专利名称：基于igfbp-2自身抗体或其与igfbp-2联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于IGFBP-2自身抗体(IGFBP-2_Abs)的检测或其与IGFBP-2联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，以及IGFBP-2自身抗体的检测或其与IGFBP-2的联合检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用。具体而言，本发明中对IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，对IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤，和结直肠肿瘤I-IV级。
背景技术：
手术切除是治疗早期肿瘤最有效的手段。然而因为肿瘤早期没有明显症状，且没有有效的早期肿瘤筛查方法，所以大多数肿瘤病人在就诊时已具有不可切除，不能治愈的肿瘤。医学影像和内视镜技术可能提高肿瘤的早诊，但是其高昂的费用和复杂的技术要求限制了它们的应用。然而，血液检测是早期筛查和诊断肿瘤的一种简便而经济实用的方法。文献报道，恶性肿瘤患者能够产生对其肿瘤携带的肿瘤相关抗原 (tumor-associated antigen, TAA)的自身抗体，因此,肿瘤相关抗原的自身抗体具有肿瘤诊断的价值，尤其在对早癌的诊断。因为外周血中肿瘤相关抗原的自身抗体出现能够在标准的临床检查前报道恶变的发生(1-4)。研究最多的是p53自身抗体(p53-Abs)。其已在临床诊断出肿瘤之前的患癌高危个体血清中检测到。例如重度吸烟者和患有长期慢性阻塞性肺病的患者得肺癌之前(5)，巴雷特食管病人患食道癌之前￠)，具有口腔癌前病变的病人患口腔癌之前都能检测到P53自身抗体(7)。有肝硬化的病人在后来发展成肝癌之前， 能检测到抗核自身抗体(8)。最近发现,抗annexin 1,14_3_3theta和LAMRl的自身抗体, 在没有肺肿瘤状发生和临床确诊之前一年的高危患者血清中被检测到(9)。膜岛素样生长因子结合蛋白-2(Insulin-like growth factor binding protein-2, IGFBP-2)是一种分泌性蛋白，其编码基因如基因ACCESSION NM_000597, VERSION NM_000597. 2 GI :55925575所示。最近报道，IGFBP-2是一种肿瘤抗原，能够在乳腺癌，宫颈癌，和结肠癌患者体内诱导T细胞和B细胞免疫反应(10-11)。IGFBP-2在 30%-80%的多种恶性肿瘤中过表达，如脑胶质瘤，结直肠肿瘤，前列腺癌，宫颈癌，乳腺癌， 及甲状腺癌；而且IGFBP-2过表达程度与肿瘤级别相关(12-17)。IGFBP-2能促进癌细胞转移和侵袭，并且能通过调控PI3K/Akt/PTEN信号传导通路促进肿瘤发展(18-21)。常有报道外周血中IGFBP-2的浓度与恶性肿瘤的复发，转移和预后相关。但是，IGFBP-2在早癌患者血中浓度与正常人差别不大。因此，IGFBP-2诊断早癌不理想，如脑胶质瘤(22-25)。因此，目前需要发现敏感性和/或特异性更高、能够诊断早期肿瘤和/或能够诊断和监测肿瘤的发展的肿瘤检测标记物。
发明内容
本发明首次证明了 IGFBP-2自身抗体(IGFBP-2_Abs)能够作为早期肿瘤诊断标志物、同时IGFBP-2-Abs和IGFBP-2联合检测能有效诊断各期肿瘤，监测肿瘤从低级别向高级别进展，即肿瘤的早、中、晚期，从而解决了上述问题。本发明的一个目的在于提供基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。本发明的另一个目的在于提供基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。其中，所述IGFBP-2自身抗体选自由抗IGFBP-2的IgG自身抗体、抗IGFBP-2的IgA 自身抗体、抗IGFBP-2的IgM自身抗体、抗IGFBP-2的IgD自身抗体和抗IGFBP-2的IgE自身抗体组成的组，优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体和抗IGFBP-2的IgM自身抗体，最优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体。其中，所述第一试剂组包括使用通过常规间接ELISA法或短肽标签捕获ELISA法测定IGFBP-2自身抗体的试剂；所述第二试剂组包括通过直接ELISA法测定IGFBP-2的试剂。其中，所述癌或肿瘤为胶质瘤或结直肠肿瘤。在基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒中，所述早期肿瘤为星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤，或者为结直肠肿瘤I-II级，所述高级别腺瘤为高级别结直肠息肉。在基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒中，所述肿瘤为星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤；或者为结直肠肿瘤I-IV 级。其中，所述样品选自由血液、血浆、血清、组织液、细胞间液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、淋巴液和唾液组成的组，优选选自由血液、血清、血浆、组织液和淋巴液组成的组，还更优选选自由血液、血清和血浆组成的组,最优选为血清。本发明的又一目的在于提供IGFBP-2自身抗体的检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的闻级别腺瘤。本发明的还一个目的在于提供IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。本发明中对IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤(例如星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤)及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，对IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2 的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤(即，胶质瘤II级)、间变星形细胞瘤(即胶质瘤III级)和/或胶质母细胞瘤(即，胶质瘤IV级)，以及结直肠肿瘤I-IV级。
图I.血清抗IGFBP-2的IgG自身抗体。A-D，比较正常对照与肿瘤、脑胶质瘤及其不同分期，结直肠息肉，结直肠肿瘤及其不同级别。血清IGFBP-2-Abs浓度的中值和四分位数的范围见箱线图。N，被试验者的数量；点，离群样本。肿瘤包括脑胶质瘤，结直肠息肉和结直肠肿瘤。CRC :结直肠肿瘤；A :星形胶质瘤-M :间变星形胶质瘤；GBM :胶质母细胞瘤； Polyp :结直肠息肉。图2.使用IGFBP-2-Abs建立的ROC曲线用于辨别正常对照与肿瘤、胶质瘤及各期、结直肠肿瘤及各级别的结直肠肿瘤。肿瘤包括脑胶质瘤，结直肠息肉和结直肠肿瘤。图3.血清IGFBP-2浓度比较正常对照组与胶质瘤病人组㈧，结直肠息肉病人及结直肠肿瘤病人(B)。血清IGFBP-2的中值和四分位数的范围见箱线图。N，被试者的数量；点，离群样本。图4.散点图和ROC曲线显示联合检测血清IGFBP-2和IGFBP_2_Abs辨别正常对照组和肿瘤病人(A)，正常对照组和胶质瘤病人(B)，及正常对照组和结直肠肿瘤病人(C) 时的诊断价值。肿瘤病人包括胶质瘤，结直肠息肉和结直肠肿瘤病人。图5.血清稀释度与450nm时的OD值之间的关系。间接ELISA检测一例 IGFBP-2-Abs阳性的高级别息肉病人血清的IGFBP-2-Abs浓度。图6.星形胶质瘤和高级别息肉组织的IGFBP-2表达免疫组化代表性结果(左) 和免疫组化结果汇总(右)。A-C，星形脑胶质瘤；D-F，高级别息肉。阳性细胞被染成棕色。 放大倍数星形细胞瘤200倍，息肉100倍。实例表示IGFBP-2不表达(A，D)，低表达(B， E)和高表达(C，F)。
具体实施例方式以下对本发明进行详细说明。本发明人发现，IGFBP-2的过表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，在高级别肿瘤中， IGFBP-2的浓度显著高于低级别肿瘤和正常对照组，即IGFBP-2的表达随着肿瘤的进展而升高，因此，IGFBP-2可用作中晚期肿瘤的诊断标志物；但与之相反，发明人意外地发现，在早期肿瘤患者的体液特别是血清、血液、血浆中，IGFBP-2-Abs浓度显著高于晚期肿瘤患者， 即IGFBP-2-Abs随着肿瘤从早期(包括癌变前息肉，特别是高级别息肉和多发增生性息肉) 到晚期进展呈下降的趋势，因此，IGFBP-2-Abs能够作为早中期肿瘤、特别是早期肿瘤诊断的标志物。由此对IGFBP-2-Abs和IGFBP-2进行联合检测，能有效诊断各期肿瘤，监测肿瘤发展的各个阶段。具体而言，如果检测的结果中IGFBP-2浓度显著高于预设阈值，且IGFBP_2_Abs 呈阴性，则往往预示着中晚期肿瘤；如果IGFBP-2的检测值与预设阈值相当或略高， 且IGFBP-2-Abs呈阳性，则往往预示着早期肿瘤；如果IGFBP-2显著高于预设阈值，且 IGFBP-2-Abs呈阳性，则往往预示着中期肿瘤。阴性、阳性以及检测值的高低可以基于预设阈值而确定，预设阈值可以利用取正常对照的平均值，也可以由本领域技术人员基于具体肿瘤根据具体要求进行设定，通常而言，预设阈值越高，检测的敏感性越低，而检测的特异性越高。基于上述原理，形成了本发明。本发明的一个目的在于提供一种诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤的方法,所述方法包括检测取自受试对象的样品中的IGFBP-2-Abs。本发明的另一个目的在于提供一种诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展的方法，所述包括检测取自受试对象的样品中的IGFBP-2-Abs和IGFBP-2。本发明的另一个目的在于提供一种监测肿瘤的复发的方法，所述方法包括检测取自受试对象的样品中的IGFBP-2-Abs和IGFBP-2。本发明的另一个目的在于提供基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。本发明的另一个目的在于提供基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。本发明的又一目的在于提供IGFBP-2自身抗体的检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的闻级别腺瘤。本发明的还一个目的在于提供IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤从低级别向高级别的进展。定义“检测”的含义包括定量检测和定性检测。定性检测的实例包括仅仅测定IGFBP-2 自身抗体和/或IGFBP-2是否存在，测定确定IGFBP-2自身抗体和/或IGFBP-2是否大于基线水平，以及测定比较测试样品与另一个样品(例如，对照样品)中IGFBP-2自身抗体和 /或IGFBP-2的水平。定量检测的实例包括测定IGFBP-2自身抗体和/或IGFBP-2的浓度和/或水平。“测试样品”取自生物体例如哺乳动物，进一步优选取自于人。测试样品的实例包括血液、血浆、血清、组织液、细胞间液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、淋巴液和唾液，优选包括血液、血清、组织液、血浆和淋巴液，还更优选包括血液、血清和血浆组成的组，最优选为血清。“肿瘤”包括原发性癌和转移性癌。举例而言，本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒能够诊断的肿瘤包括，但不限于结直肠肿瘤、胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、 胃癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、子宫内膜癌、胆道癌、肾癌、尿道癌、颈癌、甲状腺癌、脑癌、口癌、子宫癌、腹癌、舌癌、肛门癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、黑素瘤和肉瘤。这些肿瘤， 可以在其发展的各个期间，包括第一阶段和第二阶段被诊断出来。本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒可以区分患有肿瘤、患有良性瘤和未患肿瘤的个体。“高级别腺瘤”为肠镜组织学检查结果显示病变组织带有绒毛状成分、大于或等于 I厘米或高级别上皮内瘤变(dysplasia)。本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒中对IGFBP-2-Abs的检测特别适用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，尤其是胶质瘤或结直肠肿瘤。举例而言，本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒特别适用于诊断鉴别星形胶质细胞瘤(即，胶质瘤II级)和/或间变星形细胞瘤(即胶质瘤III级)，或者高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I级、II级。 IGFBP-2-Abs与IGFBP-2联合检测更能用于诊断不同级别的肿瘤(包括癌前息肉，特别是具有癌变风险的高级别息肉和多发增生性息肉)，监测肿瘤从低级别向高级别的进展。“ IGFBP-2自身抗体”或“ IGFBP_2_Abs”是指肿瘤或肿瘤受试对象中产生的针对胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)的抗体，该自身抗体选自由抗IGFBP-2的IgG自身抗体、抗IGFBP-2的IgA自身抗体、抗IGFBP-2的IgM自身抗体、抗IGFBP-2的IgD自身抗体和抗IGFBP-2的IgE自身抗体组成的组，优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体和抗IGFBP-2 的IgM自身抗体，最优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体检测方法和所用试剂对于本发明的第一试剂组和第二试剂组没有特别限制，只要第一试剂组能够检测样品中胰岛素样生长因子结合蛋白-2自身抗体、第二试剂组能够检测样品中IGFBP-2即可。优选的是，所述第一试剂组包括使用通过常规间接ELISA法或短肽标签捕获ELISA法测定IGFBP-2自身抗体的试剂，所述第二试剂组包括通过直接ELISA法测定IGFBP-2的试剂。以下举例而言分别对检测IGFBP-2自身抗体和IGFBP-2的方法进行描述，但所列举的方法仅是说明目的，并不意味着检测方法和试剂受这些实例的限制。检测IGFBP-2自身抗体的方法检测IGFBP-2自身抗体的方法不受特别限制，只要其能够检测IGFBP-2自身抗体即可。这些方法是本领域已知的，其中优选使用间接ELISA法和短肽标签捕获ELISA法。间接ELISA 法间接ELISA法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体。当使用间接ELISA法时，第一试剂组可以包括IGFBP-2蛋白(包括重组IGFBP-2蛋白)、用于建立标准曲线的IGFBP-2抗体(如人IgG及其它Ig抗体)、酶标记的抗IGFBP-2 抗体(通常为酶标记的抗人IgG抗体或酶标记的抗其它Ig抗体)以及所述酶的底物。更具体而言，酶标记的抗IGFBP-2抗体可以为羊抗人IgG-辣根过氧化物酶，酶底物可以为四甲基联苯胺(TMB)。短肽标签捕获ELISA法当使用短肽标签捕获ELISA法时，第一试剂组可以包括带有各种短肽标记的重组 IGFBP-2蛋白(如his-IGFBP-2蛋白)、用于建立标准曲线的IGFBP-2抗体(如人IgG及其它Ig抗体)、抗各种短肽抗体(如抗his标签的抗体)、酶标记的抗IGFBP-2抗体(通常为酶标记的抗人IgG抗体或酶标记的抗其它Ig蛋白抗体)以及所述酶的底物。间接免疫荧光法免疫突光技术是将突光素如异硫氰酸突光素(FITC)、四乙基罗丹明(rhodamine, RIB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate, TRITC)等与相应抗体(或抗原)以化学的方法结合，将荧光标记抗体(或抗原)与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已知的抗体(或抗原)即可推知另一个未知抗原(或抗体) 的存在。在检测本发明的IGFBP-2自身抗体时，通常使用间接免疫荧光法(IIF)，其原理是以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗体的存在。第一试剂组可以包括IGFBP-2蛋白(包括重组 IGFBP-2蛋白)和荧光素标记的抗球蛋白抗体(通常为荧光素标记的抗人IgG抗体或荧光素标记的抗其它Ig蛋白抗体)。检测IGFBP-2的方法检测IGFBP-2的方法不受特别限制，只要其能够检测IGFBP-2自身抗体即可。这些方法是本领域已知的，其中优选使用直接ELISA法。直接ELISA 法当使用直接ELISA法时测定IGFBP-2时，第二试剂组包括未标记和/或酶标记的抗IGFBP-2抗体、IGFBP-2蛋白或重组IGFBP-2蛋白及所述酶的底物。直接免疫荧光法(DIF)直接免疫荧光法是利用荧光素如异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原。当使用直接免疫荧光法时，第二试剂组包括荧光素标记的IGFBP-2抗体(如人IgG 及其它Ig抗体)。斑点杂交法(Dotblot assay)将稀释的血清点在硝酸纤维膜上，用抗体和膜上的抗原杂交，分析斑点的亮度用 ChemiDocXRS图像系统(Bio-Rad),根据标准曲线计算抗原浓度。有益效果本发明中对IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤(例如星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤)及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，对IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2 的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤(即，胶质瘤II级)、间变星形细胞瘤(即胶质瘤III级)和 /或胶质母细胞瘤(即，胶质瘤IV级)，以及结直肠肿瘤I-IV级。实施例以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这些实施例限制。本发明实施例的概述如下。研究病人和研究方法使用脑胶质瘤和结直肠肿瘤为研究模型。检测了 260个肿瘤病人(145个胶质瘤病人，45个结直肠息肉病人和70个结直肠肿瘤病人)的血清IGFBP-2 和IGFBP-2自身抗体浓度。使用ROC曲线来评估诊断能力。研究结果与正常对照组的血清IGFBP-2-Abs浓度(均值llng/ml，中值0ng/ ml，范围0-212ng/ml)相比，血清IGFBP-2自身抗体浓度(IGFBP-2-Abs)在肿瘤中显著升高(均值82ng/ml,中值:17ng/ml，范围0-1387ng/ml) (P < O. 0001)，而且在早癌患者血清中其浓度更高，与血清IGFBP-2的浓度相反。IGFBP-2-Abs能够有效地区分正常对照与病理分级II和III级胶质瘤患者[AUC :0. 821-0. 864 ;95%置信区间(Cl) = O. 762-0， 936 ；P < O. 0001]，而且还能将正常对照与临床分期I和II期结直肠肿瘤有效地分开(AUC O. 668 ；95% Cl = O. 566-0. 770 ；P = O. 002)，同时还能预示有患结直肠肿瘤高风险的高级别结直肠息肉(AUC :0. 72 ；95% Cl = O. 630-0. 811 ；P < O. 0001)。诊断病理分级 II 和 III 级胶质瘤的敏感度达到66% -84%，特异度达到81%。IGFBP-2和IGFBP-2-Abs联合检测分别提高了诊断各级别肿瘤(AUC :0. 823)，脑胶质瘤(AUC :0. 800)和结直肠肿瘤(AUC
0.917)诊断效率。结论我们的研究结果首次证实了 IGFBP-2-Abs可以用于早癌的检测，且其与血清IGFBP-2联合检测能够提高肿瘤的诊断率。下面对该实施例进行详细描述。材料与方法患者资料与样本前瞻性收集401例血液样本。所有患者和正常对照者的血样收取均通过医院伦理委员会的批准、患者和正常者签署知情同意书。胶质瘤患者血清和肿瘤组织样本来源于 2008-2010年北京天坛医院收治的患者，共计145例。根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)脑胶质瘤分级标准，收集II级星形细胞瘤(Astrocytomas, As) 78 例、III级间变星形细胞瘤(Anaplastic astrocytomas, AAs) 37例和IV级胶质母细胞瘤 (Glioblastomas, GBMs) 30例。健康人对照(141例)、结直肠息肉(45例9例多发增生性息肉、7例非高级别腺瘤和29例高级别腺瘤)和结直肠癌血清样本(70例38例I-II期结直肠癌，32例III-IV期结直肠癌)取自北京世纪坛医院2009-2010年收治的患者。为避免入组时选择性的偏见，凡是未有患癌历史的健康人和新诊断的原发脑胶质瘤、结直肠息肉和结直肠癌患者均可纳入研究对象。抽取餐前的正常人和餐前、手术前或肠镜检查前的患者血液样本，3，OOOrpm离心 10分钟，上层血清分装并保存在_70°C冰箱直到使用。高级别腺瘤定义为肠镜组织学检查结果显示病变组织带有绒毛状成分、大于或等于I厘米或高级别上皮内瘤变(Dysplasia)。63例星形细胞瘤组织和32例高级别息肉(23例高级别腺瘤和9例多发增生性息肉)分别来源于手术和肠镜检的病变组织，随后对组织标本进行福尔马林固定、石蜡包埋及免疫组化分析。间接ELISA法测定血清中抗IGFBP-2的IgG自身抗体血清中抗IGFBP-2的IgG自身抗体用间接ELISA法检测。实验主要流程是用50mM 碳酸缓冲液(Sigma-Aldrich Corp.，St. Louis, MO)稀释的 I. 0ug/ml 重组人 IGFBP-2 蛋白(R&D Systems Inc. , Minneapolis, MN)包埋具有超高效结合表面的immulon 4HBX免疫微量滴定板(Dynex Technologies, Inc. , Chantilly, VA),空白对照组用碳酸缓冲液包埋， 每孔50ul。滴定板的最后两列加入做一系列稀释的人IgG抗体(浓度25，100，250，500，
1,000ng/ml) (Invitrogen Ltd. ,Paisley,UK)用于建立标准曲线。根据不同的人IgG抗体的浓度(25ng/ml-l，000ng/ml)，计算出该检测方法对应的的变异系数为0. 0998-0. 012。用磷酸盐缓冲液(PBS)中制备的5%牛血清白蛋白液(BSA)封板，每孔加入50ul， 室温下封闭2小时。随后用用PBS稀释的0. 1%吐温-20清洗4次，然后向每孔加入50ul 用1% BSA/PBS稀释的血清((1/10稀释)，轻轻振荡后室温温育2小时。清洗4次后，
9每孔加入50ul稀释度为I 30，000的羊抗人IgG-辣根过氧化物酶(HRP) (Invitrogen Ltd.，Paisley, UK)室温温育I小时。清洗4次后，每孔加入IOOul四甲基邻苯胺(TMB) (Invitrogen Ltd.，Paisley, UK)显色，在波长 640nm 下读数。当 250ng/ml 标准品的 O. D 读数达到O. 35时，向每孔加入IOOulIN盐酸(HCl)终止反应，立刻在波长为450nm处读数。 血清O. D值的计算方法为重组人IGFBP-2蛋白包埋孔的O. D值减去用碳酸盐缓冲液包埋孔的O. D值。根据标准曲线计算血清中IGFBP-2自身抗体的浓度。每份样品重复两孔，样本重复检测两次。可溶性的IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体可能在血清中形成复合物，有可能影响 IGFBP-2自身抗体的检测。但是发生的可能性很小，因为抗体在可溶性和固定化抗原都存在的情况下，与固定化抗原形成更加稳定的复合物，尤其是在血清稀释后。为排除可溶性的 IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体在血清中形成复合物的可能性，我们用一例间接ELISA法测得的IGFBP-2自身抗体阳性的息肉患者的血清做稀释度实验。将血清进行一系列浓度的稀释 (1/10，1/50，1/100，1/200)，检测O. D值，结果显示稀释度和O. D值之间有负相关的线性关系(参见图5)，表明血清中存在的IGFBP-2蛋白对IGFBP-2自身抗体的检测没有影响。根据稀释度实验的结果，间接ELISA法检测IGFBP-2自身抗体的敏感度可达2ng/ml。直接ELISA法测定血清IGFBP-2血清IGFBP-2用商业化的抗IGFBP-2多克隆抗体预包被的IGFBP-2ELISA板检测(RapidBio Lab, Calabasas, CA，USA)，实验方法参见公司说明，同我们以前报道(22)。 IGFBP-2标准品的浓度分别为0，2. 5，10，25，50，and 100ng/ml，用来构建标准曲线。该实验方法检测的灵敏度可达2. 5ng/ml。待检血清40倍稀释，每份样品重复两孔，样本重复检测两次。IGFBP-2均值用于统计分析。免疫组化分析IGFBP-2免疫组化的实验方法同我们以前报道(22)。肿瘤组织切片用IGFBP-2单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)免疫组化染色。选取5个深染区域确定IGFBP-2表达阳性细胞率。O代表没有阳性细胞，+代表阳性细胞率< 30%，++代表阳性细胞率31-60%，+++代表阳性细胞率> 60%。统计分析统计分析使用SPSS 13. O软件完成。正常人和患者数据用方差检验的分析方法。健康对照和患者的IGFBP-2自身抗体和血清IGFBP-2蛋白水平的差异用标准非参数 Mann-Whitney U检验。血清IGFBP-2抗体水平和临床参数(如年龄、性别、肿瘤级别等) 的相关性采用单变量线性回归分析。单或多变量Cox regression分析和Kaplan-Meier plotting分析IGFBP-2抗体和抗原与预后的相关性。ROC曲线分析用来确定血清IGFBP-2 抗体和抗原单独诊断肿瘤和预测预后的特异性和敏感性，曲线下方的面积(AUC值)用卡方检验分析。随后的multi-sensor神经网络分析及ROC分析用来评估血清IGFBP-2抗体和抗原联合诊断肿瘤和预测预后的特异性和敏感性。血清IGFBP-2抗体水平与肿瘤组织 IGFBP-2表达水平和与免疫因子血清水平的相关性采用Pearson相关性分析。P值小于0. 05 认为具有统计学意义。结果肿瘤患者血清IGFBP-2-Abs浓度升高，且早期高于晚期
各实验组的基本信息汇总于表I.由于入组策略的原因，不同实验组在性别和年龄的分布存在差异。但是，通过回归分析我们发现性别和年龄的分布差异并不明显地影响不同实验组血清IGFBP-2-Abs浓度(见表I)，说明不同实验组间血清IGFBP-2-Abs浓度差异不是由性别和年龄的差异引起。表I
权利要求
1.基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
2.基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
3.如权利要求I或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述IGFBP-2自身抗体选自由抗IGFBP-2的IgG自身抗体、抗IGFBP-2的IgA自身抗体、抗IGFBP-2的IgM自身抗体、抗IGFBP-2的IgD自身抗体和抗IGFBP-2的IgE自身抗体组成的组，优选为抗IGFBP-2 的IgG自身抗体和抗IGFBP-2的IgM自身抗体，最优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体。
4.如权利要求I或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一试剂组包括使用通过常规间接ELISA法或短肽标签捕获ELISA法测定IGFBP-2自身抗体的试剂；所述第二试剂组包括通过直接ELISA法测定IGFBP-2的试剂。
5.如权利要求I或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤为胶质瘤或结直肠肿瘤。
6.如权利要求I所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述早期肿瘤为星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤，或者为结直肠肿瘤I-II级，所述高级别腺瘤为高级别结直肠息肉。
7.如权利要求2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤为星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤；或者结直肠肿瘤I-IV级。
8.如权利要求I或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述样品选自由血液、血浆、血清、组织液、细胞间液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、淋巴液和唾液组成的组，优选选自由血液、血清、血浆、组织液和淋巴液组成的组,还更优选选自由血液、血清和血浆组成的组，最优选为血清。
9.IGFBP-2自身抗体的检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
10.IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用， 所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
全文摘要
本发明提供了基于IGFBP-2自身抗体或其与IGFBP-2的联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，或者包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，以及IGFBP-2自身抗体的检测或其与IGFBP-2的联合检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明中IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤，和结直肠肿瘤I-IV级。
文档编号G01N33/574GK102590511SQ201210032939
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者宋韦, 李雨晨 申请人:北京市肿瘤防治研究所