-3)。
(6)蛋白表达转化后的各感受态涂板于LB培养基平板上，37℃培养过夜，接种各单菌落到LB液体培养液中，在15℃，60rpm的条件下培养表达6小时。所有在pMALTM-c2x表达系统中表达的蛋白都获得了带有MBP融合蛋白的可溶性表达蛋白。本蛋白表达共成功表达出四种6个蛋白带有MBP的IA2、带有MBP的GAD65、带有MBP的ICA69、带有MBP的Phogrin、带有GST的IA2、带有GST的Phogrin。
(7)蛋白纯化带有MBP的表达蛋白用Biolabs公司蛋白表达系统内的蛋白纯化部分，即麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对各带有MBP的蛋白进行蛋白纯化；带有GST的表达蛋白用Novegen公司蛋白表达系统的蛋白纯化部分，即GST亲和层析柱进行蛋白纯化。纯化后的蛋白用离心浓缩管将蛋白浓缩到1mg/ml，蛋白浓度测定方法用Pierce公司BCA测定试剂盒。
(8)四种抗原的生物素化取GAD65、ICA69(融合蛋白为MBP)、IA2和Phogrin(融合蛋白是GST)各1ml用Pierce生物素化试剂盒并以操作手册要求的操作步骤对各抗原进行生物素化，完成生物素化的各个蛋白溶液加入50％甘油，2％牛血清白蛋白后-20℃保存。
(9)分别取纯化的四种抗原(都有MBP)1ml加入等量的完全弗氏试剂用二个5ml针筒对推方法作充分混合，采用皮下注射法对3～4公斤的大白兔进行免疫。一个月后，相同的蛋白和非完全弗氏试剂以相同的方法混合后作加强免疫，过一周后再加强免疫一次。每种抗原免疫两个白兔，产生抗体后，心脏放血，经离心后取血清用于作抗体测定的参考血清，-20℃保存备用。
2、抗体的测定(1)抗原的包被从冰箱中取出低温保存的用于包被的抗原，这四种抗原都为带有MBP融合蛋白的表达蛋白，浓度都为1mg/ml。用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟。
(2)封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的pH为8.5碳酸盐封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定。
(3)用双抗原夹心法测定抗体取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl用于抗体检测的稀释到工作浓度的检测抗原，所加检测抗原可按需要加含有任意一种、任意二种、任意三种或全部四种以测定相对应的抗原，加入25μl待测品，60rpm摇床上22℃反应1小时。各检测抗原的工作终浓度为IA2 20μg/ml；GAD6515μg/ml；ICA69 10μg/ml；Phogrin 7.5μg/ml。抗体稀释液为含有5mg/ml MBP蛋白、2％BSA的pH为7.5的磷酸盐缓冲液。
(4)倒去反应液，加入100μl浓度为0.5μg/ml的链霉亲和素过氧化物酶复合物(Rockland公司，Cat No.S000-03)同样条件反应20分钟。
(5)洗板机器洗板5次，条件350ul/孔，振荡半分钟，静止2分钟；(6)显色加入100μl TMB(Sigma公司，Cat No.T-8768)反应液，室温避光放置15分钟；(7)终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；(8)读数于450nm处读取测定值。
本发明提高了1型糖尿病的检出率由于增加了二个自身抗体的测定，使得不是因为由GAD65和IA2这二种比较常见的自身抗体引起的自身免疫性糖尿病也能得以检出。由于四个自身抗体可以作一次性测定，免去了多个抗体分别测定所要多耗费的时间。由于采用了双抗原夹心一步测定法，使采用Roche试剂盒所需的6小时缩短为2.5小时。又因反应步骤的减少使得操作误差也相应减少。
实施例二抗GAD65、IA2、Phogrin、ICA69抗体的测定1、四种抗原的制备(1)从1克新鲜的胰组织提取mRNA，该mRNA为商品化的人脑mRNA(Clontech公司Cat No 6578-1)。
(2)RNA逆转录采用的是GIBCO公司的THERMOSCRIPT逆转录试剂盒。
(3)各目标基因的PCR扩增各目标基因所用的引物GAD65P1ACAGGATTGGCATCTCCG，P2GGTCGACTTGGTGAGCAAGGTTAICA69P1GAAGGATTCTTGTCAGGACACA，P2GGTGTCGACTCATGCATTGAGCAIA2P1GGATCCCATGGTGACACTAC，P2AAGCTTACACAGAGATGCTCACACAGPhogrinP1TCATCGGATCCCTCCGCCATAGCTC，P2GATCAAGCTTCCTGACAACATC用高保真DNA扩增系统(PLATINUM Taq DNA Polymerase High FidelityGIBCO公司)对各逆转录产物进行DNA扩增，合成出相应的cDNA。
(4)各扩增的目标基因克隆入复制质粒各cDNA产物立即与pGEM-Teazy(Promega公司Cat No A1360)连接，转化入JM109进行兰白斑筛选。取白斑并用质粒提取试剂盒提取各带有目标基因的质粒。
(5)各个经复制的目标基因用DNA内切酶酶切后再一次克隆入表达质粒各提取的质粒用DNA内切酶进行酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖电泳后用QIAGEN胶DNA回收Kit(QIAGEN Cat No 28704)作目标DNA回收。回收的DNA利用连接试剂盒(Promega cat No A1360)和蛋白表达质粒pMALTM-c2x连接并转化入TB1感受态细胞(蛋白表达系统Biolabs公司cat No #E4122S)。另外为了使将来抗体测定取得更加好的效果，各目标基因还与蛋白表达质粒pET-42a连接并转化到JM109DE3感受态细胞(蛋白表达系统Novegen公司CatNo 70561-3)。
(6)蛋白表达转化后的各感受态涂板于LB培养基平板上，37℃培养过夜，接种各单菌落到LB液体培养液中，在15℃，60rpm的条件下培养表达6小时。所有在pMALTM-c2x表达系统中表达的蛋白都获得了带有MBP融合蛋白的可溶性表达蛋白。本蛋白表达共成功表达出四种6个蛋白带有MBP的IA2、带有MBP的GAD65、带有MBP的ICA69、带有MBP的Phogrin、带有GST的IA2、带有GST的Phogrin。
(7)蛋白纯化带有MBP的表达蛋白用Biolabs公司蛋白表达系统内的蛋白纯化部分，即麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对各带有MBP的蛋白进行蛋白纯化；带有GST的表达蛋白用Novegen公司蛋白表达系统的蛋白纯化部分，即GST亲和层析柱进行蛋白纯化。纯化后的蛋白用离心浓缩管将蛋白浓缩到1mg/ml，蛋白浓度测定方法用Pierce公司BCA测定试剂盒。
(8)四种抗原的生物素化取GAD65、ICA69(融合蛋白为MBP)、IA2和Phogrin(融合蛋白是GST)各1ml用Pierce生物素化试剂盒并以操作手册要求的操作步骤对各抗原进行生物素化，完成生物素化的各个蛋白溶液加入50％甘油，2％牛血清白蛋白后-20℃保存。
(9)分别取纯化的四种抗原(都有MBP)1ml加入等量的完全弗氏试剂用二个5ml针筒对推方法作充分混合，采用皮下注射法对3～4公斤的大白兔进行免疫。一个月后，相同的蛋白和非完全弗氏试剂以相同的方法混合后作加强免疫，过一周后再加强免疫一次。每种抗原免疫两个白兔，产生抗体后，心脏放血，经离心后取血清用于作抗体测定的参考血清，-20℃保存备用。
2、抗体的测定(1)抗原的包被从冰箱中取出低温保存的用于包被的抗原，这四种抗原都为带有MBP融合蛋白的表达蛋白，浓度都为1mg/ml。用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟。
(2)封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300ul含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的pH为8.5碳酸盐封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定。
(3)用双抗原夹心法测定抗体取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl用于抗体检测的稀释到工作浓度的检测抗原，所加检测抗原可按需要加含有任意一种、任意二种、任意三种或全部四种以测定相对应的抗原，加入25μl待测品，60rpm摇床上25℃反应1小时。各检测抗原的工作终浓度为IA2 20μg/ml；GAD6515μg/ml；ICA69 10μg/ml；Phogrin 7.5μg/ml。抗体稀释液为含有5mg/ml MBP蛋白、2％BSA的pH为7.5的磷酸盐缓冲液。
(4)倒去反应液，加入100ul浓度为0.5μg/ml的链霉亲和素过氧化物酶复合物(Rockland公司，Cat No.S000-03)同样条件反应20分钟。
(5)洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；(6)显色加入100ul TMB(Sigma公司，Cat No.T-8768)反应液，室温避光放置15分钟；(7)终止显色加入100ul 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；(8)读数于450nm处读取测定值。
本发明提高了1型糖尿病的检出率由于增加了二个自身抗体的测定，使得不是因为由GAD65和IA2这二种比较常见的自身抗体引起的自身免疫性糖尿病也能得以检出。由于四个自身抗体可以作一次性测定，免去了多个抗体分别测定所要多耗费的时间。由于采用了双抗原夹心一步测定法，使采用Roche试剂盒所需的6小时缩短为2.5小时。又因反应步骤的减少使得操作误差也相应减少。
实施例三抗GAD65、IA2、Phogrin、ICA69抗体的测定
1、四种抗原的制备(1)取1克新鲜的胰组织以强烈变性剂提取mRNA，该mRNA为商品化的人脑mRNA(Clontech公司Cat No 6578-1)。
(2)RNA逆转录采用的是GIBCO公司的THERMOSCRIPT逆转录试剂盒。
(3)各目标基因的PCR扩增各目标基因所用的引物GAD65P1ACAGGATTGGCATCTCCG，P2GGTCGACTTGGTGAGCAAGGTTAICA69P1GAAGGATTCTTGTCAGGACACA，P2GGTGTCGACTCATGCATTGAGCAIA2P1GGATCCCATGGTGACACTAC，P2AAGCTTACACAGAGATGCTCACACAGPhogrinP1TCATCGGATCCCTCCGCCATAGCTC，P2GATCAAGCTTCCTGACAACATC用高保真DNA扩增系统(PLATINUM Taq DNA Polymerase High FidelityGIBCO公司)对各逆转录产物进行DNA扩增，合成出相应的cDNA。
(4)各扩增的目标基因克隆入复制质粒各cDNA产物立即与pGEM-Teazy(Promega公司Cat No A1360)连接，转化入JM109进行兰白斑筛选。取白斑并用质粒提取试剂盒提取各带有目标基因的质粒。
(5)各个经复制的目标基因用DNA内切酶酶切后再一次克隆入表达质粒各提取的质粒用DNA内切酶进行酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖电泳后用QIAGEN胶DNA回收Kit(QIAGEN Cat No 28704)作目标DNA回收。回收的DNA利用连接试剂盒(Promega cat No A1360)和蛋白表达质粒pMALTM-c2x连接并转化入TB1感受态细胞(蛋白表达系统Biolabs公司cat No #E4122S)。另外为了使将来抗体测定取得更加好的效果，各目标基因还与蛋白表达质粒pET-42a连接并转化到JM109DE3感受态细胞(蛋白表达系统Novegen公司CatNo 70561-3)。
(6)蛋白表达转化后的各感受态涂板子LB培养基平板上，37℃培养过夜，接种各单菌落到LB液体培养液中，在15℃，60rpm的条件下培养表达6小时。所有在pMALTM-c2x表达系统中表达的蛋白都获得了带有MBP融合蛋白的可溶性表达蛋白。本蛋白表达共成功表达出四种6个蛋白带有MBP的IA2、带有MBP的GAD65、带有MBP的ICA69、带有MBP的Phogrin、带有GST的IA2、带有GST的Phogrin。
(7)蛋白纯化带有MBP的表达蛋白用Biolabs公司蛋白表达系统内的蛋白纯化部分，即麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对各带有MBP的蛋白进行蛋白纯化；带有GST的表达蛋白用Novegen公司蛋白表达系统的蛋白纯化部分，即GST亲和层析柱进行蛋白纯化。纯化后的蛋白用离心浓缩管将蛋白浓缩到1mg/ml，蛋白浓度测定方法用Pierce公司BCA测定试剂盒。
(8)四种抗原的生物素化取GAD65、ICA69(融合蛋白为MBP)、IA2和Phogrin(融合蛋白是GST)各1ml用Pierce生物素化试剂盒并以操作手册要求的操作步骤对各抗原进行生物素化，完成生物素化的各个蛋白溶液加入50％甘油，2％牛血清白蛋白后-20℃保存。
(9)分别取纯化的四种抗原(都有MBP)1ml加入等量的完全弗氏试剂用二个5ml针筒对推方法作充分混合，采用皮下注射法对3～4公斤的大白兔进行免疫。一个月后，相同的蛋白和非完全弗氏试剂以相同的方法混合后作加强免疫，过一周后再加强免疫一次。每种抗原免疫两个白兔，产生抗体后，心脏放血，经离心后取血清用于作抗体测定的参考血清，-20℃保存备用。
2、抗体的测定(1)抗原的包被从冰箱中取出低温保存的用于包被的抗原，这四种抗原都为带有MBP融合蛋白的表达蛋白，浓度都为1mg/ml。用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟。
(2)封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300ul含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的pH为8.5碳酸盐封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定。
(3)用双抗原夹心法测定抗体取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl用于抗体检测的稀释到工作浓度的检测抗原，所加检测抗原可按需要加含有任意一种、任意二种、任意三种或全部四种以测定相对应的抗原，加入25μl待测品，60rpm摇床上23℃反应1小时。各检测抗原的工作终浓度为IA2 20μg/ml；GAD6515μg/ml；ICA69 10μg/ml；Phogrin 7.5μg/ml。抗体稀释液为含有5mg/ml MBP蛋白、2％BSA的pH为7.5的磷酸盐缓冲液。
(4)倒去反应液，加入100μl浓度为0.5μg/ml的链霉亲和素过氧化物酶复合物(Rockland公司，Cat No.S000-03)同样条件反应20分钟。
(5)洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；(6)显色加入100μl TMB(Sigma公司，Cat No.T-8768)反应液，室温避光放置15分钟；(7)终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；(8)读数于450nm处读取测定值。
本发明提高了1型糖尿病的检出率由于增加了二个自身抗体的测定，使得不是因为由GAD65和IA2这二种比较常见的自身抗体引起的自身免疫性糖尿病也能得以检出。由于四个自身抗体可以作一次性测定，免去了多个抗体分别测定所要多耗费的时间。由于采用了双抗原夹心一步测定法，使采用Roche试剂盒所需的6小时缩短为2.5小时。又因反应步骤的减少使得操作误差也相应减少。
实施例四抗GAD65、IA2、ICA69抗体的联合测定(1)抗原的制备从人的胰脏中提取出mRNA，用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白，最后用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成二部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用；
(2)抗体的测定①抗原的包被用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟；②封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定；③用双抗原夹心法测定抗体a.取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl GAD65、IA2、ICA69混合的检测抗原，检测抗原的混合方法是GAD65∶IA2∶ICA69∶稀释缓冲液按1∶1∶1∶1体积比混合，使各检测抗原的工作终浓度为IA2 20μg/ml；GAD6515μg/ml；ICA69 10μg/ml。加入25μl待测品，60rpm摇床上22℃反应1小时；b.倒去反应液，加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟；c.洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；d.显色加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；e.终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；f.读数于450nm处读取测定值。
实施效果在实验中所测的40个样品，每一个样品中凡是有抗GAD65、IA2、ICA69抗体存在，都通过三抗体联合测定而得以检出，敏感性和特异性都为100％。
实施例五抗GAD65、IA2、Phogrin抗体的联合测定(1)抗原的制备从人的胰脏中提取出mRNA，用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白，最后用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成二部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用；(2)抗体的测定①抗原的包被用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟；②封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定；③用双抗原夹心法测定抗体a.取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl GAD65、IA2、ICA69混合的检测抗原，检测抗原的混合方法是GAD65∶IA2∶Phogrin∶稀释缓冲液按1∶1∶1∶1体积比混合，使各检测抗原的工作终浓度为IA2 20μg/ml；GAD6515μg/ml；Phogrin 7.5μg/ml。加入25μl待测品，60rpm摇床上22.5℃反应1小时；b.倒去反应液，加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟；c.洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；d.显色加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；e.终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；f.读数于450nm处读取测定值。
实施效果在实验中所测的40个样品，每一个样品中凡是有抗GAD65、IA2、Phogrin抗体存在，都通过三抗体联合测定而得以检出，敏感性和特异性都为100％。
实施例六抗GAD65、ICA69、Phogrin抗体的联合测定(1)抗原的制备从人的胰脏中提取出mRNA，用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白，最后用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成二部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用；(2)抗体的测定①抗原的包被用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟；②封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定；③用双抗原夹心法测定抗体a.取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl GAD65、IA2、ICA69混合的检测抗原，检测抗原的混合方法是GAD65∶ICA69∶Phogrin∶稀释缓冲液按1∶1∶1∶1体积比混合，使各检测抗原的工作终浓度为GAD6515μg/ml；ICA69 10μg/ml；Phogrin 7.5μg/ml。加入25μl待测品，60rpm摇床上23℃反应1小时；b.倒去反应液，加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟；c.洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；d.显色加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；e.终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；f.读数于450nm处读取测定值。
实施效果在实验中所测的40个样品，每一个样品中凡是有抗GAD65、ICA69、Phogrin抗体存在，都通过三抗体联合测定而得以检出，敏感性和特异性都为100％。
实施例七抗GAD65、IA2抗体的联合测定(1)抗原的制备从人的胰脏中提取出mRNA，用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白，最后用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成二部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用；(2)抗体的测定①抗原的包被用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟；②封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定；③用双抗原夹心法测定抗体a.取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl GAD65、IA2混合的检测抗原，检测抗原的混合方法是GAD65∶IA2∶稀释缓冲液按1∶1∶2体积比混合，使各检测抗原的工作终浓度为GAD6515μg/ml；IA2 20μg/ml。加入25μl待测品，60rpm摇床上25℃反应1小时；b.倒去反应液，加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟；c.洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；d.显色加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；e.终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；f.读数于450nm处读取测定值。
实施效果在实验中所测的40个样品，每一个样品中凡是有抗GAD65、IA2抗体存在，都通过双抗体联合测定而得以检出，敏感性和特异性都为100％。
实施例八抗GAD65抗体的测定(1)抗原的制备从人的胰脏中提取出mRNA，用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白，最后用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成二部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用；(2)抗体的测定①抗原的包被用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟；②封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定；③用双抗原夹心法测定抗体a.取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl GAD65检测抗原，检测抗原的稀释方法是GAD65∶稀释缓冲液按1∶3体积比混合，使GAD65检测抗原的工作终浓度为15μg/ml。加入25μl待测品，60rpm摇床上24℃反应1小时；b.倒去反应液，加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟；c.洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；d.显色加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；e.终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；f.读数于450nm处读取测定值。
实施效果在实验中所测的20个样品，每一个样品中凡是有抗GAD65抗体存在，都通过该抗体测定而得以检出，敏感性和特异性都为100％。
实施例九抗IA2抗体的测定(1)抗原的制备从人的胰脏中提取出mRNA，用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白，最后用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成二部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用；(2)抗体的测定①抗原的包被用pH 8.5的碳酸盐包被缓冲液对四种抗原进行稀释并混合，各抗原的最终稀释比例为GAD65、IA2都是1∶100，ICA69、Phogrin都是1∶200。酶标孔内的加样体积为60μl/孔，10℃放置90分钟；②封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入300μl含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液，于10℃放置1小时，洗板后4℃保存备用，用于抗体的测定；③用双抗原夹心法测定抗体a.取出备用的酶标板，在测定孔中加入25μl IA2检测抗原，检测抗原的稀释方法是IA2∶稀释缓冲液按1∶3体积比混合，使IA2检测抗原的工作终浓度为20μg/ml。加入25μl待测品，60rpm摇床上23℃反应1小时；b.倒去反应液，加入100μl链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应20分钟；c.洗板机器洗板5次，条件350μl/孔，振荡半分钟，静止2分钟；d.显色加入100μl TMB反应液，室温避光放置15分钟；e.终止显色加入100μl 0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀；f.读数于450nm处读取测定值。
实施效果在实验中所测的20个样品，每一个样品中凡是有抗IA2抗体存在，都通过该抗体测定而得以检出，敏感性和特异性都为100％。
权利要求
1.一种用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出目标蛋白；(2)用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱及GST亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成两部分；(3)抗原的包被将四种抗原混合在包被缓冲液内，在每个酶标孔中加入包被缓冲液，放置；(4)封闭倒去酶标孔内的蛋白溶液，加入封闭缓冲液，放置，洗板后保存备用；(5)用双抗原夹心法测定抗体。
2.根据权利要求1所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的mRNA是指含有IA2、Phogrin、ICA69的总mRNA和用于GAD65蛋白表达的为基因公司商品化的人脑海马体的mRNA；所述的目标DNA，是指GAD65、IA2、Phogrin、ICA69这四种目标DNA；所述的目标蛋白是指GAD65、IA2、Phogrin、ICA69四种目标蛋白。
3.根据权利要求1所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的步骤(2)中，将每一种纯化了的表达蛋白分成两部分，一部分低温保存作包被抗原备用，另一部分用生物素化试剂盒对表达蛋白进行生物素化，低温保存以作检测抗原备用。
4.根据权利要求1所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的抗原的包被，是指将四种抗原混合在pH8.5的包被缓冲液内。
5.根据权利要求1所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的封闭缓冲液是指含5％无脂奶粉、15％胎牛血清的封闭缓冲液。
6.根据权利要求1所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的双抗原夹心法，其方法是取出备用的酶标板，在测定孔中加入用于抗体检测的稀释到工作浓度的检测抗原，所加检测抗原可按需要加含有任意一种、任意二种、任意三种或全部四种以测定相对应的抗体，加入待测品，摇床上反应；倒去反应液，加入链霉亲和素过氧化物酶复合物，同样条件反应；洗板，显色，终止显色，读数。
7.根据权利要求6所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的双抗原夹心法，具体是指摇床上22-25℃反应。
8.根据权利要求6所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的洗板，具体是指机器洗板，350μl/孔，振荡，静止。
9.根据权利要求6所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的显色，具体是指加入TMB反应液，室温避光放置。
10.根据权利要求6所述的用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，其特征是，所述的终止显色，具体是指加入0.5M硫酸，轻轻摇动数下使混匀。
全文摘要
一种用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法，属于生物医学技术领域。本发明包括以下步骤(1)用逆转录酶对mRNA进行逆转录，再用高保真DNA聚合酶分别合成出目标DNA，用连接酶和蛋白表达质粒进行连接，转化到大肠杆菌内分别表达出目标蛋白；(2)用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱及GST亲和层析柱纯化分离出表达蛋白，将每一种纯化了的表达蛋白分成两部分；(3)抗原的包被将四种抗原混合在包被缓冲液内，在每个酶标孔中加入包被缓冲液，放置；(4)封闭；(5)用双抗原夹心法测定抗体。本发明能够一次检测抗GAD
文档编号G01N1/34GK1773282SQ200510030759
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月27日 优先权日2005年10月27日
发明者潘晓平, 项坤三, 贾伟平 申请人:上海交通大学