检测抗-tnf药物和自身抗体的试验的制作方法

专利名称：检测抗-tnf药物和自身抗体的试验的制作方法
检测抗-TNF药物和自身抗体的试验相关申请的交叉引用本申请要求2009年10月26日递交的美国临时申请号61/255，048，2009年11月19日递交的美国临时申请号61/262，877，2010年4月15日递交的美国临时申请号61/324，635，2010年5月17日递交的美国临时申请号61/345，567，2010年6月3日递交的美国临时申请号61/351，269，2010年10月4日递交的美国 临时申请号61/389，672和2010年10月15日递交的美国临时专利申请号61/393，581的优先权，其内容通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术：
自身免疫疾病是重要和广泛传播的医学难题。例如，类风湿关节炎(RA)是一种影响到200万以上美国人的自身免疫疾病。RA引起关节慢性炎症且通常为进行性疾病，可能导致关节破坏和功能残疾。类风湿关节炎的病因未知，但该病的病因学涉及遗传倾向、传染因子和环境因素。活跃性RA的症状包括疲劳、缺乏食欲、低烧、肌肉关节疼痛和僵硬。还有在该病突发过程中，由于滑膜炎症，关节经常红肿、疼痛和触痛。此外，由于RA是全身性疾病，炎症可能影响关节以外的机体器官和区域，包括眼睛和口腔的腺体、肺衬膜、心包膜和血管。处理RA和其他自身免疫疾病的传统疗法包括采用作用快速的“第一线药物”和作用较慢的“第二线药物”。第一线药物能减轻疼痛和炎症。这类第一线药物的示例包括可口服给药或直接注射入组织和关节的阿斯匹林、萘普生、布洛芬、依托度酸和其他非类固醇消炎药(NSAID)，以及皮质激素。第二线药物能促进疾病缓解，防止关节进行性破坏，也称为改良疾病抗类风湿药物或DMARD。第二线药物的示例包括金、氢化氯奎、柳氮磺吡啶，和免疫抑制剂，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和环孢霉素。然而，这些药物中的许多有有害的副作用。因此，已在寻找对类风湿关节炎和其他自身免疫失调的其他疗法。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是由许多细胞类型包括单核细胞和巨噬细胞所产生的一种细胞因子，起初是根据它能诱导某些小鼠肿瘤坏死而鉴定。后来，与恶病质有关的称为恶液质的因子显示与TNF-a相同。TNF-a在病理生理学上涉及到多种其他人类疾病和失调，包括休克、败血症、感染、自身免疫病、RA、克罗恩病、移植物排斥和移植物抗宿主病。由于人TNF-a (hTNF- a )在多种人类失调中起有害作用，已设计了治疗策略来抑制或对抗hTNF-a的活性。具体说，已寻找到能抑制和中和hTNF-a活性的抗体，作为抑制hTNF- a的工具。一些最早的这类抗体是用hTNF-a免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤所分泌的小鼠单克隆抗体(mAb)(参见Moeller等人的美国专利号5，231，024)。虽然这些小鼠抗-hTNF-a抗体常常显示对hTNF-a有高亲和力能中和hTNF-a的活性，但小鼠抗体给予人所产生的相关问题，如血清半衰期短、不能触发人类某些效应器的功能和在人体中引发产生抗小鼠抗体的不良免疫应答(“人抗-小鼠抗体”(HAMA)反应)限制了其体内应用。近年来，已采用生物学疗法来治疗自身免疫疾失调如类风湿关节炎。例如，四种TNF- a抑制剂嵌合性抗-TNF- a mAb REMICADE (英夫利昔单抗)，TNFR-IgFc融合蛋白ENBREL (依那西普)，人抗-TNF a mAb HUMIRA (阿达木单抗)和PEG化(PEGylated)的Fab片段一CMZIA (赛妥珠单抗)已经FDA批准用于治疗类风湿关节炎。CMZIA 也用于治疗中等至严重的克罗恩病(CD)。虽然已证明这些生物治疗剂能成功地治疗类风湿关节炎和其他自身免疫疾病如CD，但不是所有的治疗对象对这种治疗有反应或反应良好。而且，给予TNF- α抑制剂可能会诱导对该药物的免疫应答，导致产生自身抗体，如人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。这类HACA、HAHA或HAMA免疫应答可能与免疫治疗TNF-α抑制剂的超敏反应和药代动力学显著改变和生物扰乱相关，阻碍了用该类药物作进一步治疗。因此，本领域需要检测患者样品中存在抗-TNF-α生物制剂和/或其自身抗体的试验，以监视TNF-α抑制剂的治疗效果和指导治疗决策。本发明满足了这种需求并提供相关的效益。发明概述已证明TNF-α涉及炎症疾病，自身免疫疾病，病毒、细菌和寄生虫感染，恶性肿瘤和/或神经变性疾病，它是采用特异性生物学方法治疗疾病，如类风湿关节炎和克罗恩病的有用靶标。TNF-α抑制剂，如抗-TNFa抗体是一类重要的治疗剂。因此，需要检测存在 抗-TNF α生物制剂和/或及自身抗体的试验方法。因此，在一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物的存在或水平的方法，包括(a)使标记TNF α与含有或怀疑含有抗-TNF α药物的样品接触，形成含抗-TNF α药物的标记复合物(即免疫复合物或偶联物)，(其中标记TNF α和抗-TNF α药物彼此不共价结合)；(b)标记复合物进行分子大小排阻层析以(如从游离的标记TNFa中)分离标记的复合物；和(C)检测标记的复合物，从而检测抗-TNFa药物的存在或水平。在某些情况下，所述方法可用于检测例如接受抗-TNF α药物治疗对象的样品中REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)和CMZIA (赛妥珠单抗)的水平。在另一实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水平的方法，包括(a)使标记抗-TNF α药物与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触，形成含自身抗体的标记复合物(即免疫复合物或偶联物)，(其中标记抗-TNFa药物与自身抗体彼此不共价结合)；(b)标记复合物进行分子大小排阻层析以(如从游离的标记TNF α药物中)分离标记的复合物；和(C)检测标记的复合物，从而检测自身抗体的存在或水平。在某些情况下，所述方法可用于检测例如接受抗-TNF α药物治疗对象样品中的自身抗体水平，包括但不限于人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。在另一实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水平的方法，包括(a)使标记抗-TNF α药物和标记TNF α与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFa药物、标记TNFa与自身抗体之间形成第一标记复合物(即免疫复合物或偶联物)；(其中第一标记复合物的组分彼此不共价结合)和在标记抗-TNF α药物与自身抗体之间形成第二标记复合物(即免疫复合物或偶联物)，(其中第二标记复合物的组分彼此不共价结合)，其中标记抗-TNF α药物和标记TNF α所含的标记不相同；(b)第一标记复合物和第二标记复合物进行分子大小排阻层析，以分离第一标记复合物与第二标记复合物(例如彼此分离，和与游离的标记TNF α和游离的标记抗-TNF a药物分离);和(C)检测第一标记复合物和第二标记复合物，从而当第一标记复合物和第二标记复合物都存在时，检测非中和形式自身抗体(即不干扰抗-TNFa药物与TNFa之间结合的自身抗体)的存在或水平；当只存在第二标记复合物时，检测中和形式自身抗体(即干扰 抗-TNF α药物与TNF α之间结合的自身抗体)的存在或水平。在某些情况下，所述方法可用于检测接受抗-TNF α药物治疗对象样品中的自身抗体水平，包括但不限于人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。在一个相关实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水平的方法，包括(a)使标记抗-TNF α药物与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFa药物与自身抗体之间形成第一标记复合物(即免疫复合物或偶联物)(其中标记抗-TNFa药物与自身抗体彼此不共价结合)；(b)第一标记复合物进行分子大小排阻层析，以(如从游离的标记抗-TNFa药物中)分离第一标记复合物；(C)检测第一标记复合物，从而检测存在的自身抗体或其水平；(d)使标记TNF α与第一标记复合物接触，在标记TNF α药物与标记TNF α之间形成第二标记复合物(即免疫复合物或偶联物)(其中标记抗-TNF α药物与标记TNF α彼此不共价结合)，其中标记TNF α药物与标记TNFa所含的标记不相同；(e)第二标记复合物进行第二分子大小排阻层析，以(如从游离的标记TNF α中)分离第二标记复合物；和(f)检测第二标记复合物，从而检测中和形式的自身抗体(即干扰抗-TNF α药物与TNF- α之间结合的自身抗体)的存在或水平。在某些情况下，所述方法可用于检测接受抗-TNF α药物治疗对象样品中的自身抗体的水平，包括但不限于人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供确定抗-TNF α药物有效量的方法，所述方法包括(a)测量对象第一样品中的抗-TNF α药物水平，包括(i)使第一样品接触一定量的标记TNF α，形成含标记TNF α与抗-TNF α药物的第一复合物；和(ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而测量抗-TNF α药物的水平；
(b)测量所述对象第二样品中抗-TNF α药物自身抗体的水平，包括⑴使第二样品接触一定量的标记抗-TNF α药物，形成含标记抗-TNF α药物与自身抗体的第二复合物；和(ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平；和(c)从步骤(a)测得的抗-TNFa药物水平减去步骤(b)测得的自身抗体水平，从而测得抗-TNF α药物的有效量。在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化抗-TNF α药物治疗剂量的方法,所述方法包括(a)按照本发明方法测定抗-TNF α药物的有效量；(b)比较抗-TNF α药物的有效量与抗-TNF α药物的水平；和(c)根据步骤(b)的比较，确定抗-TNF α药物的后续剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化抗-TNF α药物治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括(a)测定所述对象第一样品中的抗-TNFa药物水平；(b)测定所述对象第二样品中抗-TNF α药物自身抗体的水平；和(c)根据抗-TNFa药物和自身抗体水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化抗-TNF α药物的治疗和/或减轻其毒性。在另一个实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFa药物的样品中抗-TNFa药物的存在或水平的方法，所述方法包括 (a)使一定量的标记TNF α和一定量的标记内部对照接触样品，形成标记TNF α与抗-TNFa药物的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测标记TNF α和标记内部对照；(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记TNF α峰曲线下面积的积分；(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；(e)用标记TNFa的量除以标记内部对照的量确定第一比率；(f)用步骤(c)测得的积分除以步骤(d)测得的积分确定第二比率；和(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而参比内部对照确定抗-TNF α药物的存在或水平在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化抗-TNF α药物治疗剂量的方法，所述方法包括根据上面章节步骤(e)的标记TNF α与标记内部对照比率和上面章节步骤(f)的标记TNFa与标记内部对照比率的比较，确定所述对象抗-TNF α药物的后续剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。在某些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水平的方法，所述方法包括(a)使一定量的标记抗-TNF α药物和一定量的标记内部对照与样品接触,形成标记抗-TNF α药物与自身抗体的复合物；
(b)用分子大小排阻层析检测标记抗-TNF α和标记内部对照；(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图计算标记抗-TNFa药物峰曲线下面积的积分；(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；(e)将标记抗-TNFa药物含量除以标记内部对照含量，测得第一比率；和(f)除以步骤(C)和⑷所得的积分，测得第二比率；和(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而参比内部对照确定自身抗体的存在或水平。在另一个实施方式中，本发明提供测定样品中抗-TNFa药物的存在或水平，和 抗-TNF α药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，该试剂盒包括(a)含一定量的标记TNFa的第一检测底物；(b)含一定量的标记抗-TNF α的第二检测底物；(c)任选的第三检测底物，其含一定量的标记TNFa和一定量的标记内部对照；(d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNF α药物α和一定量的标记内部对照；(e)任选的提取对象样品的工具；和(f)任选的使用该试剂盒的说明书小册。本领域技术人员通过阅读以下详述和


将会明白本发明的其他目的、特征和优点。附图简要说明图I.显示本发明试验的示例实施方式，其中采用分子大小排阻HPLC来检测TNF a -Alexa647 与 HUMIRA 之间的结合。图2.显示HUMIRA 与TNF a -Alexa647结合的剂量响应曲线图3.显示目前检测HACA水平的基于ELISA的方法，称为桥连试验。图4.本发明检测产生的抗REMICADE 的HACA/HAHA自身抗体试验的示例概要图解说明。图5.显示结合REMICADE -Alexa647的抗-人IgG抗体的剂量响应分析。图6.显示结合REMICADE -Alexa647的抗-人IgG抗体的第二剂量响应分析。图7.显示结合REMICADE -Alexa647的抗-人IgG抗体的剂量响应曲线。图8.显示正常人血清和HACA阳性血清中形成的REMICADE -Alexa647免疫复合物。图9.提供用本发明的桥连试验或迁移改变试验(mobility shift assay),检测20位患者血清样品HACA的概况。图10.提供用目前检测HACA血清浓度的方法与本发明新颖HACA试验方法的概况和比较。图11.显示荧光(Fl)标记的IFX与正常(NHS)或HACA-阳性血清孵育的SE-HPLC图。在孵育的混合液中加入递增量的HACA-阳性血清导致IFX-Fl峰以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置Cl和C2。图12.显示用迁移改变试验测定的，随着HACA-阳性血清的稀释度增加所产生的结合和游离的IFX-Fl的剂量响应曲线。(A)稀释度递增的HACA-阳性血清与37. 5ng的IFX-Fl 一起孵育。SE-HPLC分析发现，稀释度越高(HACA越低)，游离的IFX-Fl越多。(B)稀释度递增的HACA-阳性血清与37. 5ng的IFX-Fl —起孵育。SE-HPLC分析发现稀释度越高(HACA越低)，HACA所结合的IFX-Fl越少。图13.显示TNF a -Fl与正常(NHS)或掺入IFX的血清一起孵育的SE-HPLC图。在孵育混合液中加入递增量的IFX的血清导致荧光TNF α峰以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置。图14.显示用迁移改变试验测定的，随着掺入IFX的血清的稀释度增加所产生的结合和游离的TNFa的剂量响应曲线。将递增浓度的IFX加到孵育混合液中降低了游离的TNFa的百分比同时提高了结合的TNFa的百分比。
图15.显示在不同时间点以迁移改变试验测定的，用IFX治疗的IBD患者血清的相对HACA水平和IFX浓度。图16.显示患者的处理-在不同时间点检测用IFX治疗的IBD患者血清的HACA水平和IFX浓度。图17.显示本发明检测⑷非中和抗体或⑶中和抗体，如HACA的存在的试验的示例实施方式。图18.显示本发明检测中和性自身抗体如HACA的存在的试验的一种替代实施方式。图19.显示在存在不同含量抗人-IgG时Fl-标记的ADL与正常人血清(NHS) —起孵育后的迁移改变图。在孵育混合液中加入递增量的抗-人IgG，导致游离的Fl-ADL峰(FA)以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置Cl和C2，而内部对照(IC)位置不变。图20.显示抗-人IgG对游离Fl-ADL的迁移的剂量响应曲线。取递增量的抗-人IgG与37. 5ng的Fl-ADL和内部对照一起孵育。反应混合液中加入的该抗体越多，游离的FI-ADL与内部对照的比例越低。图21.显示在存在不同含量ADL时，Fl-标记TNF-α与正常人血清(NHS) —起孵育后的迁移改变图。Ex = 494nm ；Em = 519nm。在孵育混合液中加入递增量的ADL，导致游离的TNF-Fl峰(Fl)以剂量依赖方式转移到更高分子量的洗脱位置，而内部对照(IC)峰位置不变。图22.显示ADL对游离的TNF-a-Fl迁移的剂量响应曲线。递增量的ADL与IOOng的TNF- a -Fl和内部对照一起孵育。反应混合液中加入的抗体ADL越多，游离的TNF- a -Fl与内部对照的比例越低。图23.显示Fl标记的Remicade (IFX)与正常(NHS)或HACA阳性患者混合血清孵育后的迁移改变分布。图24.显示Fl标记的HUMIRA(ADL)与正常(NHS)或小鼠抗-人IgG抗体孵育后的迁移改变分布。图25.显示Fl标记的HUMIRA (ADL)与正常(NHS)或HACA阳性患者混合血清孵育后的迁移改变概况。发明详述I.引言
本发明部分根据以下发现采用分子大小排阻层析的同质迁移改变试验特别有利于检测TNF α抑制剂以及针对它们所产生的自身抗体(如HACA、HAHA等)的存在或水平。具体说，本发明提供不需要任何洗涤步骤的“混和与读取”试验。因此，易于彼此区分复杂的与不复杂的蛋白质疗法。此外，采用本发明的试验可最大程度减少游离药物的任何可能的干扰。相反，检测HACA或HAHA水平的经典ELISA要到机体清除TNFa抑制剂后才能进行，这可能要花费多达3个月时间。而且，除了抗-TNFa抗体，本发明一般还可用于各种蛋白质治疗药物。本发明的试验还具有其他优点，因为不需要使抗原吸附到固体表面上从而可消除无关IgG的非特异性结合，可检测亲和力弱的抗体，和显示灵敏度和特异性高于目前可用的检测方法，如酶免疫试验。检测抗-TNF α生物药物以及其他免疫治疗药物血清浓度的重要性可从以下事实得到证明FDA要求在临床试验期间进行药代动力学和药物耐受性(如免疫应答)研究。还发现本发明可用于监测接受这些药物治疗的患者以确保他们得到正确的剂量，这种正确剂量使药物不会被机体清除太快，患者不会产生针对该药物的免疫应答。此外，本发明可用于 指导由于先前药物失效而在不同的药物之间的切换。II.定义本文所用的以下术语具有它们本身的含义，除非另有说明。本文所用的术语“抗-TNF α药物”或“TNF α抑制剂”旨在包括通过例如抑制TNF a与其细胞表面受体相互作用、抑制TNFa蛋白的产生、抑制TNFa基因的表达、抑制细胞分泌TNF α、抑制TNF α受体的信号传导、或可导致对象TNF α活性降低的任何其他手段能直接或间接抑制TNFa活性的试剂、包括蛋白质、抗体、抗体片段、融合蛋白(如Ig融合蛋白或Fe融合蛋白)、多价结合蛋白(如DVDIg)、小分子TNF α拮抗剂和其相似的天然或非天然产生的分子和/或重组和/或工程改造形式。术语“抗-TNF α药物”或“TNF α抑制剂”优选包括能干扰TNF α活性的制剂。TNFa抑制剂的例子包括依那西普(ENBREL ，安进公司(Amgen))、英夫利昔单抗(REMICADE ,强生公司(Johnson and Johnson))、人抗-TNF α单克隆抗体-阿达木单抗(D2E7/HUMIRA ,雅培公司(Abbott Laboratories))、赛妥珠单抗(CMZIA ,UCB公司)、CDP 571(克隆泰克(Celltech)公司)和CDP 870 (克隆泰克公司)以及能抑制TNF α活性的其他化合物，从而当给予患有或有风险患有TNF α活性受损的失调(如RA)的对象时能治疗该失调。本文术语“预计对TNFa抑制剂的治疗有反应”意指评估用TNF α抑制剂治疗对象可能有效或可能无效的可能性(如向对象提供可衡量的药效)。具体说，通常是在治疗开始后观察到对象出现治疗有效的指标(如有可衡量药效的指标)时方能评估治疗可能有效或无效。特别优选的TNF α抑制剂是已得到FDA批准用于治疗TNF α介导的人类疾病或失调，如类风湿关节炎或炎性肠病(IBD)的生物制剂，这类制剂包括阿达木单抗(HUMIRA )、英夫利昔单抗(REMICADE )、依那西普(ENBREL )和赛妥珠单抗(CIMZIA ，UCB公司)。术语“分子大小排阻层析”(SEC)意思包括依据分子的大小和/或流体动力学体积分离溶液中的分子的层析方法。可将其应用于大分子或高分子复合物，如蛋白质及其偶联物。通常采用水溶液来转运样品使之通过层析柱，这种技术也称为凝胶过滤层析。术语“复合物”，“免疫复合物”，“偶联物”和“免疫偶联物”包括但不限于TNF a结合(如通过非共价键)于抗-TNF α药物，抗-TNF α药物结合(如通过非共价键)于抗-TNFa药物的自身抗体，和抗-TNF α药物结合(如通过非共价键)于TNF α和抗-TNF a药物的自身抗体二者。本文所用术语“标记的”所修饰的物质包括与经验上可检测的另一种分子或化学物偶联的任何物质、分子、蛋白质、酶、抗体、抗体片段、细胞因子或相关物质。适合用作标记来标记物质的化学物包括但不限于突光染料，如Alexa Fluor 染料、Alexa Fluor 647染料、量子斑点、发光染料、发冷光染料和放射性核素，如1251。术语“有效量”包括能在需要的对象中达到治疗效果的药物剂量，以及物质的生物可利用量。术语“生物可利用的”包括给药剂量中有治疗活性的组分(分数)。例如，用于治疗病理生理学上涉及TNFa的疾病和失调，包括但不限于休克、败血症、感染、自身免疫病、RA、克罗恩病、移植物排斥和移植物抗宿主疾病的药物有效量，可以是能防止或减轻一种或多种该疾病相关症状的用量。短语“曲线下面积”是数学术语，用于描述两维图像中一部分的积分。例如，在作为 些峰的积分，包括y轴最小值，如两维图像的基线围绕的面积和两维图像本身围绕的面积积分。同样也可用计算公式曲线下面积=/ abf(x)dx来描述峰的积分，f(x)是两维图像的函数，变量“a”和“b”表示X-轴峰积分的界线。短语“荧光标记的检测”包括检测荧光标记物的工具。该检测工具包括但不限于分光光度计、荧光光度计、光度计，经常与层析仪合用的检测工具，例如但不限于分子大小排阻高效液相层析仪，例如但不限于Agilent-1200HPLC系统。括弧“[]”表示参见该括弧内的物质浓度。短语“最优化的治疗”包括最优化剂量(如有效用量或水平)和/或特定治疗类型的效果。例如，最优化抗-TNFa药物的剂量，包括增加或减少后续给予对象的抗-TNFa药物的用量。在某些情况下，最优化抗-TNF α药物的类型包括改变给予的抗-TNF α药物，从一种药物换成不同的药物(如不同的抗-TNFa药物)。在某些其他情况下，最优化治疗包括同时给予一种剂量的抗-TNF α药物(如增加、减少的剂量或与原先剂量相同的剂量)联用免疫抑制药物。术语“同时给药”包括给予一种以上的活性制剂，从而一种活性制剂发挥生理效应的持续时间与第二种活性制剂发挥生理效应的时间相重叠。术语“对象”、“患者”或“个体”通常指人，但是也指其他动物，例如包括其他灵长动物、哨齿动物、狗、猫、马、羊、猪等。术语“治疗方案”包括采用能减轻或预防TNFa介导疾病或失调的相关一种或多种症状的治疗方法。该术语包括给予任何化合物、药物、程序和/或治疗方案，用于改善患TNF α介导疾病或失调个体的健康,包括本文所述的任何治疗剂。本领域技术人员懂得,可根据抗-TNF α药物和/或抗-TNF α药物自身抗体的存在和浓度水平，改变疗程或目前疗程的剂量。术语“免疫抑制药物”或“免疫抑制剂”包括能产生免疫抑制作用的任何物质，例如通过照射或给予这类药物，如抗代谢药、抗淋巴血清、抗生素等可防止或减轻免疫应答反应。合适的免疫抑制药物包括但不限于硫代嘌呤药物，如硫唑嘌呤(AZA)及其代谢产物；抗代谢药物，如氨甲喋呤(MTX)、西罗莫司(雷怕霉素)、坦西莫司、依维莫司、他克莫司(FK-506)、FK-778 ;抗-淋巴细胞抗体球蛋白、抗-胸腺细胞抗体球蛋白、抗-⑶3抗体、抗CD4抗体和抗体-毒素偶联物、环孢霉素、霉酚酸酯、咪唑立宾一磷酸酯、蒿属香豆素、乙酸格拉默及其代谢产物、药学上可接受的盐、衍生物、前药和组合。术语“硫代嘌呤药物”包括硫唑嘌呤(AZA)、6_巯基嘌呤(6-MP)和其有治疗作用的任何代谢产物，包括但不限于6_巯基鸟嘌呤(6-TG)、6-甲基巯嘌呤苷、6-硫代肌苷核苷酸(如6-硫代肌苷一磷酸盐、6-硫代肌苷二磷酸盐、6-t硫代肌苷三磷酸盐)、6_硫代鸟嘌呤核苷酸(如6-硫代鸟苷一磷酸盐、6-硫代鸟 苷二磷酸盐、6-硫代鸟苷三磷酸盐)、6_硫代黄苷核苷酸(如6-硫代黄苷一磷酸盐、6-硫代黄苷夺磷酸盐、6-硫代黄苷三磷酸盐)、其衍生物、同类物和组合。术语“样品”包括获自个体的生物学标本。适合本发明所用的样品包括但不限于全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、泪水、任何其他体液、组织样品(如活检)和其细胞提取物(如血液红细胞提取物)。在一优选实施方式中，所述样品是血清样品。本领域技术人员懂得，可在分析前稀释样品，如血清样品。在某些情况下，术语“样品”包括但不限于血液、机体组织、血液的血清、淋巴液、淋巴结组织、脾组织、骨髓，或用这些组织的一种或多种衍生的富含免疫球蛋白的组分。在某些其他情况下，术语“样品”包括血液的血清，或从血液血清或血液衍生的富含免疫球蛋白的组分。在某些情况下，术语“样品”包括体液。III.实施方式的描述本发明方法的各步骤不需要以它们提出的特定顺序实施。本领域普通技术人员懂得本发明方法步骤的其他顺序包括在本发明的范围内。在一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物的存在或水平的方法，包括(a)使标记TNF α与含有或怀疑含有抗-TNF α药物的样品接触，与抗-TNF α药物形成标记的复合物；(b)使标记的复合物通过分子大小排阻层析以分离所述标记复合物；和(C)检测所述标记复合物，从而检测抗-TNFa药物。在某些情况下，所述方法尤其可用于以下的抗-TNFa抗体REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)和CIMZIA (赛妥珠单抗)。肿瘤坏死因子a (TNFa)是一种参与全身炎症的细胞因子，是能激发急性反应的一组细胞因子中的一个成员。在免疫细胞调控中TNFa起着重要作用。TNFa也能诱导细胞凋亡，从而诱导炎症和抑制肿瘤发生及病毒复制。TNFa制剂主要是长212个氨基酸的II型跨膜蛋白，为稳定的同质三聚体。本文所用的术语“TNFa ”意指包括以17kDa分泌蛋白形式和26kDa膜结合形式存在的一种人细胞因子，其生物学活性形式是17kDa分子的非共价结合三聚体。TNFa结构的进一步描述可参见，例如Jones等人(1989)，Nature，338 :225-228。术语TNF α的意思包括人TNFa、重组的人TNFa (rhTNF a )或与人TNFa蛋白至少有约80%相同。人TNF a由35个氨基酸的胞浆结构域、21个氨基酸的跨膜区段和177个氨基酸的胞外结构域(ECD)组成(Pennica, D等(1984)Nature 312 :724)。在ECD内，人TNFa与恒河猴的氨基酸序列有97 %相同，与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠TNF α的氨基酸序列有71 % -92 %相同。可用标准的重组表达方法制备或购买其商品(R&D系统(R&DSystems)公司，产品分类号210-TA，明尼苏达州明尼阿波利斯)。在某些实施方式中，“TNFa ”是一种“抗原”，是能被抗-TNF α抗体结合的一种分子或该分子的一部分。TNF-α可含有一个或一个以上的表位。在某些情况下，TNFa以高选择性方式与抗TNFa抗体反应。优选的能结合本发明抗-TNF α抗体、片段和区域的抗原包含SEQ ID NO :1中的至少5个氨基酸。在某些情况下，TNFa的长度足够包含TNF α的一个表位，从而能结合抗-TNF α抗体、其片段和区域。在某些实施方式中，含有结合抗-TNF α抗体、其片段和区域的长度足够的表位的TNFa 长度至少为 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、I10、I15、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220个氨基酸。在一种些实施方式中，所用的TNFa包含SEQ ID NO :1的77-233 残基。在某些情况下，至少标记TNF α可溶性部分，即SEQ ID NO 1的残基77_233中的一个氨基酸。在某些情况下，采用胺反应活性荧光团衍生物。在大多数情况下，此胺反应活性基团是一种酰化试剂，与胺反应时能形成羧酰胺、磺酰胺或硫脲。事实上所有蛋白质都含有赖氨酸残基，大多数的N-末端含有游离胺基，因此可用作标记物的结合位点。在一优选实施方式中，标记残基77，所用的TNFa包含SEQ ID NO : I的77-233残基。在另一个实施方式中，标记许多伯胺基从而多重标记TNF α。在某些情况下，不标记TNF α的某一部分，即被抗体、其片段和区域识别的那部分。换言之，TNF α抗原的某些部分可提供为抗-TNF α抗体所识别的和/或与抗-TNF α抗体、其片段和可变区结合的拓扑结构(topographical)表位或三维表位。优选这些部分游离而用于结合，因此不被标记。其包含SEQ ID NO 1的136-157和164-185残基Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-IIe ;和Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-GIu-Thr-Pro-Glu-Gly.可利用各种可检测的基团标记抗-TNFa药物。TNFa或抗-TNF α药物优选用荧光团或荧光染料标记。适合用于本发明的示例荧光团包括通过引用纳入本文作参考的“分子探针目录(Molecular Probes Catalogue) ”中所列的那些(参见R. Haugland的“焚光探针和标记技术指南手册(The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies) ”，第 10 版，分子探针(Molecular probes)公司(2005))。此类示例的焚光团包括但不限于Alexa 焚光染料，如 Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、AlexaFluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor ⑧ 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、AlexaFluor CD 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750 和 / 或 Alexa Fluor 790，以及其他荧光团，例如丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺)荧光素(5-IAF)、5-异硫氰酸荧光素 (FITC)、四甲基罗丹明5-(和6_)异硫氰酸盐(TRITC)、6_丙烯酰-2-二甲基氨基萘(丙烯酉先丹(acrylodan))、7_硝基苯基-2-恶_1，3，-重氣-4-基氧化物(NBD-Cl)、漠化乙徒、焚光黄、5-羧基罗丹明6G氢氯化物、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、德克萨斯红酰氯、B0DIPY 、萘甲叉胺磺酸酯(例如I-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、6-(对-二磺基甲苯基)萘-2-磺酸(TNS)等等)、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光黄-磷酯酰乙醇胺、德克萨斯红磷酯酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷酯酰胆碱，芴基-磷酯酸胆喊、部花青540、I-(3-讽丙基)_4_[ β-[2 [(二 -正-丁基氨基)-6萘基]乙烯基]批唳甜菜碱(萘基苯乙烯基)、3，3’ 二丙基硫代羰花青(dipropylthiadicarbocyanine) (二S-C3-(5))、4_(对-二戍基氨基苯乙烯基)-1_甲基卩比唳(二-5-ASP)、氰基-3-碘乙酰胺、氰基-5-正-羟基琥珀酰亚胺、氰基-7-异硫氰酸盐、罗丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗兰、Al酞菁、恶嗪I，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、Τ0Τ0、吖啶橙、乙啡啶同质二聚体、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉铵(MQAE)、呋喃-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素、晕苯、金属-配体复合物、IRDye 700DX、IRDye 700、IRDye 800RS、IRDye 800CW、IRDye 800、Cy5、Cy5. 5、Cy7、DY676、DY680、DY682、DY780和其混合物。其他合适的荧光团包括酶-辅因子、镧系元素、绿荧光蛋白、黄荧光蛋白、红荧光蛋白，或其突变体和衍生物。在本发明一实施方式中，这种特异性结合对的第二成员含有附着其上的可检测基团。 荧光团中的荧光基团通常选自所述染料目录，包括聚甲炔、酞菁、花青、夹氧杂蒽、芴、罗丹明、香豆素、荧光黄和B0DIPY 。在一个实施方式中，所述荧光基团是近红外(NIR)荧光团，发射光的范围约650-约900nm。在生物学试验中采用近红外荧光技术有益，因为它可基本上消除或减少生物物质自身荧光产生的背景。近红外荧光技术的另一优点是激发光源产生的散射光极大地减少，因为散射光的强度与波长四次方的倒数成正比。背景荧光低和散射光低可导致提高信嗓比，这是高灵敏度检测所需。而且，在生物组织中近-IR区^50nm-900nm)内的光透明窗口产生的NIR荧光，为体内成像和亚细胞检测应用(需要光透射穿过生物体组分)提供了有价值的技术。在该实施方式的诸方面中，荧光基团宜选自IRDye 700DX、IRDye 700、IRDye 800RS、IRDye 800CW、IRDye 800、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor (g) 790、Cy5、Cy5. 5、Cy7、DY676、DY680、DY682和DY780。在某些实施方式中，此种近红外基团是IRDye 800CW、IRDye 800、IRDye ⑧ 700DX、IRDye 700 或 DynomicDY676。可利用荧光团的化学反应衍生物进行荧光素的标记。常用的化学反应基团包括胺反应的异硫氰酸衍生物，如FITC和TRITC (荧光黄和罗丹明的衍生物)；胺反应的琥珀酰亚胺酯，如NHS-荧光素；和巯基反应的马来酰亚胺活化的荧光素，如荧光黄-5-马来酰亚胺，它们中的许多可商品化购得。使这些反应染料的任何一种与TNF α或抗-TNF α药物反应，可导致在荧光团与TNFa之间或荧光团与抗-TNFa药物之间形成稳定的共价键。在某些情况下，进行荧光标记反应后，常常需要去除标记靶分子物质中未反应的荧光团。这通常采用分子大小排阻层析，利用荧光团与标记的蛋白质之间分子大小不同而实现。可从许多来源购得反应荧光染料。其可用不同反应基团获得以将各种功能基团附着于靶分子。也能在标记试剂盒中得到它们，试剂盒包括进行标记反应的所有组分。在一优选方面，采用英杰(Invitrogen)公司的Alexa Fluor 647 C2马来酰亚胺(目录号A-20347)。
可直接或间接检测抗-TNF α抗体与TNF α，或抗-药物抗体(ADA)与抗-TNF α抗体的免疫学特异性结合。直接标记物包括荧光素或冷光标签、金属、染料、放射性核素等，使之附着抗体。在某些情况下，用碘-125 (125I)标记TNFa或抗-TNF α抗体可用于分别检测样品中的抗-TNFa抗体或ADA的浓度水平。在其他情况下，采用对样品中的抗-TNF α抗体或ADA分别具有特异性的化学发光TNF α试验或抗-TNF α抗体的化学发光试验，适合于灵敏地无放射活性地检测抗-TNF α抗体或ADA的浓度水平。在特定情况下，用荧光染料标记TNF α或抗-TNF α抗体也适合分别检测样品中的抗-TNF α抗体或ADA的浓度水平。荧光染料的示例包括但不限于=Alexa Fluor 染料、DAPI、荧光黄、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。可商品化购得连接有荧光染料的第二抗体，例如山羊F(ab’)2抗-人IgG-FITC可购自Tago免疫公司(Burlingame,CA)。间接标记物包括本领域熟知的各种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。例如，可采用辣根过氧化物酶检测系统与生色底物四甲基联苯胺(TMB)，在存在过氧化氢时，以450nm检测产生的可溶性产物。例如，可采用碱性磷酸酶检测系统与产色底物对-硝基苯磷酸盐，产生405nm处容易检测的可溶性产物。类似地，可 采用β -半乳糖苷酶检测系统与其产色底物邻-硝基苯基-β -D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)，产生410nm检测的可溶性产物。可采用脲酶检测系统与其底物，如尿素-溴甲酚紫(西格玛(Sigma)免疫化学公司；St. Louis,MO)。连接酶的有用第二抗体可获自一些商品化来源，如购自杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)(宾夕法尼亚州西格鲁甫)的山羊F (ab，) 2抗-人IgG-碱性磷酸酶ο可分析直接或间接标记物产生的信息，例如用分光光度计检测产色底物产生的颜色，用幅射计数仪检测幅射光，如用Y计数器检测125I;或在存在某些波长光时用荧光计检测荧光。对于酶联抗体的检测，可用分光光度计，如EMAX微孔板读数仪(加利福尼亚州门洛帕克的分子装置公司(Molecular Devices))按照厂商说明书进行抗-TNF α抗体含量或ADA水平的定量分析。如果需要，可使本发明的试验自动化或用机器人进行，而可同时检测多个样品产生的信号。在某些实施方式中，采用分子大小排阻层析。SEC的原理是大小不同的颗粒将以不同速率通过静止相洗脱(过滤)。导致溶液中的颗粒依据其大小而分离。条件是，同时或近乎同时加载所有的颗粒，同样大小的颗粒在一起洗脱。每种分子大小排阻层析柱都有其可分离的分子量范围。排阻界限的定义是此范围的上端分子量，如果分子太大则不能被静止相捕获入其中。渗透界限的定义是此分离范围的下端分子量，如果分子足够小则可全部渗透入静止相的孔中，低于此(下端)分子量的所有分子都很小，它们以一条带洗脱。在某些方面，收集恒定体积的洗脱液或组分。颗粒的大小越相似，它们越可能在同一洗脱组分中而不能分别检测。优选以光谱学技术检测收集的组分，以测定洗脱颗粒的浓度。本发明可用的光谱检测技术通常包括但不限于荧光比色法、折射率(RI)和紫外线辐射(UV)法。在某些情况下，洗脱体积的减少大约与分子流体力学体积的对数线性相关(即较重部分先洗脱)。在某些方面，采用所述方法检测抗-TNF α药物，例如抗体的含量，包括REMICADE (英夫利昔单抗)、嵌合型抗-TNFa单抗、TNFR-IgFc融合蛋白ENBREL (依那西普)、人抗-TNF α单抗HUMIRA (阿达木单抗)和PEG化Fab片段CMZIA (赛妥珠单抗)。在某些情况下，检测到抗-TNFa药物(如抗-TNF α抗体)后，用标准曲线测量这种抗-TNFa药物。在另一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水平的方法，所述方法包括(a)使标记抗-TNF α药物与样品接触，与自身抗体形成标记的复合物；(b)所述标记复合物进行分子大小排阻层析以分离所述标记复合物；和(c)检测标记复合物的存在或水平，从而检测自身抗体。在某些情况下,所述自身抗体包括人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。在另一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水平的方法，包括(a)使标记抗-TNF α药物和标记TNF α与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFa药物，标记TNFa与自身抗体之间形成第一标记复合物，和在标记抗-TNFa药物与自身抗体之间形成第二标记复合物，其中标记抗-TNFa药物和标记TNFa所含的标记不相同；(b)第一标记复合物和第二标记复合物进行分子大小排阻层析以分离第一标记复合物与第二标记复合物；和(c)检测第一标记复合物和第二标记复合物，从而当存在第一标记复合物和第二标记复合物二者时检测非中和形式的自身抗体，和当只存在第二标记复合物时检测中和形式的自身抗体。在某些情况下，所述自身抗体包括人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗-TNF α药物抗体(HAMA)。在一相关的实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的方法，包括(a)使标记抗-TNF α药物与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触，在标记抗-TNFa药物与自身抗体之间形成第一标记复合物；(b)使第一标记复合物通过分子大小排阻层析柱，而分离第一标记复合物；(C)检测第一标记复合物，从而检测自身抗体的存在或水平；(d)使标记TNF α与第一标记复合物接触，形成标记抗-TNF α药物与标记TNF α之间的第二标记复合物，其中标记抗-TNFa药物和标记TNF α所含的标记不相同； (e)第二标记复合物进行第二分子大小排阻层析，从而分离第二标记复合物；和(f)检测第二标记复合物，从而检测存在的中和形式的自身抗体或其水平。在某些情况下，所述自身抗体包括人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和人抗-小鼠抗体(HAMA)。在其他实施方式中，本文所述的试验方法可用于预测患自身免疫疾病(如类风湿关节炎、克罗恩病等)对象对TNFa抑制剂，具体是对抗-TNF α抗体的应答反应。在此方法中，测定所述对象的抗-TNFa抗体正确剂量或治疗有效量，即治疗浓度水平，可预计该个体是否对这种治疗会有响应。在另一个实施方式中，本发明提供监测患自身免疫失调对象的自身免疫失调的方法。所述方法包括测试随时间推移所述对象的抗-TNFa抗体正确剂量或治疗有效量，即治疗浓度水平。以此方式，可预计在给定的时间内该个体是否对这种治疗会有响应。在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象，提供确定抗-TNF α药物有效量的方法，所述方法包括(a)测定对象第一样品中的抗-TNFa药物水平，包括(i)使第一样品接触一定量的标记TNF α，形成包含标记TNF α与抗-TNF α药物的第一复合物；和(ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而测量抗-TNFa药物的水平； (b)测定对象第二样品中的抗-TNFa药物自身抗体水平，包括(i)使第二样品接触一定量的标记抗-TNF α药物a，形成包含标记抗-TNF α药物与自身抗体的第二复合物；和(ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平；和(c)从步骤(a)测得的抗-TNFa药物水平减去步骤(b)测得的自身抗体水平，从而测得抗-TNF α药物的有效量。在一相关的实施方式中，本发明还提供步骤(a) (ii)中的检测，包括(I)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度率第一图像计算标记TNFa峰曲线下面积的积分；(2)从所述第一图像计算第一复合物峰曲线下面积的积分；(3)将步骤⑵得到的积分除以步骤⑴得到的积分测得比率；和(4)将标记TNF α含量乘步骤(3)的比率。在一相关的实施方式中，本发明还提供步骤(b) (ii)中的检测，包括(I)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度的第二图像计算标记抗-TNF α药物峰曲线下面积的积分；(2)从该第二图像计算第二复合物峰曲线下面积的积分；(3)将步骤⑵得到的积分除以步骤⑴得到的积分测得比率；和(4)将标记抗-TNF α药物含量乘步骤(3)的比率。在一相关的实施方式中，本发明提供的第一和第二样品都是血清样品。在另一相关的实施方式中，本发明提供的第一和第二样品都获自用抗-TNFa药物治疗期间的对象。在另一相关的实施方式中，本发明还提供步骤(a) (ii)和/或步骤(b) (ii)中的检测，包括荧光标记物的检测。在另一实施方式中，本发明为接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化抗-TNF α药物治疗剂量的方法,所述方法包括(a)按照本发明的方法测得抗-TNFa药物的有效量；(b)比较抗-TNF α药物的该有效量与抗-TNF α药物的水平；和(c)根据步骤(C)的比较，确定所述对象的后续抗-TNFa药物的剂量，从而最优化抗-TNFa药物的治疗剂量。在一相关的实施方式中，当抗-TNF α药物有效量低于抗-TNF α药物水平时，本发明还提供提闻抗-TNFa药物的后续剂量。在一相关的实施方式中，本发明提供提闻的后续抗-TNF α药物剂量，从而抗-TNF α药物的有效量约等于抗-TNF α药物的水平。在一些其他实施方式中，本发明还提供的抗-TNF α药物选自REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CMZIA (赛妥珠单抗)和其组
入
口 ο在某些实施方式中，抗-TNF α药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。在某些其他实施方式中，抗-TNFa药物是阿达木单抗(HUMIRA )。在其他实施方式中，抗-TNF α药物是依那西普(ENBREL )。在某些其他实施方式中，抗-TNFa药物是CMZIA .⑧(赛妥珠单抗)。在其他实施方式中，标记TNFa是荧光团标记TNFa。在一些其他实施方式中，定量 检测抗-TNFa药物。在某些实施方式中，定量检测TNF α。在其他实施方式中，先洗脱标记的复合物，然后是游离的标记抗-TNFa抗体。在某些实施方式中，分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)。在一些其他实施方式中，自身抗体选自人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)或其组合。在某些实施方式中，定量检测自身抗体。在另一实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化抗-TNF α药物的治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括(a)测定所述对象第一样品中的抗-TNFa药物水平；；(b)测定所述对象第二样品中的抗-TNF α药物自身抗体的水平；和(c)根据抗-TNFa药物和自身抗体的水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化抗-TNF α药物的治疗和/或减轻其毒性。在一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFa药物水平高和自身抗体水平低时，同时给予免疫抑制药物和抗-TNFa药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNF α药物水平中等和自身抗体水平低时，提高抗-TNF α药物的水平和同时给予免疫抑制药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNF α药物水平中等和自身抗体水平中等时，给予不同的抗-TNFa药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNF α药物水平低和自身抗体水平高时，给予不同的抗-TNF α药物。在另一相关的实施方式中，给予阿达木单抗(HUMIRA )代替英夫利昔单抗(REMICADE )。在一些实施方式中，短语“高水平抗-TNFa药物”包括药物水平约10_约100ng/10yL，约10-约70ng/10 μ L，或约10-约50ng/10 μ L。在其他实施方式中，短语“高水平抗-TNF α药物”包括药物水平高于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或lOOng/lOy L。在一些实施方式中，短语“中等水平抗-TNFa药物”包括药物水平约5. 0_约50ng/10 μ L、约 5. O-约 30ng/10 μ L、约 5. 0-约 20ng/10 μ L、或约 5. O-约 10ng/10 μ L。在其他实施方式中，短语“中等水平抗-TNFa药物”包括药物水平约10、9、8、7、6、5、4、3、2或lng/ΙΟμ L0在一些实施方式中，短语“低水平抗-TNFa药物”包括药物水平约0_约lOng/lOy I、约O-约8ng/10y I或约O-约5ng/10y I。在其他实施方式中，短语“低水平抗-TNFa 药物”包括药物水平低于约 10,9. 0,8. 0,7. 0,6. 0,5. 0,4. 0,3. 0,2. 0、1· O 或O.5ng/10μ I。
首字母缩写词“ADA”包括短语“抗-药物抗体”。在一些实施方式中，短语“高水平抗-TNFa抗体”包括抗-药物抗体的水平约3. O-约 100ng/10 μ L、约 3. O-约 50ng/10 μ L、约 10-约 100ng/10 μ L、约 10-约 50ng/10 μ L或约20-约50ng/10 μ L。在某些其他实施方式中，短语“高水平抗-药物抗体”包括抗_药物抗体的水平大于约 10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 lOOng/lOy I。在一些实施方式中，短语“中等水平抗-药物抗体”包括抗-药物抗体的水平约O. 5-约 20ng/10y I、约 O. 5-约 lOng/lOy I、约 2. O-约 20ng/10y I、约 2. O-约 lOng/lOy I、约 2. O-约 5. 0ng/10 μ I 或约 2. O-约 5. 0ng/10 μ I。在某些实施方式中，短语“低水平抗-药物抗体”包括抗-药物抗体水平约O. O-约5. Ong/lOy I、约 O. I-约 5. Ong/lOy I、约 O. O-约 2. Ong/lOy I、约 O. I-约 2. Ong/lOy I 或约O. 5-约2. 0ng/10 μ I。在其他实施方式中，短语“低水平抗-药物抗体”包括抗_药物抗体水平低于约 5. 0,4. 0,3. 0,2. 0、1· O 或 O. 5ng/10 μ I。
在一些实施方式中，本发明还提供检测抗-TNFa药物的试验方法，包括⑴使第一样品与一定量的标记TNF α接触，形成含有标记TNF α和抗-TNF α药物的第一复合物；和(ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而检测抗-TNF α药物的水平。在一些实施方式中，本发明还提供用检测自身抗体的试验方法，包括(i)使第二样品与一定量的标记抗-TNF α药物接触，形成含有标记抗_TNF α药物与自身抗体的第二复合物；和(ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平。在一相关实施方式中，本发明方法提供的抗-TNF α药物选自REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CMZIA (赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，本发明方法提供的抗-TNFa药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。在一些其他实施方式中，抗-TNFa药物是阿达木单抗(HUMIRA )。在一些其他实施方式中，抗-TNFa药物是依那西普(ENBREL )。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的抗-TNFa药物是CIMZIA (赛妥珠单抗)。在另一相关实施方式中，本发明提供定量检测抗-TNF α药物的方法。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的第一和第二样品是血清。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的第一和第二样品获自用抗-TNFa药物治疗期间的对象。在另一相关实施方式中，本发明方法提供的自身抗体选自人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)或其组合。在另一相关实施方式中，本发明提供定量检测自身抗体的方法。在某些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFa药物的样品中抗-TNF α药物的存在或水平的方法，所述方法包括(a)使一定量的标记TNF α和一定量的标记内部对照与样品接触,形成标记TNF α与抗-TNFa药物的复合物；(b)用分子大小排阻层析检测标记TNFa和标记内部对照；(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记TNFa峰曲线下面积的积分；(d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；(e)将标记TNF α含量除以标记内部对照含量测得第一比率；(f)将步骤(c)得到的积分除以步骤(d)得到的积分测得第二比率；和(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而通过参比内部对照确定抗-TNF α药物的存在或水平。在一相关实施方式中，本发明提供步骤(e)所测得的第一比率是约80 1-100 I。在另一相关实施方式中，本发明提供步骤(e)所测得的第一比率是约100 I。在一相关实施方式中，本发明提供的标记内部对照是生物胞素_Alexa488。在某些实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约I-约25ng/100yLo在某些其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa488)含量约 5-约 25ng/100 μ L、约 5-约 20ng/100 μ L、约 I-约 25ng/100 μ L、约 I-约20ng/100yL、约I-约10ng/100yL或约I-约5ng/100 μ L。在其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约为1、5、10、15、20或25ng/100 μ L。在某些实施方式中，本发明对接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化抗-TNFa药物治疗剂量的方法，所述方法包括根据按照本发明方法得到的第一比率与第二比率的比较，确定所述对象的后续抗-TNF α药物剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。在一相关实施方式中，本发明提供的方法还包括当第一比率约为100 I而第二比率低于约95 I时提高后续的抗-TNF α药物剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。在另一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNF α药物选自REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CIMZIA (赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFa药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNF α药物是阿达木单抗(HUMIRA )。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFa药物是CIMZIA (赛妥珠单抗)。在一相关实施方式中，本发明提供的抗-TNFa药物是CIMZIA (赛妥珠单抗)。在一相关实施方式中，本发明提供的标记TNF α是荧光标记TNF α。在一相关实施方式中，本发明还提供定量检测抗-TNF α药物。在一相关实施方式中，本发明提供的标记复合物先洗脱，然后是的是游离的标记TNF α。在一相关实施方式中，本发明提供的样品是血清。在一相关实施方式中，本发明提供的样品获自接受抗-TNFa药物治疗的对象。在一相关实施方式中，本发明提供的分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)。在一些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样品中抗-TNF α药物自身抗体的方法，所述方法包括(a)使一定量的标记抗-TNF α药物和一定量的标记内部对照与样品接触,形成标记抗-TNF α药物与自身抗体的复合物；(b)用分子大小排阻层析检测标记抗-TNF α药物和标记内部对照；(c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记的标记TNFa峰曲线下面积的积分；(d)多作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照峰曲线下面积的积分；(e)将标记抗-TNF α药物含量除以标记内部对照含量测得第一比率；、
(f)除以步骤(C)和步骤(d)得到的积分测得第二比率；和(g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而通过参比内部对照测得存在的自身抗体或其水平。在一相关实施方式中，步骤(e)测得的第一比率为约80 I—约100 I。在另一相关实施方式中，步骤(e)测得的第一比率为约100 I。在一相关实施方式中，标记内部对照是生物胞素-Alexa 488。在某些实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约50_200pg/100 μ L。在某些其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素-Alexa 488)含量约 100-约 200pg/100 μ L、约 150-约 200pg/100 μ L、约50-约150pg/100y L或约50-约lOOpg/lOOy L。在其他实施方式中，所分析样品中标记内部对照(如生物胞素的-Alexa 488)含量约为 50、75、100、125、150、175 或 200pg/100 μ L。在一相关实施方式中，抗-TNF α药物选自REMICADE (英夫利昔单抗)、 ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CIMZIA. (赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，抗-TNFa药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。在一相关实施方式中，抗-TNF α药物是阿达木单抗(HUMIRA )。在一相关实施方式中，抗-TNF α药物是依那西普(ENBREL )。在一相关实施方式中，抗-TNFa药物是CMZIA (赛妥珠单抗)。在一相关实施方式中，定量检测自身抗体。在一相关实施方式中，标记的复合物先洗脱，然后是游离的标记抗-TNF α抗体。在一相关实施方式中,样品是血清。在一相关实施方式中，样品获自接受抗-TNFa药物治疗的对象。在一相关实施方式中，分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)。在一相关实施方式中，自身抗体选自人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。在一相关实施方式中，定量检测自身抗体。在一相关实施方式中，本发明提供确定后续疗程的方法。该后续疗程包括当抗-TNFa药物水平高和自身抗体水平低时共同给予免疫抑制药物和抗-TNFa药物。在另一相关实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFa药物水平中等和自身抗体水平低时，提高抗-TNFa药物的水平和同时给予免疫抑制药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNF α药物水平中等和自身抗体水平中等时，给予不同的抗-TNFa药物。在另一相关的实施方式中，所述后续治疗方案包括当抗-TNFa药物水平低和自身抗体水平高时，给予不同的抗-TNFa药物。在另一相关的实施方式中，给予阿达木单抗(HUMIRA )代替英夫利昔单抗(REMICADE )。在某些实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物的存在或水平和存在 抗-TNF α药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，该试剂盒包括(a)含一定量的标记TNF α的第一检测底物；(b)含一定量的标记抗-TNF α药物的第二检测底物；(c)任选的第三检测底物，其含一定量的标记TNFa和一定量的标记内部对照；(d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNFa药物和一定量的标记内部对照；(e)任选包括用于提取对象样品的工具；和(f)任选包括如何使用该试剂盒的说明书小册子。在一相关实施方式中，所述基质包括能沉积本发明化学物质的任何材料，包括但不限于硝化纤维素、硅胶、薄层层析基质、木制小棍、纤维素、棉花、聚乙烯、其组合等等。在另一相关实施方式中，可将本发明所用的化学物质以有序的阵列、矩阵或矩阵阵列形式沉积在上述材料上。在一相关实施方式中，所述试剂盒还包括检测标记TNF α、标记抗-TNF α药物和/或标记内部对照的方法。在一相关实施方式中，该试剂盒还包括检测方法，包括但不限于荧光标记检测，UV-幅射光检测或放射性碘暴光。在一相关实施方式中，该试剂盒还包括分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)仪器。在一相关实施方式中，所述第一、第二、第三和第四检测底物选自硝化纤维素、硅胶和分子大小排阻层析的介质。在一相关实施方式中，抗-TNF α药物选自REMICADE (英夫利昔单抗)>ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CIMZIA (赛妥珠单抗)和其组合。在一相关实施方式中，标记TNFa是荧光标记TNFa。在一相关实施方式中，样品是血清。在一相关实施方式中，样品获自接受抗-TNFa药物治疗的对象。在一相关实施方式中，所述自身抗体选自人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。本发明有关物质的生理范围和水平 用REMICADE 治疗的患者中REMICADE 的治疗有效水平范围约为1-lOmgREMICADE /每kg患者体重。在一些实施方式中，REMICADE 的治疗有效水平范围约为3_8mgREMICADE /每kg患者体重。在一些实施方式中，REMICADE 的治疗有效水平范围约为5mgREMICADE /每kg患者体重。典型的REMICADE (英夫利昔单抗)剂量范围为约O. 05-约80 μ g/ml。在一些实施方式中，REMICADE 的剂量范围为约O. 05-约50 μ g/ml。在一些其他实施方式中，REMICADE 的剂量范围为约O. 05-约30 μ g/ml ο在一些实施方式中，REMICADE 的剂量约为30 μ g/ml。在一些其他实施方式中，REMICADE 的剂量约为50 μ g/ml。用HUMIRA 治疗的患者中HUMIRA 的治疗有效水平范围为约O. I-约IOmgHUMIRA /每kg患者体重。在一些实施方式中，HUMIRA 的治疗有效水平范围为约O. I-约8mg HUMIRA /每kg患者体重。在一些其他实施方式中，HUMIRA 的治疗有效水平范围约为Img HUMIRA /每kg患者体重。在一些实施方式中，HUMIRA 的治疗有效水平范围约为O. 8mg HUMIRA / 每 kg 患者体重。典型的HUMIRA 剂量范围为约O. 05-约150 μ g/ml。在某些实施方式中，HUMIRA 的剂量范围为约O. 05-约100 μ g/ml。在某些其他实施方式中，HUMIRA 的剂量为约O. 05-约50 μ g/ml。在某些实施方式中，HUMIRA 的剂量约为30 μ g/ml。在某些实施方式中，HUMIRA 的剂量约为32 μ g/ml。在某些其他实施方式中，HUMIRA 的剂量约为50 μ g/ml οV.示例疾病和用于治疗其的治疗抗体在某些实施方式中，本发明采用单克隆抗体治疗剂。表I提供了已获批准或目前正在开发中的治疗用单克隆抗体的示例名单。在2006年PhRMA的题目为“418Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolster the Arsenal AgainstDisease (允许测试以加强针对疾病的储备的418种生物技术药物)”的报告中披露了临床开发和已获批准的单克隆抗体产品的扩大名单。特别优选的治疗用抗体包括但不限于抗-TNFa单克隆抗体，例如(I)小鼠_人IgGl-κ轻链抗-TNFa单克隆抗体REMICADE (英夫利昔单抗)，(2)人TNF受体2与人IgGl的融合蛋白ENBREL (依那西普)和(3)完全的人IgGl-κ轻链抗-TNF α单克隆抗体HUMIRA (阿达木单抗)。构建的其他二种抗-TNF α抗体在关键的III期临床试验中对患同样疾病的一些患者显示出可靠性，这二种抗体是(4) PEG化的人源化抗-TNF α单克隆抗体Fab片段一CMZIA CD870(赛妥珠单抗)和(5)完全的人IgGl-κ轻链抗-TNF α单克隆抗体一CNTO 148(戈利木单抗(golimlunab))。治疗用的一类优选抗体是抗-TNFa单链单克隆抗体，可用于治疗许多自身免疫疾病，如类风湿关节炎、青少年特发性关节炎、强直性脊柱炎(白赫铁列夫症(Bechterew))、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、严重的银屑病、慢性眼葡萄膜炎、严重的结节病和韦格纳肉芽肿病。除了用于检测抗-TNF α抗体的生物利用度/浓度外，本发明也适合用于检测机体内所用的任何治疗抗体的生物利用度/浓度，例如为治疗和诊断目的。以下表I也提供了 与体内应用的各种治疗性单克隆抗体相关的医学指示症状(indication)名单。在其他实施方式中，本发明方法适合用于检测治疗性抗体的自身抗体的存在或浓度水平。因此，本发明的方法可用于最优化包括给予对象治疗性抗体的治疗(或诊断)。所述方法可用于最优化治疗(或诊断)一种或多种疾病或失调，包括以下疾病的一种或多种传染病，如呼吸道合胞病毒(RSV)、HIV、炭疽、念珠菌病、葡萄球菌感染、丙型肝炎。自身免疫疾病，如类风湿关节炎、克罗恩病、B-细胞非何杰金淋巴瘤、多发性硬化症、SLE、强直性脊柱炎、狼疮、银屑病关节炎、全身性红斑狼疮。炎性疾病，如类风湿关节炎(RA)、青少年特发性关节炎、强直性脊柱炎(白赫铁列夫症)、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、严重的银屑病、慢性眼葡萄膜炎、结节病、韦格纳肉芽肿病和其他炎性为主要特征的疾病。血液病，如败血病、败血病休克、突然发作的夜间血红蛋白尿和溶血性尿毒综合征。癌症，如结肠直肠癌、非何杰金氏淋巴瘤、慢性B-淋巴细胞白血病、可复原的大细胞淋巴瘤、头颈鳞状上皮细胞癌、治疗HER2-过表达的转移性乳腺癌、急性髓样白血病、前列腺癌(如腺癌)、小细胞肺癌、甲状腺癌、恶性黑色素瘤、实体瘤、乳腺癌、早期HER2-阳性乳腺癌、一线非鳞状上皮NSCLC癌、AML、毛细胞白血病、神经母细胞瘤、肾癌、脑癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨转移、SCLC，头颈癌、一线胰腺癌、SCLC、NSCLC、头颈癌、血癌和实体瘤、晚期实体瘤、胃肠癌、胰腺癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、非皮肤T-细胞淋巴瘤、CLL、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、表达间皮素的肿瘤、恶性胶质细胞瘤、转移性胰腺癌、血液恶性肿瘤、可复原的皮肤大细胞MAb淋巴瘤、AML、骨髓异常增生综合症。心血管疾病，如动脉粥样硬化急性心肌梗塞、心肺分流术、心绞痛。代谢疾病，如糖尿病、I型糖尿病。消化道疾病，如克罗恩病、艰难梭菌(C. difficile)病，溃疡性结肠炎。眼睛疾病，如葡萄膜炎。遗传疾病，如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)。
神经障碍性疾病，如骨关节炎疼痛和阿尔茨海默病。呼吸道疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、鼻息肉病、儿童哮喘病。皮肤病，如银屑病，包括慢性中等至严重的斑块状银屑病。移植物排斥，如急性肾移植排斥、逆转心肝移植物排斥、预防肾移植物排斥、预防急性肾移植物排斥、肾移植排斥。其他疾病，如阑尾炎诊断、肾炎、绝经后骨质疏松(骨失调)、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸性细胞食道炎和花生过敏症。在一个实施方式中,所述疾病选自上述特定疾病和失调的一种或多种。


表I
治疗和诊断用单克隆抗体 产品名称丨生产厂家适应症_
__传染病_
Synagis 帕利珠单米迪缪尼(MedImmune)公预防呼吸道合胞病毒(RSV)
^__I__
抗-HIV-1 MAb迫立芒科学(Polymun HIV感染的治疗
Scientific)公司，日内瓦，
__奥地利__
CCR5 MAb哈南基因组科学(Hunan HIV感染
GenomeSciences)公司
__马里兰州罗克维尔__
Cytolin 赛托单(CytoDyn)公司^ HIV感染
抗-CD8 MAb__新墨西哥州圣菲__
NMOlSRD制药公司HIV感染
_加州洛杉肌__
PRO 140普罗基尼(Progenies)制药公HIV感染
司
__纽约州塔利镇__
TNX355TanoxMAbHIV 感染,355TanoxMAb HIV 感染，
__临床二期__临床二期_
ABthrax 人类基因组科学(Human炭疽
拉巴库单抗GenomeSciences)公司
(raxibacumab)___
Anthim (ETI-204)爱鲁丝(Elusys)制药公司炭痕
(罕用药物)___
抗-hsp90 MAb耐特药物(NeuTec Pharma)念珠菌病
___
抗-葡萄球菌-MAb 米迪缪尼公司预防葡萄球菌感染_
Aurexis英贝泰克斯(Inhibitex)公预防和治疗金黄色葡萄球
特弗巴珠单抗司菌感染
(tefibazumab)___
巴维托星单抗__培格林(Peregrine)制药公丙型肝炎治疗_
_表I_
治疗和诊断用单克隆抗体 产品名称生产厂家适应症
(Bavituximab)_ 司
MDX-1303麦得莱克斯药物(Medarex炭疽
__PharmAthene )公司_
Numax 米迪缪尼公司RSV
莫他维珠单抗
(motavizumab)_
Tarvacin I音格林制药公司丙型肝炎
巴维托星单抗药学(Pharmaceuticals)公 (bavituximab)司
XTL 6865XTL生物医药公司'丙型肝炎—
自身免疫病
Humira 阿达木单|雅培实验公司|类风湿关节炎
U___
Remicade 森拓科(Centocor)公司克罗恩病、类风湿关节炎
英夫利昔单抗___
Rituxan 基因泰克(Genentech)公B-细胞非何杰金淋巴瘤、用
瑞替星单抗司B细胞单抗治疗后复发的患
Critiximab)__百集(Biogen Idec)公司者、类风湿关节炎_
Tysarbi 百集公司多发性硬化症
那他珠单抗
(natalizumab )___
ART 874培公司多发性硬化症
Actemra__罗氏(Roche)公司__类风湿关节炎_
AME 527应用分子~( Applied类风湿关节炎
__Molecular)公司__
AMG 108一安进公司^类风湿关节炎
AMG 714—安进公司类风湿关节炎
抗-CD16 MAb巨基因(MacroGenics)公免疫性血小板减少症
___
CNTO 1275森拓科公司多发性硬化症
__宾夕法尼亚州霍舍姆__
达克珠单抗PDL生物制药公司秦发性硬化症(也见用于呼
(daclizumab)加州弗里蒙特吸道疾病)
(抗-CD25MAb) 百集公司
__马萨诸塞州剑桥__
^~I 安进公司多发性硬化症(denosumah)__加州千橡__
权利要求
1.一种测定接受抗-TNFa药物治疗的对象中所述抗-TNF a药物有效量的方法， 所述方法包括 (a)測量所述对象第一样品中的所述抗-TNFa药物的水平，包括 (i)使所述第一样品接触一定量的标记TNFa，形成含所述标记的TNFa与所述抗-TNF a药物的第一复合物；和 ( )用分子大小排阻层析检测所述第一复合物，从而检测所述抗-TNF a药物的所述水平； (b)測定所述对象第二样品中所述抗-TNFa药物的自身抗体的水平，包括 (i)使第二样品接触一定量的标记抗-TNF a药物,形成含所述标记抗-TNF a药物与所述自身抗体的第二复合物；和 ( )用分子大小排阻层析检测所述第二复合物，从而检测所述自身抗体的所述水平；和 (C)从步骤(a)测得的所述抗-TNFa药物水平中减去步骤(b)测得的所述自身抗体水平，从而确定所述抗-TNF α药物的有效量。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)(ii)的检测包括 (1)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号強度第一图像计算所述标记的TNFa峰曲线下面积的积分； (2)从所述第一图像计算所述第一复合物峰曲线下面积的积分； (3)将步骤(2)得到的积分除以步骤(I)得到的积分确定比率；和 (4)用所述标记的TNFa的所述量乘步骤(3)的所述比率。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)(ii)的检测包括 (1)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号強度的第二图像计算所述标记抗-TNF a药物峰曲线下面积的积分； (2)从所述第二图像计算所述第二复合物峰曲线下面积的积分； (3)将步骤(2)得到的积分除以步骤(I)得到的积分确定比率；和 (4)用所述标记抗-TNFa药物的所述量乘步骤(3)的所述比率。
4.如权利要求1-3任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均是血清样品。
5.如权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在干，步骤(a)(ii)和/或步骤(b)(ii)的所述检测包括突光标记检测。
6.一种最优化接受抗-TNF α药物治疗的对象中抗-TNFa药物治疗剂量的方法，所述方法包括 (a)按照权利要求1-5任何一项所述的方法測定所述抗-TNFa药物的有效量； (b)比较所述抗-TNFa药物的该有效量与所述抗-TNFα药物的水平；和 (C)根据步骤(b)的比较，确定所述对象的所述抗-TNF α药物的后续剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括 (d)当所述抗-TNF α药物的有效量低于所述抗-TNFa药物所述水平时，提高所述抗-TNF α药物的后续剂量。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，提高所述抗-TNFa药物的后续剂量，使所述抗-TNFa药物的有效量约等于所述抗-TNF α药物的所述水平。
9.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在干，所述抗-TNFα药物选自下组REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)和CMZIA _ (赛妥珠单抗)和其组合。
10.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(RHMICADE )。
11.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRA )。
12.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBREL )。
13.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa药物是CIMZIA .⑧(赛妥珠单抗)。
14.如权利要求1-13任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记的-TNFα是荧光标记的TNFa。
15.如权利要求1-14任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的抗-TNFα药物是定量的。
16.如权利要求1-15任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一复合物先被洗脱，然后是游离的标记TNF α。
17.如权利要求1-16任何一项所述的方法，其特征在于，所述第二复合物先被洗脱，然后是游离的标记抗-TNF α药物。
18.如权利要求1-17任何一项所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC).
19.如权利要求1-18任何一项所述的方法，其特征在干，所述自身抗体选自下组人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
20.如权利要求1-19任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的自身抗体是定量的。
21.如权利要求1-20任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均获自用所述抗-TNF α药物治疗期间的所述对象。
22.—种在接受抗-TNF α药物治疗的对象中最优化所述抗-TNF α药物的治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括 (a)測定所述对象第一样品中的所述抗-TNFa药物水平； (b)測定所述对象第二样品中的所述抗-TNFa药物的自身抗体的水平；和 (C)根据所述抗-TNFa药物和所述自身抗体的水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化所述抗-TNFa药物的治疗和/或减轻其毒性。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFa药物的所述水平高和所述自身抗体的所述水平低时，所述后续疗程包括共同给予免疫抑制药物和抗-TNFa药物。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFa药物的所述水平中等和所述自身抗体的所述水平低时，所述后续疗程包括提高所述抗-TNFa药物的水平和同时给予免疫抑制药物。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFa药物的所述水平中等和所述自身抗体的所述水平中等时，所述后续疗程包括给予不同的抗-TNFa药物。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，当所述抗-TNFa药物的所述水平低和所述自身抗体的所述水平高时，所述后续疗程包括给予不同的抗-TNFa药物。
27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，给予阿达木单抗(HUMIRA )代替英夫利昔单抗(REMICADE )。
28.如权利要求22-27任何一项所述的方法，其特征在干，采用以下试验测量所述抗-TNF α药物,所述试验包括 (i)使所述第一样品与一定量的标记TNFa接触，形成含有所述标记TNFa和所述抗-TNF α药物的第一复合物；和 ( )用分子大小排阻层析检测所述第一复合物，从而测量所述抗-TNFa药物的所述水平。
29.如权利要求22-28任何一项所述的方法，其特征在于，采用以下试验测量所述自身抗体，所述试验包括 (i)使所述第二样品与一定量的标记抗-TNFa药物接触，形成含有所述标记抗-TNFa药物与所述自身抗体的第二复合物；和 ( )用分子大小排阻层析检测所述第二复合物，从而测量所述自身抗体的水平。
30.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自下组REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CMZIA. (赛妥珠单抗)和其组合。
31.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。
32.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRA )。
33.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBREL )。
34.如权利要求22-29任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa药物是CIMZIA (R)(赛妥珠单抗)。
35.如权利要求22-34任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的抗-TNFα药物是定量的。
36.如权利要求22-35任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的自身抗体是定量的。
37.如权利要求22-36任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均是血清样品。
38.如权利要求22-37任何一项所述的方法，其特征在于，所述第一和第二样品均获自用所述抗-TNF α药物治疗期间的所述对象。
39.如权利要求22-38任何一项所述的方法，其特征在于，所述自身抗体选自下组人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
40.如权利要求23或24所述的方法，其特征在干，所述免疫抑制药物选自下组氨甲喋呤、硫唑嘌呤，其代谢产物和其组合。
41.一种參比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFa药物的样品中所述抗-TNF α药物的存在或水平的方法，所述方法包括 (a)使一定量的标记TNFa和一定量的标记内部对照接触所述样品，形成所述标记TNFa与所述抗-TNF α药物的复合物； (b)用分子大小排阻层析检测所述标记TNFα和所述标记内部对照； (C)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记TNFa峰曲线下面积的积分； (d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记内部对照峰曲线下面积的积分； (e)用所述标记TNFa的量除以所述标记内部対照的量，测得第一比率； (f)用步骤(C)测得的积分除以步骤(d)测得的积分，测得第二比率；和 (g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而參比内部对照确定所述抗-TNF α药物的存在或水平。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约80-约100。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约100.
44.如权利要求41-43任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记内部对照是生物胞素-Alexa 488。
45.如权利要求41-44任何一项所述的方法，其特征在于，分析样品中所述标记内部对照为姆100 μ L约I-约25ng。
46.ー种在接受抗-TNFa药物治疗的对象中最优化所述抗-TNF α药物治疗剂量的方法，所述方法包括 根据权利要求41-44任何一项所述方法测得的所述第一比率与第二比率的比较，确定所述对象的所述抗-TNF α药物的后续剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当所述第一比率约100 I和所述第二比率低于约95 I吋，提高抗-TNFa药物的后续剂量，从而最优化所述抗-TNF α药物的治疗剂量。
48.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物选自下组REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CMZIA. (赛妥珠单抗)和其组合。
49.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。
50.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRA )。
51.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBREL )。
52.如权利要求41-47任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa药物是CIMZIA (赛妥珠单抗)。
53.如权利要求41-52任何一项所述的方法,其特征在于,所述标记TNFα是突光标记的 TNF α。
54.如权利要求41-53任何一项所述的方法，其特征在于，所述测量的标记抗-TNFa和标记内部对照是定量的。
55.如权利要求41-54任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合物先被洗脱，然后是游离的标记TNF α。
56.如权利要求41-55任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。
57.如权利要求41-56任何一项所述的方法，其特征在干，所述样品获自接受所述抗-TNF α药物治疗期间的对象。
58.如权利要求41-57任何一项所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC).
59.一种參比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样品中所述抗-TNFa药物自身抗体的存在和水平的方法，所述方法包括 (a)使一定量的标记抗-TNFa药物和一定量的标记内部对照与所述样品接触，形成所述标记抗-TNF α药物与所述自身抗体的复合物； (b)用分子大小排阻层析检测所述标记抗-TNFa药物和所述标记内部对照； (C)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记TNFa峰曲线下面积的积分； (d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算所述标记内部对照峰曲线下面积的积分； (e)将所述标记抗-TNFa药物的含量除以所述标记内部対照的含量，测得第一比率； (f)除以步骤(C)和步骤⑷得到的积分，测得第二比率；和 (g)比较步骤(e)测得的第一比率与步骤(f)测得的第二比率，从而參比内部对照測定所述自身抗体的存在或水平。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约80-约100。
61.如权利要求59-61任何一项所述的方法，其特征在于，步骤(e)测得的第一比率为约 100.
62.如权利要求59-61任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记内部对照是生物胞素-Alexa 488。
63.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，分析样品中所述标记内部对照为每100 μ L约50-约200pg。
64.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa药物选自REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CMZIA (赛妥珠单抗)和其组合。
65.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是英夫利昔单抗(REMICADE )。
66.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是阿达木单抗(HUMIRA )。
67.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα药物是依那西普(ENBREL )。
68.如权利要求59-62任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa药物是CIMZIA (D (赛妥珠单抗)。
69.如权利要求59-68任何一项所述的方法,其特征在于,所述测量的标记抗-TNFα药物和标记内部对照是定量的。
70.如权利要求59-69任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合物先被洗脱，然后是游离的标记抗-TNF α药物。
71.如权利要求59-70任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。
72.如权利要求59-71任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品获自接受所述抗-TNF α药物治疗期间的对象。
73.如权利要求59-72任何一项所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻层析是分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC).
74.如权利要求59-73任何一项所述的方法，其特征在于，所述自身抗体选自下组人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
75.ー种检测样品中抗-TNF α药物的存在或水平和抗-TNF α药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，所述试剂盒包括 (a)含一定量的标记TNFa的第一检测底物； (b)含一定量的标记抗-TNFα药物的第二检测底物； (C)任选的第三检测底物,其含一定量的标记TNFa和一定量的标记内部对照； (d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNFα药物和一定量的标记内部对昭. (e)任选的用于提取对象样品的工具；和 (f)任选的使用该试剂盒的说明书小册。
76.如权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测所述标记TNFa、所述标记抗-TNFa药物和/或所述标记内部对照所用的手段。
77.如权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，所述检测手段包括荧光标记检測、UV-幅射光检测或放射性碘暴光检测。
78.如权利要求75-77所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括分子大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)仪器。
79.如权利要求75-78所述的试剂盒，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四检测底物选自下组硝化纤维素、硅胶和分子大小排阻层析的介质。
80.如权利要求75-79所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-TNFa药物选自下组REMICADE (英夫利昔单抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿达木单抗)、CMZIA (赛妥珠单杭)和其组合。
81.如权利要求75-80任何一项所述的方法，其特征在于，所述标记TNFα是荧光标记的 TNF α。
82.如权利要求75-81任何一项所述的试剂盒，其特征在于，所述样品是血清。
83.如权利要求75-82所述的试剂盒，其特征在于，所述样品获自接受所述抗-TNFα药物治疗期间的对象。
84.如权利要求75-83所述的试剂盒，其特征在干，所述自身抗体选自下组人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)、人抗-人源化抗体(HAHA)和其组合。
全文摘要
本发明提供检测和测量样品中抗-TNFα药物治疗和自身抗体的存在或水平的方法。本发明可用于最优化治疗和监测接受抗-TNFα药物治疗患者以检测抗药物的自身抗体(如HACA和/或HAHA)的存在或水平。
文档编号G01N33/564GK102695955SQ201080060442
公开日2012年9月26日 申请日期2010年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者L·奥尔穆德, S·L·王, S·辛格 申请人:普罗米修斯实验室股份有限公司