甲胎蛋白自身抗体单独或与甲胎蛋白联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了甲胎蛋白(AFP)自身抗体单独或与AFP联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用。研究发现，在用于肝癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的诊断和预示、疗效评估及复发监控时，单独检测血清或血浆AFP自身抗体的准确度、灵敏度和特异性较单独检测血清或血浆AFP高或与其基本相当，而联合检测血清或血浆AFP自身抗体与AFP的准确度、灵敏度和特异性高于上述二者单独检测。此外，本发明还提供了一种基于磁微粒分离酶联免疫检测技术的AFP自身抗体检测试剂盒以及AFP与AFP自身抗体联合检测试剂盒，具有检测准确、灵敏、特异，操作简便等优点。
【专利说明】甲胎蛋白自身抗体单独或与甲胎蛋白联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学【技术领域】，涉及甲胎蛋白(AFP)自身抗体在医学领域中的新应用。
【背景技术】
[0002]肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。相对于高死亡率，早期肝癌的发现比例却非常低，八成以上一经发现就已是晚期，其生存期大多只剩半年。因此，如何更早发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，以及如何对术后患者进行实时准确的复发监控等是肝癌防治中亟待解决的问题。而灵敏度高、特异性强的肝癌诊断试剂的研制是提高肝癌早期检出率、改善患者预后的关键之一。过去一直认为AFP是诊断原发性肝癌的特异性标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。近年来大量临床却发现，如果将cutoff值定为20 μ g/L，以AFP诊断肝癌的阳性率仅80%左右，在肠胃管肿瘤如胰腺癌、肺癌以及一些肝的良性病变如肝炎、肝硬化中也会出现不同程度的AFP增高现象，比如约有15-18%的慢性肝炎和11-47%的肝硬化患者其血清AFP在20-200 μ g/L水平。因此，以AFP诊断肝癌的特异性尚不理想。而提高cutoff值虽然可以提高诊断的特异性，但诊断灵敏度却会大幅下降。
[0003]自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持，一旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、器官、细胞或细胞成分为“异物”而发生自身免疫反应，产生自身抗体。大量研究表明，肿瘤本身能诱导机体免疫反应，产生抗肿瘤相关抗原的自身抗体，在肿瘤抗原表达很低的时候也能够检测到。因此，检测与肿瘤抗原相关的自身抗体，有望及时地发现肿瘤。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于考察AFP自身抗体单独用于肝癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的诊断、疗效评估和复发监控的可能性，目的之二在于考察AFP与AFP自身抗体联合用于肝癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的诊断、疗效评估和复发监控的可能性，以达到准确、灵敏、特异的技术效果。
[0005]经研究，本发明提供如下技术方案:
[0006]1.甲胎蛋白自身抗体单独作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用，所述肿瘤为肝癌、肺癌和胰腺癌中的任一种。
[0007]2.甲胎蛋白自身抗体检测试剂盒，包括磁分离试剂、生物素标记反应试剂、酶反应试剂和底物溶液；所述磁分离试剂为甲胎蛋白抗原III偶联磁性纳米微球，所述甲胎蛋白抗原III的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；所述生物素标记反应试剂为生物素标记甲胎蛋白抗原I或II，所述甲胎蛋白抗原I的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，甲胎蛋白抗原II的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述酶反应试剂为酶标记亲和素；所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
[0008]进一步，所述甲胎蛋白自身抗体检测试剂盒还包括反应增强剂、样本稀释液和清洗浓缩液；所述反应增强剂为含有4.23g/L NaCU0.2mL/L Proclin-300和8.16g/L甲基异丙基酮的pH7.2-7.4的IOmM Tris-HCl缓冲液；所述样本稀释液为含有9g/L NaCU0.5mL/LProclin-300和50g/L BSA的pH6.8-7.2的水溶液；所述清洗浓缩液为含有42.8g/L NaCl、2mL/L Proclin-300 和 10mL/L Tween-20 的 ρΗ7.2-7.4 的 IOmM PBS 缓冲液。
[0009]进一步，所述甲胎蛋白自身抗体检测试剂盒还包括标准品和质控品；所述标准品为浓度梯度分别为0、5、25、125、500、1000pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液；所述质控品为5pg/mL或125pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液。
[0010]3.甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用，所述肿瘤为肝癌、肺癌和胰腺癌中的任一种。
[0011]4.甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合检测试剂盒，包括磁分离试剂A和B、生物素标记反应试剂A和B、酶反应试剂和底物溶液；所述磁分离试剂A为甲胎蛋白抗原III偶联磁性纳米微球，所述甲胎蛋白抗原III的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；所述磁分离试剂B为抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体偶联磁性纳米微球；所述生物素标记反应试剂A为生物素标记甲胎蛋白抗原I或II，所述甲胎蛋白抗原I的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，甲胎蛋白抗原II的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述生物素标记反应试剂B为生物素标记抗甲胎蛋白抗原I或II的单克隆抗体；所述酶反应试剂为酶标记亲和素；所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
[0012]进一步，所述甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合检测试剂盒还包括反应增强剂、样本稀释液和清洗浓缩液；所述反应增强剂为含有4.23g/L NaCU0.2mL/L Pix)Clin-300和
8.16g/L甲基异丙基酮的pH7.2-7.4的IOmM Tris-HCl缓冲液；所述样本稀释液为含有9g/L NaCU0.5mL/L Proclin-300和50g/L BSA的pH6.8-7.2的水溶液；所述清洗浓缩液为含有 42.8g/L NaCl、2mL/L Proclin-300 和 10mL/L Tween-20 的 ρΗ7.2-7.4 的 IOmM PBS 缓冲液。
[0013]进一步，所述甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合检测试剂盒还包括标准品A和B以及质控品A和B ;所述标准品A为浓度梯度分别为0、5、25、125、500、1000pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液；所述标准品B为浓度梯度分别为0、5、25、125、500、1000pg/mL的甲胎蛋白抗原III溶液；所述质控品A为5pg/mL或125pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液;所述质控品B为5pg/mL或125pg/mL的甲胎蛋白抗原III溶液。
[0014]其中，磁分离试剂A、生物素标记反应试剂A、标准品A和质控品A配套用于AFP自身抗体的检测；磁分离试剂B、生物素标记反应试剂B、标准品B和质控品B配套用于AFP的检测。
[0015]本发明的有益效果在于:本发明公开了 AFP自身抗体单独或与AFP联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用。研究发现，在用于肝癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的诊断和预示、疗效评估及复发监控时，单独检测血清或血浆AFP自身抗体的准确度、灵敏度和特异性较单独检测血清或血浆AFP高或与其基本相当，而联合检测血清或血浆AFP自身抗体与AFP的准确度、灵敏度和特异性高于上述二者单独检测。此外，本发明还提供了一种基于磁微粒分离酶联免疫检测技术的AFP自身抗体检测试剂盒以及AFP与AFP自身抗体联合 检测试剂盒，具有检测准确、灵敏、特异，操作简便等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0017]图1为采用本发明试剂盒单独检测肝癌患者与健康人血清AFP浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0018]图2为采用本发明试剂盒单独检测肝癌患者与健康人血清AFP自身抗体浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0019]图3为采用本发明试剂盒联合检测肝癌患者与健康人血清AFP与AFP自身抗体浓度的散点图㈧和ROC曲线⑶。
[0020]图4为采用本发明试剂盒单独检测肝癌患者与健康人血浆AFP浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0021]图5为采用本发明试剂盒单独检测肝癌患者与健康人血浆AFP自身抗体浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0022]图6为采用本发明试剂盒联合检测肝癌患者与健康人血浆AFP与AFP自身抗体浓度的散点图㈧和ROC曲线⑶。
[0023]图7为采用本发明试剂盒单独检测胰腺癌患者与健康人血清AFP浓度的散点图(A)和 ROC 曲线(B)。
[0024]图8为采用本发明试剂盒单独检测胰腺癌患者与健康人血清AFP自身抗体浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0025]图9为采用本发明试剂盒联合检测胰腺癌患者与健康人血清AFP与AFP自身抗体浓度的散点图㈧和ROC曲线⑶。
[0026]图10为采用本发明试剂盒单独检测胰腺癌患者与健康人血浆AFP浓度的散点图(A)和 ROC 曲线(B)。
[0027]图11为采用本发明试剂盒单独检测胰腺癌患者与健康人血浆AFP自身抗体浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0028]图12为采用本发明试剂盒联合检测胰腺癌患者与健康人血浆AFP与AFP自身抗体浓度的散点图㈧和ROC曲线⑶。
[0029]图13为采用本发明试剂盒单独检测肺癌患者与健康人血清AFP浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0030]图14为采用本发明试剂盒单独检测肺癌患者与健康人血清AFP自身抗体浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0031]图15为采用本发明试剂盒联合检测肺癌患者与健康人血清AFP与AFP自身抗体浓度的散点图㈧和ROC曲线⑶。
[0032]图16为采用本发明试剂盒单独检测肺癌患者与健康人血浆AFP浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。
[0033]图17为采用本发明试剂盒单独检测肺癌患者与健康人血浆AFP自身抗体浓度的散点图(A)和ROC曲线(B)。[0034]图18为采用本发明试剂盒联合检测肺癌患者与健康人血浆AFP与AFP自身抗体浓度的散点图㈧和ROC曲线⑶。
【具体实施方式】
[0035]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
[0036]主要试剂及材料:
[0037]AFP 抗原 I (AFP76-89，序列如 SEQ.1D N0.1 所示)、AFP 抗原 II (AFP110-120，序列如 SEQ.1D N0.2所示)、AFP抗原 III(AFPl-609，序列如 SEQ.1D N0.3所示)均由 Invitrogen公司合成。
[0038]抗AFP 抗原 I 的单克隆抗体(Ant1-alphalFetoprotein antibody [EPR9309](abl69552))、抗 AFP 抗原 II 的单克隆抗体(Ant1-alpha Fetoproteinantibody (abl28028))、抗 AFP 抗原 III 的单克隆抗体(Ant1-alphalFetoproteinantibody [AFP-11] (ab3969))均购自 abeam 公司。
[0039]磁性纳米微球(MS50002)购自苏州纳微生物科技有限公司；碱性磷酸酶(11464752001)购自罗氏公司；其余未注明试剂均购自Sigma aldrich公司。
[0040]实施例一、AFP自身抗体检测试剂盒、AFP与AFP自身抗体联合检测试剂盒的制备及其检测方法
[0041]一、试剂盒组分的制备
[0042]1、磁分离试剂的制备
[0043]取0.96g Tween-20，加适量水使完全溶解后，加入6.05g TRIS和3.4g NaCl，再加入0.2mL Proclin-300与IOmL水的混合液，再加水800mL,搅拌使固体溶解，调pH至7.95-8.05，再加入3g BSA,搅拌使完全溶解，用水稀释至IOOOmL,摇匀，用孔径为0.2 μ m的滤器滤过，得磁珠缓冲液。
[0044]取5mg AFP 抗原 III 溶于 ImL pH6.8 的 0.1M PBS 中；另取 IOmg EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)溶于ImL pH6.8的0.1M PBS中；将上述两种溶液混合，室温搅拌90min后，在4°C、3000g条件下离心浓缩至总体积为1ml，得EDC活化的AFP抗原III液。取5mL磁性纳米微球悬液(固含量IOOmg)，用磁力架进行固液分离，弃上清，沉淀用PH6.8的0.1M PBS洗涤3次(5mL/次)后，加入EDC活化的AFP抗原III液，混匀，37°C反应3小时，用磁力架进行固液分离，弃上清，沉淀用pH6.8的0.1M PBS洗涤3次(5mL/次)后，用 IOOmL 磁珠保存液(将 BSAlOg,Tween-1000.5mL、NaN30.5g 用 ρΗ7.0 的 IOmM PBS溶解并稀释至IOOOmL即得)重悬，得AFP抗原III偶联磁性纳米微球悬液。
[0045]将AFP抗原111偶联磁性纳米微球悬液与磁珠缓冲液按体积比1:1混合，得磁分离试剂A，2-8°C贮存，有效期12个月。
[0046]以抗AFP抗原III的单克隆抗体替代AFP抗原III，按照上述同样方法，制得磁分离试剂B。
[0047]2、生物素标记反应试剂的制备
[0048]取Img AFP 抗原 I (或 AFP 抗原 II)溶于 0.1mL ρΗ6.8 的 0.1M PBS 中；另取 2mg 戊二醛溶于0.9mL pH5.0的MES中；将上述两种溶液混合，室温搅拌90min后，在4°C、3000g条件下离心浓缩至总体积为0.5mL，得戊二醛活化的AFP抗原I (或AFP抗原II)液。取Img生物素溶于0.5mL pH6.8的0.1M PBS中，加入戊二醛活化的AFP抗原I (或AFP抗原II)液，混匀，37°C反应3小时，通过亲和层析与透析法除去未标记生物素与游离抗体，用IOmL生物素标记物保存液(将BSA30g、NaN30.5g用ρΗ7.0的IOmM Tris-HCl溶解并稀释至IOOOmL即得)溶解，得生物素标记反应试剂A，2-8°C贮存，有效期12个月。
[0049]以抗AFP抗原I的单克隆抗体(或抗AFP抗原II的单克隆抗体)替代AFP抗原
I(或AFP抗原II)，按照上述同样方法，制得生物素标记反应试剂B。
[0050]3、酶反应试剂的制备
[0051]取IOmg碱性磷酸酶溶于 0.8mL ρΗ6.8 的 0.1M PBS 中，加入 0.2mL0.1M NaIO4溶液，37°C混匀20min后，在4°C、3000g条件下离心浓缩至总体积为0.5mL,用pH9.5的0.2M碳酸盐缓冲液调节pH至9.0，立即加入3-5mg亲和素，37°C搅拌lh，再加入0.lmL4mg/mL NaBH4溶液，混匀，4°C反应30min ;所得溶液装入透析袋中，用pH6.8的0.1M PBS于4°C透析过夜，收集保留液，用IOmL酶反应试剂保存液(将BSA50g、NaN30.5g用ρΗ7.0的IOmM PBS溶解并稀释至IOOOmL即得)溶解，得酶反应试剂，2-8°C贮存，有效期12个月。
[0052]4、反应增强剂的制备
[0053]取NaC14.23g、Proclin-3000.2mL 及甲基异丙基酮(Methyl IsopropylKetone, ΜΙΚ)8.16g 溶于 ρΗ7.2 的 IOOmM Tris-HCllOOmL 中，再加入 800mL 水，调 pH 至
7.2-7.4，用水稀释至IOOOmL,摇匀后，用孔径0.2μπι的滤器滤过，得反应增强剂，2-8°C贮存，有效期12个月。
[0054]5、样本稀释液的制备
[0055]取NaC19g和BSA50g，加适量水使完全溶解后，加入Proclin-3000.5mL,再加入800mL 7jC，调pH至6.8-7.2，用水稀释至IOOOmL,摇匀后，用孔径为0.2 μ m的滤器滤过，得样本稀释液，2-8 °C贮存，有效期12个月。
[0056]6、标准品和质控品的制备
[0057]标准品A和质控品A的原料均为1000pg/mL的抗AFP抗原III的单克隆抗体溶液；标准品B和质控品B的原料均为1000pg/mL的AFP抗原III溶液。
[0058]将标准品A或B的原料用酶反应试剂保存液稀释，制得浓度梯度分别为0、5、25、125、500、1000pg/mL的标准品A或B，2_8°C贮存，有效期为12个月。
[0059]将质控品A或B的原料用酶反应试剂保存液稀释，制得浓度分别为5pg/mL或125pg/mL的质控品A或B，2_8°C贮存，有效期为12个月。
[0060]7、清洗浓缩液的制备
[0061]取NaC142.8g 溶于 ρΗ7.2 的 IOOmM PBSlOOmL 中，力卩入 IOmL Tween-20 和Proclin-3002mL,再加入800mL水，调pH至7.2-7.4，用水稀释至IOOOmL,摇匀后，用孔径为0.2μπι的滤器滤过，得清洗浓缩液，2-8°C贮存，有效期12个月。
[0062]8、底物溶液的制备
[0063]取Na C I 5.1 4 g , Tr i s 3 6.3 6 g , Na2SO3I Omg , Proclin-3000.5mL ,Lumi_Phos530 (lumigen P-501) 15mL, Tween-200.2mL,加入 8OOmL 水，调 pH 至 9.2-9.4,用水稀释至IOOOmL,摇匀后，用孔径为0.2 μ m的滤器滤过，得底物溶液，2_8°C贮存，有效期为12个月。[0064]二、AFP自身抗体检测试剂盒的组成
[0065]AFP自身抗体检测试剂盒的具体组成如表1所示。
[0066]表1.AFP自身抗体检测试剂盒的组成
[0067]
【权利要求】
1.甲胎蛋白自身抗体单独作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用，所述肿瘤为肝癌、肺癌和胰腺癌中的任一种。
2.甲胎蛋白自身抗体检测试剂盒，其特征在于，包括磁分离试剂、生物素标记反应试剂、酶反应试剂和底物溶液；所述磁分离试剂为甲胎蛋白抗原III偶联磁性纳米微球，所述甲胎蛋白抗原III的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；所述生物素标记反应试剂为生物素标记甲胎蛋白抗原I或II，所述甲胎蛋白抗原I的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，甲胎蛋白抗原II的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述酶反应试剂为酶标记亲和素；所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
3.如权利要求2所述的甲胎蛋白自身抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括反应增强剂、样本稀释液和清洗浓缩液；所述反应增强剂为含有4.23g/L NaCl、0.2mL/LProclin-300和8.16g/L甲基异丙基酮的pH7.2-7.4的IOmM Tris-HCl缓冲液；所述样本稀释液为含有 9g/L NaCl.0.5mL/L Proclin-300 和 50g/L BSA 的 ρΗ6.8-7.2 的水溶液；所述清洗浓缩液为含有 42.8g/L NaCl、2mL/L Proclin-300 和 10mL/L Tween-20 的 ρΗ7.2-7.4的1OmM PBS缓冲液。
4.如权利要求2或3所述的甲胎蛋白自身抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括标准品和质控品；所述标准品为浓度梯度分别为0、5、25、125、500、1000pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液；所述质控品为5pg/mL或125pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液。
5.甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用，所述肿瘤为肝癌、肺癌和胰腺癌中的任一种。
6.甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，包括磁分离试剂A和B、生物素标记反应试剂A和B、酶反应试剂和底物溶液；所述磁分离试剂A为甲胎蛋白抗原III偶联磁性纳米微球，所述甲胎蛋白抗原III的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；所述磁分离试剂B为抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体偶联磁性纳米微球；所述生物素标记反应试剂A为生物素标记甲胎蛋白抗原I或II，所述甲胎蛋白抗原I的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，甲胎蛋白抗原II的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述生物素标记反应试剂B为生物素标记抗甲胎蛋白抗原I或II的单克隆抗体；所述酶反应试剂为酶标记亲和素；所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
7.如权利要求6所述的甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，还包括反应增强剂、样本稀释液和清洗浓缩液；所述反应增强剂为含有4.23g/L NaCl,.0.2mL/L Proclin-300 和 8.16g/L 甲基异丙基酮的 pH7.2-7.4 的 IOmM Tris-HCl 缓冲液；所述样本稀释液为含有 9g/L NaCl.0.5mL/L Proclin-300 和 50g/L BSA 的 pH6.8-7.2 的水溶液；所述清洗浓缩液为含有 42.8g/L NaCl、2mL/L Proclin-300 和 10mL/L Tween-20 的ρΗ7.2-7.4 的 IOmM PBS 缓冲液。
8.如权利要求6或7所述的甲胎蛋白与甲胎蛋白自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，还包括标准品A和B以及质控品A和B ;所述标准品A为浓度梯度分别为O、5、25、.125、500、1000pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液；所述标准品B为浓度梯度分别为0、5、25、125、500、1000pg/mL的甲胎蛋白抗原III溶液；所述质控品A为5pg/mL或.125pg/mL的抗甲胎蛋白抗原III的单克隆抗体溶液；所述质控品B为5pg/mL或125pg/mL的甲胎蛋白抗 原III溶液。
【文档编号】G01N33/68GK103969453SQ201410241014
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】王弢, 乐飚, 徐骏, 渠香云, 张国洲, 盛稳稳, 何林富 申请人:上海度微医学技术有限公司