专利名称：恶性淋巴瘤、自身免疫性疾病抗体药物的筛选及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体药物的筛选制备及应用。
背景技术：
恶性淋巴瘤(ML)是源于淋巴结和淋巴结外淋巴组织的恶性肿瘤，ML可分为何杰金氏 淋巴瘤(HD)和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)两大类。在我国，恶性淋巴瘤新发病例中，NHL 患者占85 90%。在NHL中，预后较好的低度恶性淋巴瘤在我国的发病率较低，约占NHL的 5%;而预后较差的高度恶性淋巴瘤发病率较高，占NHL的3(^左右。调查显示，随着时间的 推移和社会经济的发展，恶性淋巴瘤呈现增长的趋势，其中HD相对稳定，而NHL的发病率 和死亡率均在上升。非何杰金氏淋巴瘤的病因与发病机制尚未确定，目前认为与性别、年 龄、免疫功能缺失、细菌或病毒感染、环境等多种因素有关。
临床上治疗朋L的方法有化学治疗、放射治疗、手术治疗、骨髓移植等。目前对NHL的 治疗以化疗为主，但化疗的短期副作用很明显，而且对复发病人作用不肯定， 一般化疗联 合方案效果不佳；放疗存在的问题是应用范围较小，而手术对NHL仅起诊断作用，极易复 发，需要结合化疗；骨髓移植方法则由于配型困难、排异反应、价格昂贵等原因难以开展。
随着细胞生物学、分子生物学及生物工程技术的发展，免疫疗法在最近几年逐渐成为 癌症治疗的主要方法之一。它直接或间接利用人体免疫系统内的免疫细胞及抗体来对抗癌 症或减少因癌症或其治疗所引起的副作用，而肿瘤特异性的单克隆抗体类药物是目前免疫 治疗的主导方向。
目前在国际上研究的用以治疗NHL的单抗类药物主要是靶向于淋巴细胞表面的抗原， 已发表的研究结果中有针对CD20、 CD22、 CD52、 CD19、 CD30及HLA-DR等几种抗原的抗体 产品。
由National Cancer Insititute研制的人源化IgGl单抗Apolizumab (MoAb HulDIO) 可作用在正常及恶性B淋巴细胞表面的HLA-DR抗原P链上的多个位点上产生抗体依赖性的 细胞毒杀作用，在针对复发性或弥漫型CLL或ALL的I期临床试验中，有11%的病人治疗后 达到PR， 67呢的病人为SD， 22M的病人为PD。所有的病人都出现了 1-2度输注反应(58%乏力、50%恶心、50%高血糖、42%发热、42%风疹和33%头痛)。该药现正处在II期临床试验研 究阶段。
由Peregrine Pharmaceuticals公司研制的鼠源型单抗Lym-1 (0ncolym)是一种能够 特异性识别HLA-DR10抗原的鼠源性IgG2a单抗，该抗原在80%恶性淋巴瘤B细胞表面都有 表达。它与淋巴瘤细胞的结合能力明显高于与正常B淋巴细胞的结合能力。在对1251-Lym-l 的放射性显像研究中证实，Lym-l对已知的淋巴瘤组织部位有高度的选择性结合，而在正常 的组织上结合较少。
在对Lym-l进行的在I期临床试验中，10例病人中有3例出现缓解。IgM HAMA反应均 呈阴性。主要的毒性反应表现为有8例病人出现了在注射近终点时或注射完成后的发热， 其中4例最高体温保持在38。C以下，另4例最高体温保持在38 4(TC之间，该发热很容易 用药控制，而且通常只持续2 4小时；有4例病人在注射后出现了风疹；在研究过程中， 没有发现心脏、肝肾或肺部毒性反应；而且在血液学指数方面也没有明显的改变；大多数 病人的外周血淋巴细胞没有降低，免疫球蛋白的水平也未发现有明显改变。
放射免疫治疗(Radioimmunotherapy， RIT)则是一种免疫疗法和放射疗法相结合的治 疗手段，它是以能与肿瘤抗原结合的物质作为靶向载体，偶联放射性核素作为"弹头"(治 疗剂)的肿瘤治疗药物注入体内与肿瘤细胞相关抗原特异结合所致的肿瘤局部比其他正常 组织剂量高，达到对肿瘤杀伤而对正常组织损伤小的一种治疗方法，而放免疗法中最常用 的靶向载体是肿瘤细胞相关抗原的单克隆抗体。
目前在美国获准上市销售的治疗肿瘤的单抗类放射免疫药物主要有Zevalin和 Bexxar， 输液反应及骨髓毒性是其主要毒副反应。3度或4度白细胞减少和血小板减少 较为常见，并常发生于治疗后5-7周，并在2-4周后恢复。约5-7y。接受Zevalin和Bexxar 治疗的患者因感染需要住院治疗。少部分接受Zevalin和Bexxar治疗的患者可出现骨髓增 生异常综合症和急性白血病，但这些病人往往先前接受过垸化剂治疗。研究还发现，若患 者的骨髓受淋巴瘤侵犯越严重，则更多的放射性同位素聚集骨髓，从而对正常骨髓的损伤 更大。因此，在使用Zevalin或Bexxar治疗前，必须仔细评价患者骨髓情况。淋巴瘤骨髓 侵犯超过25%或发现骨髓功能不良者不宜接受Zevalin或Bexxar治疗。
由美国Peregrine Pharmaceuticals公司研制的鼠源型单抗Lym_l (0ncolym)既可以 引导放射性核素耙向到肿瘤局部杀死肿瘤细胞，还具有ADCC、 CDC及诱导Raji细胞凋亡的 作用杀伤肿瘤细胞。Lym-l经放射性核素mI标记后形成的131I-Lym-1与大多数恶性B细胞 表面的HLA-DR10抗原结合后可以引导放射性核素1311耙向到肿瘤局部杀死肿瘤细胞。中国专利ZL200410053872. 0公开了将Lym-1的可变区基因和人IgGl的y 1和k恒定区 基因融合，得到的一个低免疫原性的人鼠嵌合单抗(chLym-1)其中人源性序列为65%，鼠 源性序列占35%。研究表明chLym-l有着和Lym-1相似的亲和力，而且在摄取后的24-72小 时内chLym-1在肿瘤上的滞留量与Lym-1近乎相同。此外，chLym-1同样具有诱导ADCC、 CDC效应及诱导淋巴瘤细胞凋亡效应来直接杀死肿瘤细胞的能力。它诱导ADCC效应的水平 是鼠源型Lym-1的两倍，而且即便在较低的抗体浓度的条件下也可诱导最大的ADCC效应。 因此新一代的人鼠嵌合型单克隆抗体chLym-1相对于鼠源型Lym-1具有表达率高、性能稳 定、肿瘤摄取率高、正常组织摄取率低、可增加效应器功能、不易起HAMA反应而降低免疫 源性及自身杀伤肿瘤细胞能力优秀等优点，优化了放免治疗效果。但该药物目前的研究仅 限于肿瘤治疗上的应用，对于其它疾病的应用还有待开发及拓展。
风湿病包括由于免疫紊乱引起的多器官的自身免疫性疾病和骨关节病两大类疾病等 100多种病种。其发病率高，1999年世界卫生组织将风湿病与心血管疾病及癌症列为威胁 人类健康的三大杀手。目前全世界大约有3. 55亿人患有各种风湿病。在我国，类风湿关 节炎(RA)、强直性脊柱炎(AS)、干燥综合征(SS)患病率分别高达0. 3% 0. 5%、 0. 2% 0. 4%和0. 29% 0. 77%。风湿病不仅患病率高，且危害性大，未经治疗的RA患者2-3年致残 率为70%， AS的致残率也高达37%。在我国，2000年至今风湿病患者每年的用药总金额已 超过了 200亿元。长期以来，风湿病无特效治疗，仅近十年来生物制剂在风湿病治疗应用 中才获得了巨大成功，这类药物主要包括抗TNF-a单克隆抗体及类似生物产品。目前国际 上已有若干单抗上市，其疗效突出、副作用小，短短几年即确立了其市场地位。但因其用 药量大、制造工艺复杂，使其售价居高不下，而且注射间隔较短，给病人带来很多不便。 因此，如何降低单抗药物的制造成本、进一步提高其疗效、延长用药周期，成为国际生物 药界的当务之急。本发明根据研制单抗的作用机理，进一步研究了其在自身免疫疾病上的 应用。
发明内容
本发明在现有chLym-l的基础上对其进行了改进，不仅优化了其制备方法，同时还进 一步拓展了其应用。
本发明一方面公开了一种抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体，上述抗HLA-DR10 的淋巴瘤特异性人源化抗体包括重链及轻链，其中，重链含恒定区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:l，轻链含恒定区，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:2，重链及轻链通 过二硫键相连。较佳的，上述放射性同位素选自131I、 188Re、，或67Cu，优选1311。
在一优选例中，所述抗体重链恒定区为Y类型；而抗体轻链恒定区为K类型。 在另一优选例中，所述抗体是由NS0或CHO工程细胞株产生。
本发明第二方面，公开了上述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的制备方法，包 括下列步骤
在表达所述抗体的条件下，培养上述宿主细胞，从而表达出所述的抗体；和分离所述 的抗体。
培养过程中，为了提高单克隆抗体的表达量，本发明又进一步从确定适合大规模生产 需求的培养基及其它营养成分，确定营养成分的补加方式，确定合适的培养周期，确定溶 氧、pH等过程控制参数等方面，优化了其表达工艺条件。采用无血清高密度培养技术，使 得产物chlym-1的表达量大于500 mg/L。
本发明第三方面，公开了一种放射性同位素标记的抗体，为前述抗HLA-DRIO的淋巴瘤 特异性人源化抗体经放射性同位素标记获得。
本发明第四方面，公开上述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体用于制备治疗恶性 淋巴瘤的药物或用于制备诊断恶性淋巴瘤的试剂。尤其适用于制备治疗非何杰金氏B细胞 淋巴瘤。
本发明第五方面，公开了上述抗HLA-DRIO的淋巴瘤特异性人源化抗体用于制备治疗自 身免疫性疾病的药物。上述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎等。
本发明第六方面，提供了一种药物组合物，包括安全有效量的本发明所述的抗HLA-DR10 的淋巴瘤特异性人源化抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。这类载体包括 (但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方 式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其 他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规 方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的 给药量是治疗有效量。例如每天约l微克/千克体重一约10毫克/千克体重。此外，本发明 的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明获得了稳定高表达抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体(chlym-l单抗)的NS0工程细胞株，无血清高密度培养技术，使得chlym-l表达量大于500 mg/L，顺利完成 对该抗体的放射性标记，并对放射性标记的抗体进行了将其作为耙向药物应用恶性淋巴瘤 及自身免疫性疾病的临床应用研究，本发明的放射性标记的抗体，靶向性优良，疗效好， 部分消除了人抗鼠抗体产生的免疫应答反应，降低了HAMA阳性反应，安全有效，可多次应 用，从而解决了放射免疫治疗不能广泛应用于临床的问题，并提高了T/NT比值。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限 制本发明的范围。
实施例1抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的制备
采用中国专利(专利号200410053872.0)中实施例的方法制备NS0工程细胞株。主 要包括下列步骤
1. 鼠源性抗淋巴瘤单克隆抗体的制备
2. 抗HLA-DR10的特异性嵌和单抗的制备，包括重链可变区和轻链可变区的制备；可变 区基因与恒定区基因的融合；表达细胞种子细胞株的建立及其鉴定。
3. 获得NS0工程细胞株后，采用下述工艺条件制备抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化 抗体
表达工艺条件通过确定适合大规模生产需求的培养基及其它营养成分，确定营养成 分的补加方式，确定合适的培养周期，确定溶氧、pH等过程控制参数。使得表达量大于500 mg/L。
将过滤后的无细胞上清上样到MabSelect填充的FineLINE柱，上样的浓度是30mg/ml 。 洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0。再用凝胶过滤检测，结果表明纯度在 95%以上。
将产品测序，结果为，抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:1，轻链可变区氨 基酸序列为SEQ ID NO:2。
7实施例2 1311标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的制备
采用氯胺一T碘化标记法，将'311标记到实施例1获得的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性 人源化抗体上，制得产物的放射性比活度为11mCi/mg。
实施例3 1311标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体亲和常数测定
采用中国专利(专利号200410053872.0)中实施例的方法测定实施例2获得的1311 标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体，该单抗的亲和常数Ka=3. 40X108mOr。
实施例4 mI标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体治疗肿瘤的药效学研究
采用中国专利(专利号200410053872.0)中实施例6的方法检测实施例2获得的单 抗对荷人淋巴瘤裸鼠动物模型的药效作用。
结果证实，采用本发明的方法获得的单抗抗荷淋巴瘤作用确切，对于裸鼠，350uCi以 上剂量的肿瘤抑制率大于30% 。
实施例5 1311标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体治疗肿瘤的人体安全性、 耐受性、药代动力学研究及疗效研究
人体研究包括下列内容(1)研究碘[1311]恶性淋巴瘤嵌合单抗(131I-chLym-l)注射液 对恶性淋巴瘤患者单次静脉应用的安全性和耐受性；(2)进行mi-chLym-1注射液的人体药 代动力学研究；(3)观察131I-chLym-l注射液对恶性淋巴瘤患者的初步疗效；(4)探索 131I-ChLym-1注射液的安全剂量，为其后期研究提供安全有效的给药方案。 、
试验方法该实验为多中心、随机、开放I期临床试验，共有2个中心参加试验。本 试验共计划纳入28例恶性B细胞NHL患者接受单次给药耐受性试验，14例恶性B细胞NHL 患者接受药代动力学研究，其中9例进行单次给药药代动力学研究，5例进行连续给药药代 动力学研究。耐受性试验用药一次；单次给药药代动力学试验共用药3次，每次间隔6周；连续给药药代动力学试验用药两次，间隔两周。按照制定的纳入标准和排除标准选择和排 除受试者。本方案及其受试者同意书经SFDA和伦理委员会(EC)批准后实施。
疗效评价指标包括KPS评分、症状和体征的改善、病灶大小和数目的变化、肿瘤标记 物的变化等指标评价本品疗效；安全性评价指标包括不良事件的发生率以及WHO抗癌药急 性和亚急性毒性反应、体检、实验室有临床意义异常的发生率。本实验用描述性统计学对 所有人口学资料，包括年龄、性别、肿瘤分期和过去接受化疗和/或放疗的次数等进行分析 和总结。按规定的方法和程序计算药代动力学参数，对取得的数据进行卡方检验，并尽可 能提供F值。实验室检验结果将使用描述行统计学分析，并表达出其平均值和标准差。
试验结果表明，1311标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体对恶性淋巴瘤有一 定疗效。
实施例6 1311标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体对关节炎的治疗作用
动物试验包括下列内容(1)研究碘["'I]恶性淋巴瘤嵌合单抗(131I-chLym-1)注射液 对大鼠甲醛性关节炎的治疗作用；(2)观察['"I]恶性淋巴瘤嵌合单抗(131I-chLym-l)注射 液对小鼠扭体反应的抑制作用；(3)观察1311-chLym-l注射液对小鼠游泳时间、血清尿素氮 和血乳酸含量的影响，从而评价1311-chLynrl注射液对于类风湿性关节炎的治疗作用。
试验动物Wistar大鼠，雌雄各16只，体重180士20g 。
试验方法每种试验均采用Wistar大鼠，随机分为4组，(安慰剂组、阳性对照组、 小剂量药物组、大剂量药物组)，每组雌雄各半，10只/组。各试验组皮下注射给药1次， 六天后检测相关指标，包括甲醛性小鼠的足肿胀度、注射乙酸溶液后的扭体次数、小鼠的 游泳时间、血清尿素氮和血乳酸含量，并将实验室检验结果进行统计学分析，并计算出其 平均值和标准差。
结果表明，与安慰剂组相比，'3'I标记的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体药物 组对关节炎症状有一定的缓解作用。序列表
〈110〉苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司
〈120〉恶性淋巴瘤、自身免疫性疾病抗体药物的筛选及其制备方法和用途 〈130> PCNCJ080130 〈160> 2
<170> Patervtln version 3.1
<210> 1 〈211〉 120 〈212〉 PRT <213〉小鼠
〈400〉 1
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin
15 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr lie Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Val Val lie Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser His Thy Gly Ser Thr Leu Ala Phe Ala Ser Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser 115 120〈210〉 2 〈221> 106 〈212〉 PRT 〈213〉小鼠
〈400〉 2
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Glu Thr Val Thr lie lie Cys Arg Ala Ser Val Asn lie Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly ILys Ser Pro Gin Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys lie Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp PHe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Gly Thr Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
1权利要求
1.一种抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体，包括重链及轻链，其中，重链含恒定区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO1，轻链含恒定区，轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO2，重链及轻链通过二硫键相连。
2. 如权利要求1所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体，其特征在于，所述抗 HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体选自部分人源化，或者人和全人的单克隆抗体， 或其片段。
3. 权利要求1或2所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的制备方法，包括下列步 骤a) 在表达所述抗体的条件下，培养宿主细胞，从而表达出所述的抗体；b) 分离所述的抗体。
4. 如权利要求3所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的制备方法，其特征在于， 所述宿主细胞为NS0或CH0工程细胞株。
5. 如权利要求3所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的制备方法，其特征在于， 步骤a采用无血清高密度培养技术，产物chlym-1的表达量大于500 mg/L。
6. —种放射性同位素标记的抗体，为权利要求1或2所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人 源化抗体经放射性同位素标记获得。
7. 权利要求1或2所述抗HLA-DRIO的淋巴瘤特异性人源化抗体用于制备治疗恶性淋巴瘤 的药物或用于制备诊断恶性淋巴瘤的试剂。
8. 如权利要求7所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体的用途，其特征在于，所述 恶性淋巴瘤为非何杰金氏B细胞淋巴瘤。
9. 权利要求1或2所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体用于制备治疗自身免疫性 疾病的药物。
10. —种药物组合物，包括安全有效量的权利要求1或2所述的抗HLA-DR10的淋巴瘤特异 性人源化抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。
全文摘要
本发明涉及恶性淋巴瘤、自身免疫性疾病抗体药物的筛选及其制备方法和用途，公开了一种抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化抗体，其人和全人单克隆抗体及片段，及其放射性同位素标记抗体，包括重链及轻链，其中，重链含恒定区，重链可变区氨基酸序列为SEQID NO1，轻链含恒定区，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO2，重链及轻链通过二硫键相连。本发明获得了稳定高表达抗HLA-DR10的淋巴瘤特异性人源化、人及全人单克隆抗体(chlym-1单抗)的NSO及CHO工程细胞株，采无血清高密度培养技术，使得chlym-1表达量大于500mg/L，并揭示了上述单抗在治疗恶性淋巴瘤及自身免疫性疾病中的应用。
文档编号G01N33/577GK101525385SQ200810034400
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者健 倪 申请人:苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司