作为1型糖尿病的早期诊断指标的gad抗体的高灵敏度测定方法
【专利说明】作为1型糖尿病的早期诊断指标的GAD抗体的高灵敏度测 定方法 【技术领域】
[0001] 本发明设及，用于确切评价一诊断作为1型糖尿病的初期症状的评价指标的GAD 抗体的高灵敏度测定方法。 【【背景技术】】
[0002] 糖尿病被定义为"是由膜岛素作用的不足的慢性高血糖作为主征，伴随各种的特 征性的代谢异常的疾病群。其发症与遗传因子和环境因子均相关。于是，代谢异常的经长 期间的持续容易导致特有的并发症，也促进动脉硬化症。另外，随代谢异常的程度，显示从 无症状至酬酸中毒或昏睡的宽范围的病态。"（非专利文献1)。在日本，强烈疑似糖尿病的 人及无法否定其可能性的状态的人（罹患危险者）被确定合计约2, 210万人，今后也预计 进一步增加（非专利文献2)。糖尿病，根据成因被分类为1型糖尿病、2型糖尿病、由特定 的原因的其他糖尿病及妊娠糖尿病的4类，在其中也是1型糖尿病患者占5~10%、2型糖 尿病患者占90~95%，几乎全部糖尿病是2型糖尿病患者。糖尿病的发症原因随各分类 而不同，1型糖尿病被认为是，通过分泌膜岛素的膜腺的P细胞被破坏，至膜岛素的绝对的 缺乏而发症。对此膜腺0细胞破坏的机制尚未被明确地解明，但被认为与自身免疫反应相 关，作为其抗原，在膜腺0细胞特异性地表达的膜岛素被视为重要。
[0003] 1型糖尿病被认为是自身免疫疾病之一，从1型糖尿病患者检测出数种的膜岛关 联自身抗体（膜岛素自身抗体、GAD(谷氨酸脱駿酶）抗体、IA(膜岛素瘤相关抗原）-2抗体 等）。特别是，在该些之中，最近受关注的是GAD抗体。GAD抗体是针对谷氨酸脱駿酶（谷 氨酸脱駿酶；GAD)的自身抗体。由Baekkeskov等报告，在1型糖尿病患者血清中存在与膜 岛的64kDa的蛋白质反应的抗体，得知此64kDa的蛋白质是GAD(非专利文献3)。在GAD中 存在65kDa的GAD65和67kDa的GAD67的2种同种型，1型糖尿病患者的GAD抗体是针对 GAD65的自身抗体（非专利文献4)。作为GAD抗体的阳性率，早期发症时显示高达70~ 80%的阳性率。但是，在发症5年往后，阳性率成50%W下，10年后降低至20% (非专利文 献5)。另外，GAD抗体与膜岛素自身抗体、IA-2抗体相比，在发症时期不足9岁时阳性率低 达70%，但在10岁W上时，阳性率变高至90%，即使是成人，阳性率也高达85% (非专利文 献6)。
[0004] 当从糖尿病患者检测到膜岛关联自身抗体时，诊断为1型糖尿病。但是，在瘦形的 2型糖尿病患者之中见到，在发症时检测不到膜岛关联自身抗体，显示可由就餐或经口血糖 降低药治疗的状态，但缓慢地膜岛素分泌能力降低，平均3年转到膜岛素依赖性糖尿病（1 型糖尿病）的例。在此时间点的患者血清中膜岛关联自身抗体单独或重复示阳性，小林等 将该样的亚型的1型糖尿病命名为缓缓慢进行1型糖尿病（SlowlyprogressiveIDDM; SPIDDM)(非专利文献7)。
[0005] 作为SPI孤M的诊断基准，虽尚未确立，可为在糖尿病发症后6~12个月之间可用 就餐疗法或经口血糖降低剂治疗，及GAD抗体是阳性（非专利文献8)或GAD抗体、IA-2抗 体、膜岛素自身抗体之中只要1个是阳性（非专利文献9)。SPIDDM的膜岛关联自身抗体 阳性被报告率是GAD抗体69%、IA-2抗体39%、膜岛素自身抗体29%，GAD抗体被报告与 IA-2抗体、膜岛素自身抗体比显著地更高（非专利文献9)。
[0006] 如上所述，对GAD抗体而言，在SPIDDM中阳性率最高，被视为在诊断1型糖尿病上 非常重要的诊断指标。但是，由W往的酶联免疫测定法巧LISA法）检测灵敏度低，所W难 W早期的发现或检测低浓度的自身抗体。
[0007] 因此，期待关于GAD抗体的，新的高灵敏度酶联免疫测定法的开发，期望早期的 SPIDDM的发现和由膜岛素疗法的早期治疗。
[0008] 【现有技术文献】
[0009] 【非专利文献】
[0010] 非专利文献1;清野裕、南條輝志男、田峡尚子等；糖尿病①分類診断基準t二関 子吝委員会報告、糖尿病53卷6号；450-467、2010
[0011] 非专利文献2 ;厚生労働省健康局絶務課生活習慣病対策室、2007年国民健康?栄 養調査結果①概要、2008
[0012] 非专利文献 3 ;Baek:keskovS,Aanstoot町，QiristgauSetalidentification ofthe64Kautoantigenininsulin-dependentdiabetesastheGABA-synthesizing enzymeglutamicaciddecarboxylase.Nature347(6289) ;151-156, 1990
[0013] 非专利文献4;KaufmanDL,ErlanderMG,Clare-SalzlerM,etal;Autoimmunity totwoformsofglutamatedecarboxylaseininsulin-dependentdiabetesmellitus. JClinInvest89(1) ；283-292, 1992
[0014] 非专利文献5 ;春日明、丸山太郎、小澤咏加子等；日本人糖尿病患者(三杉W吝 GAD65抗体①検討-新①L3測定法，radioligandbindingassay杏用L3 了 -、糖尿病39卷 7 号；497-502、1996
[00巧]非专利文献 6;GorusFK,Goube;rtP,SemakulaC,etal;IA-2-autoantibodies complementGAD65-autoantibodiesinnew-onsetIDDMpatientsandhelppredict impendingdiabetesintheirsiblings.TheBelgianDiabetesRegistry.Diabetologia 40(1) ；95-99, 1997
[0016] 非专利文献 7;KobayashiT,SawanoS,ItohT,etal;Islet-cellantibodies inInsulin-dependentandnon-insulindependentdiabeticsinJapan；their prevalenceandclinicalsignificance.Inclinico-geneticgenesisofdiabetes mellitus.MimuraG，BabaS，GotoY,KobberlingJ,Eds.Amsterdam,ExcerptaMed 150-160, 1982(ICSNo. 597)
[0017] 非专利文献 8;StenstromG,GottsaterA,BalditadzeE,etal;Latent autoimmunediabetesinadults；definition，prevalence,P-cellfunction,and treatment.Di油etes54(Suppl2) ;S68_72, 2005
[001引非专利文献9 ;田中昌一郎、粟田卓也、島田朗等；緩徐進行1型糖尿病（slowly progressiveinsulin-cbpendentdi油etesmelli1:us;SPIDDM)①臨床的特徴-日本糖尿 病学会1型糖尿病調査研究委員会緩徐進行1型糖尿病分科会報告（第一報）-、糖尿病54 卷 1 号；65-75、2011 【
【发明内容】
】
[0019]【发明要解决的技术课题】
[0020] 本发明的目的在于提供用于早期检测1型糖尿病、特别是关于SPIDDM的发症，进 行适宜的生活指导或治疗的，GAD抗体的高灵敏度酶联免疫测定方法。
[0021] 【解决课题的技术方案】
[002引一般市售的对GAD抗体的化ISA试剂盒是第3代的化ISA法。首先，在不溶化GAD抗原的固相上捕获GAD抗体，接下来，使生物素标记GAD结合，最后，使过氧化物酶标记亲和 素反应，测定酶活性。在此方法中，过氧化物酶标记亲和素的非特异信号残留，尚可高灵敏 度化。另外，残留了测定与GAD结合的全部的物质（IgGW外的免疫球蛋白或结合蛋白质） 的问题。
[0023] 从而，使用本发明人开发的2点结合免疫复合物转移酶联免疫测定法（Immune ComplexTransferEnzymeImmunoassay;往后称为ICT-EIA法）进行锐意探讨GAD抗体 的测定。目P，ICT-EIA法是指，为了解决作为化ISA法中的大的问题的，酶标记抗原或酶标 记第2抗体的向非特异性的固相的吸附，从在抗原不溶化固相捕获或非特异性地吸附的总 抗体之中仅从固相解离下特异抗体，转移到别的新的固相的方法化ashidaS，化shinakaK 及IshikawaEUltrasensitiveenzymeimmunoassay,InBiotechnologyAnnualReview Volume1，El-gewely，M.R.ed.，ElsevierSciencePublishersB.V.，403-451，1995)。
[0024] 本发明人，如图1所示改良ICT-EIA法，开发了可高灵敏度检测抗GADIgG抗体的 ICT-EIA-1法。另外，除了直接酶标记GAD的ICT-EIA-1法之外，为了防止抗原表位的立体 障碍而开发了抗GADIgG抗体的ICT-EIA-2法。结果，通过使用本发明的ICT-EIA-1法或 ICT-EIA-2法，变得可W通常的化ISA试剂盒的约33倍的高灵敏度测定GAD抗体。
[00巧]再者，本发明人使用ICT-EIA-2法探讨了作为1型糖尿病及SPIDDM的诊断指标的IA-2抗体和膜岛素自身抗体的测定。结果得知，例如在膜岛素自身抗体的情况中，只要使用 ICT-EIA-2法，就可W与ELISA试剂盒相比1，000倍的高灵敏度进行检测。
[0026] 通过使用本发明的测定方法，用ELISA试剂盒可检测曾无法检测的SPIDDM的患 者。即，如图7所示，显示2型糖尿病患者的17%是SPI孤M的患者的可能性。
[0027] 本发明人，使用作为本发明的改良ICT-EIA法的ICT-EIA-1法和ICT-EIA-2法，可 制作GAD抗体和膜岛素自身抗体的高灵敏度检测法，但根据患者