去免疫原性抗cd3抗体的制作方法

专利名称：去免疫原性抗cd3抗体的制作方法
相关申请本申请要求于2003年6月2日递交的美国临时申请60/475,155的优先权，其全部公开内容在此处引用作为参考。
背景1.技术领域本公开内容涉及基因工程抗体的领域。更具体而言，本公开内容涉及经结构改造而消除与HLA蛋白结合的抗CD3抗体，从而潜在地降低其免疫原性。
2.相关技术背景抗体为B淋巴细胞所产生并防护机体免于感染。抗体的基本结构由两条相同的多肽轻链和两条相同的多肽重链组成，其间通过二硫键相连。每条肽链上氨基端第一个结构域的氨基酸序列具有高度可变性，使得每一个体中存在广谱的抗体结合特异性。这些被称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。每条链的其他结构域的氨基酸序列则相对稳定，被称为重链恒定区(CH)和轻链恒定区(LH)。
抗原和抗体之间的作用是通过形成多种键和吸引力(如氢键、静电力以及范德华力)而发生。这些作用相加形成了可观的结合能量，使抗体能够与抗原结合。已知抗体结合的亲和力和强度影响其生理及病理特性。
基因工程技术的出现促生了生产无限量单一抗体(单克隆抗体)的多种途径，这些抗体取决于其同种型，具有不同程度的效应子功能。例如，某些鼠同种型(IgG1、IgG2)以及人同种型(特别是IgG1)能够有效的与细胞(如单核细胞、B细胞及NK细胞)上的Fc受体结合，从而激活这些细胞以释放细胞因子。此类抗体同种型也能够活化补体，导致局部或全身性炎症事件。鼠抗CD3抗体OKT3就是一种能够引起大量细胞因子释放、导致细胞因子释放症候群(CRS)的抗体。人CD3抗原由至少4条恒定的多肽链组成，它可以与T细胞表面的T细胞受体(TCR)非共价键结合，通常被称为CD3抗原复合物。当抗原与T细胞受体相结合时，CD3抗原复合物在T细胞活化中起到重要的作用。某些抗CD3抗体在缺乏抗原-TCR连结时也能活化T细胞，但这种活化也须依赖mAb的Fc部分与辅助细胞上Fc受体的相互作用。以交联T细胞上的CD3复合物。在抗CD3介导的T细胞活化中Fc相互作用的重要性，可以通过以下试验证实诸如OKT3等“促有丝分裂”的抗CD3抗体，在体外并不能刺激T细胞增殖，除非它们结合在允许CD3分子交联的塑料上或者与具有Fc受体的细胞相结合。
已证实针对T细胞受体复合物中的CD3ε信号分子的抗体为强大的免疫抑制剂。例如，能够识别T细胞受体CD3ε链上表位的小鼠IgG2a/k单克隆抗体OKT3已获准在全世界许多国家作为治疗急性同种异体移植排斥的免疫抑制剂使用。OKT3与CD3的结合导致了整个TcR复合物的包被和/或调整，进而介导TcR的阻断，这可能是同种型抗原和细胞介导的细胞毒作用受抑制的机制之一。
自1985年获批准以来，鼠OKT3抗体一直在治疗中使用。然而，由于该单抗的鼠源性，会发生显著的人抗鼠抗体(HAMA)反应(主要为抗个体基因型成分)，这严重限制了该抗体的用药潜力。当个体的T细胞对施用的抗体发生免疫反应时即引发了HAMA反应。T细胞随后募集B细胞产生特异的“抗-抗体”抗体。因此尽管HAMA反应是由B细胞产生抗小鼠抗体的抗体介导的，其发生依赖于引发T细胞反应。显然，很需要通过对此特别有用的抗体进行适当的人源化或其他重组DNA操作，以减弱或消除该HAMA反应，扩大抗体的应用范围。
已有几项技术被用于处理该HAMA问题，从而使得治疗用鼠源单克隆抗体在人体中的使用变为可能。这些方法中常用的之一，是向治疗用抗体(通常为啮齿动物来源)中导入大量与人抗体蛋白相同的序列片段。此类改造也常与对特定单氨基酸残基的改造相结合使用，这些单氨基酸残基处在被认为对保持抗体-抗原结合相互作用关键的位置上。鉴于在不同物种中抗体分子之间具有极高度的结构(及功能)保守性，对抗体而言这一过程是可行的。然而，对于那些在宿主物种(如人类)中可能并不存在其结构类似物的潜在治疗用蛋白质，这些过程并不具可行性。
术语“人源化抗体”用于描述以下分子，其中抗原结合位点的某些组分(称为互补性决定区)来自于非人物种，而该抗原结合位点的其他区域(称为构架区)来自于人抗体。该抗原结合位点也可以包含融合到人恒定结构域的完整的非人可变区(“嵌合”抗体)。由于抗体的首要功能是与其靶抗原相结合，以保留抗原特异性和亲和力的方式保存抗体的原始特征是重要的。然而不幸的是，非人源抗体的人源化对抗体-抗原相互作用(如抗原结合特性)具有不可预测的影响。这意味着在治疗应用中，可能每剂需要更多人源化抗体，从而导致更高的治疗花费以及潜在的发生不良事件的更大风险。此外，施用于某些个体时，纯人源以及人源化的抗体也可能诱发免疫反应或具有免疫原性。
根据另一种方法，使抗体对于某一给定物种不具或降低免疫原性。首先至少测定蛋白质的部分氨基酸序列，并鉴定该氨基酸序列中存在的一个或多个能与给定物种的T细胞发生反应的潜在表位。接下来，修饰该抗体的这一氨基酸序列，以去除至少一个鉴定的T细胞表位，从而降低该蛋白质或其部分暴露于给定物种的免疫系统时的免疫原性。与能够识别和结合可溶性抗原的抗体不同，T细胞必须通过特殊的抗原呈递细胞(APC，如树突细胞和巨噬细胞)的活性才能与其靶抗原作用。APC摄取外来抗原，并将其加工成为肽，这些肽类随后与HLA蛋白相结合并呈现在APC的表面。T细胞只能识别与HLA结合而“呈递”的抗原片段。在此处描述的被冠名“去免疫原性”的方法中，改变那些预计能有效结合HLA分子的抗体序列中的氨基酸，从而使其不再与HLA结合，而不能再刺激T细胞反应。缺失T细胞对抗原的反应等于降低或消除了HAMA反应。
发明概述本公开内容中所述的抗体识别CD3抗原复合物或干扰CD3抗原复合物的某一组分在细胞表面的表达。抗CD3抗体也被去免疫原性(即对某一给定物种的免疫原性减低或消失)。在一特别有用的实施方案中，去免疫原性通过以下途径完成首先至少部分测定该蛋白质的氨基酸序列，并鉴定该氨基酸序列中存在的一个或多个能结合给定物种的HLA蛋白质的T细胞潜在表位(“T细胞表位”)；接下来，修饰该抗体的这一氨基酸序列，以去除至少一个鉴定的T细胞表位，以降低该蛋白质或其部分暴露于给定物种的免疫系统时的免疫原性。
另一方面，本公开内容涉及生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤(a)构建表达载体，其所含DNA序列中具有编码至少部分去免疫原性的抗CD3抗体的序列；(b)用该载体转染宿主细胞；(c)培养转染的细胞系，以产生改造的抗体分子。
附图简述

图1A和1B分别显示了OKT3重链可变区(GenBank登录号A22261)以及轻链可变区(GenBank登录号A22259)完整的核苷酸及氨基酸序列。
图2以Hind III至Bam H1片段图解显示了重链及轻链可变区表达盒。
图3显示了鼠OKT3重链可变区完整的核苷酸(SEQ ID NO1)及氨基酸序列，包括鼠免疫球蛋白启动子、具5’端内含子和3’端为剪接供体位点(Bam H1)的鼠信号序列，图中注明了限制性酶切位点。
图4显示了鼠OKT3轻链可变区完整的核苷酸(SEQ ID NO3)及氨基酸序列，包括鼠源免疫球蛋白的启动子、具5’端内含子和3’端为剪接供体位点(Bam H1)的鼠信号序列，图中注明了限制性酶切位点。
图5A显示了载体APEX-13F4VHHuG2/G4Gamma4的示意图。
图5B显示了载体完整的核苷酸序列(SEQ ID NO5)，同时注明了位于非相关VH区域(标记为3F4VH)附近的hIgG4插入物的氨基酸及核苷酸序列。图中注明了信号序列、CH1、铰链区、CH2及CH3区的位置。
图6A显示了载体APEX-13F4VHHuG2/G4的示意图。
图6B显示了载体的核苷酸序列(SEQ ID NO7)以及G2/G4插入物的氨基酸及核苷酸序列。同时注明了信号序列、非相关Vh(此处标记为3F4Vh)、CH1、铰链区、CH2及CH3区的位置。
图7显示了重链表达载体pSVgptHuG2/G4的示意图。
图8显示了HuG2/G4片段的完整核苷酸序列(SEQ ID NO9)，该片段自APEX-13F4VHHuG2/G4载体切下，并经过修饰以便于插入pUC 19克隆载体所述修饰为在5’端加入Bam HI位点和来自人天然IgG4的5’非翻译内含子序列，并在3’端加入BgI II位点和来自人天然IgG4的3’非翻译序列。
图9显示了表达载体pSVgptHuCk的示意图，并注明了其轻链可变区及恒定区的位置。
图10显示了鼠OKT3重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO10)，以及实施例中构建的去免疫原性的几个重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNOS11-17)。
图11显示了鼠OKT3轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO18)，以及实施例中构建的两个去免疫原性轻链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNOS19及20)。
图12显示了用于诱变的寡核苷酸引物，利用该引物通过片段重叠PCR来诱导突变，从而构建设计的去免疫原性的序列。
图13显示了去免疫原性VH表达盒OKT3DIVKV1的核苷酸序列(SEQ ID NO21)以及氨基酸序列。
图14显示了去免疫原性Vk表达盒OKT3DIVKV1的核苷酸序列(SEQ ID NO23)以及氨基酸序列。
图15显示了将鼠OKT3及嵌合型OKT3与Jurkat、JRT3以及HPB-ALL细胞的结合。
图16及图17为显示去免疫原性的抗CD3抗体与HPB-ALL及JRT3细胞结合的表格。
图18、19、20及21显示了利用竞争性测定法测量去免疫原性的抗体相对于嵌合型OKT3及鼠OKT3抗体的亲和力的结果。
图22为总结去免疫原性抗体相对于鼠OKT3抗体的IC50的表格。
优选实施方案详述描述了去免疫原性抗CD3抗体。术语“抗CD3抗体”指识别CD3抗原复合物或与干扰CD3抗原复合物的组分在细胞表面呈现的任何抗体或功能性抗体片段。抗CD3抗体可以为重组或天然来源的。抗CD3抗体可以是人源的、非人源的、嵌合型或人源化的。抗CD3抗体为本领域技术人员所公知，包括例如名为“利用可识别TCR/CD3的试剂及可刺激T细胞表面辅助分子的配体来诱导T细胞群增殖的方法”的美国专利No.5,527,713；名为“利用可识别TCR/CD3的试剂及可刺激T细胞表面辅助分子的配体来诱导T细胞群增殖的方法”的美国专利No.6,352,694；名为“利用抗CD3抗体激活免疫系统的方法”的美国专利No.6,406,696；名为“利用抗CD3抗体促进免疫增强作用及制备抗体的方法”的美国专利No.6,143,297；名为“利用抗CD3抗体激活或增强免疫系统的方法”的美国专利No.6,113,901；名为“调节单克隆抗体的免疫抑制活性及毒性的方法和材料”的美国专利No.6,491,916；名为“CD3特异性的重组抗体”的美国专利No.5,929,212；名为“突变后无活性的IgG2结构域及含有该结构域的抗CD3抗体”的美国专利No.5,834,597；名为“诱导T细胞活化及增殖的抗CD3抗体-氨基右旋糖苷缀合物”的美国专利No.5,527,713；名为“短期抗CD3抗体刺激淋巴细胞以提高其体内活性”的美国专利No.5,316,763；名为“免疫球蛋白变异体”的美国专利No.5,821,337中所描述的抗体。上述专利中的每一则均在此处以其整体引用作为参考。
抗CD3抗体被去免疫原性。去免疫原性使抗CD3抗体对于某一特定物种不具备免疫原性或降低免疫原性。可以通过对抗CD3抗体的结构改造来完成去免疫原性。任何为本领域技术人员所公知的去免疫原性技术均可采用。一项合适的去抗体免疫原性的技术描述于例如发表于2000年6月15日的WO00/34317，其公开内容以其整体在此处引用。简言之，此处描述的为一般方法的一种典型方案，包括以下步骤1.测定该抗体或其部分(若只需对其中某部分进行修饰)的氨基酸序列；2.鉴定该抗体氨基酸序列中潜在的T细胞表位，可以采用以下任何方法，包括确定肽与MHC分子的结合、测定肽HLA复合物与T细胞受体(该受体来自即将接受该治疗性蛋白质的物种)的结合、利用转基因动物(该转基因动物含有即将接受该治疗性蛋白质的物种的HLA分子)测试该抗体或其中某部分，或测试用即将接受该治疗性蛋白质的物种的免疫系统细胞重建的转基因动物；3.通过基因工程或其他生产修饰抗体的方法改造抗体，以去除一个或多个潜在的T细胞表位，并生产该改造后的抗体以备测试；4.在步骤3中任选地改造抗体，以移除一个或多个潜在的B细胞表位；5.测试改造后已去除一个或多个潜在的T细胞表位(及任选的B细胞表位)的抗体，以鉴定保留了其全部或部分的所需活性、但丧失了一个或多个T细胞表位的经过修饰的抗体。此处“潜在的T细胞表位”定义为特异的肽序列，其预计或可以以合理的效率结合HLA II类分子(或非人物种中的等位体)；或可以肽HLA复合物的形式与T细胞受体紧密结合，其中T细胞受体来自于即将接受该治疗性蛋白质的物种；或先前或其他研究证明其具有通过存在于抗原呈递细胞表面的HLA II类分子的呈递而激活T细胞的能力，其中抗原呈递细胞来自于即将接受该治疗性蛋白质的物种。
这一去免疫原性的方法认识到对外来蛋白质有效的T细胞依赖性免疫应答需要免疫系统中细胞武器(cellular arm)的活化。此种应答要求抗原呈递细胞(APC)摄取治疗性(外来)蛋白质(即治疗性抗体)。一旦进入此类细胞，蛋白质即经过处理，其片段与MHC II类分子形成复合物，并呈递于细胞表面。一旦这样的复合物通过与来自T细胞的T细胞受体结合而被识别，T细胞在某些情况下可以被激活以产生刺激性细胞因子。这些细胞因子可以诱导B细胞分化为成熟的抗体产生细胞。此外，该T细胞应答也可能在患者体内介导其他有害的效应，如炎症和可能的过敏反应。
可以去除整个抗CD3抗体或仅其一部分(例如，抗CD3抗体的可变部分)的免疫原性。当抗CD3抗体为嵌合型抗体(如具有人恒定区的抗体)时，仅去除抗CD3抗体中一部分的免疫原性尤其有用。
此处使用的术语“抗体”包括全体多克隆和单克隆抗体、单链抗体，以及其他功能性抗体片段。综合看来，优选单克隆抗体。
一般来讲，此处公开的抗体构建，是使用在基因工程技术中应用的已经认可的操作而获得。例如，分离DNA、构建及选择表达DNA的载体、纯化及分析核酸、构建重组载体DNA的特定方法(如PCR)、利用限制性内切酶裂解DNA、连接DNA、通过稳定或瞬时的途径将DNA(包括载体DNA)转入宿主细胞、在选择性或非选择性培养基中培养宿主细胞以选择并保持表达DNA的细胞的技术均为本领域公知。
此处公开的单克隆抗体可以通过使用杂交瘤方法(Kohler等，Nature，256495，1975)或本领域众所周知的其他重组DNA方法得到。在杂交瘤方法中，用引发淋巴细胞产生抗体的蛋白质免疫小鼠或其他适合的宿主动物。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。产生的应答该抗原的淋巴细胞此后通过一种适当的融合剂(如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103页(Academic Press，1986))。随后在适当的培养基中接种并生长该杂交瘤细胞，该培养基中优选含有一种或多种能抑制非融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。优选的骨髓瘤细胞是可以有效融合、经选择抗体产生细胞而支持稳定的抗体生产，且对选择性培养基(如HAT基质)不敏感的骨髓瘤(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，Catalog No.H-0262)。其中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠骨髓瘤系，如来自MOPC-21及MPC-11小鼠肿瘤的那些(可获自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，以及SP-20、NS0或X63-Ag8-653细胞(可获自American TypeCulture Collection，Rockville，Md.USA.)杂交瘤细胞在选择性培养基(如HAT)中生长，扩增并测定存活的细胞以产生针对抗原的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过以下测定法测定，如免疫沉淀作用、放射性免疫分析(RIA)、流式细胞术或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
经确认杂交瘤细胞产生的抗体具备所需的特异性、亲和力和/或活性，这一克隆可通过有限稀释方法产生亚克隆，并以标准方法生长(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103页(AcademicPress，1986))。此外，杂交瘤细胞可以以腹水瘤的形式在动物体内生长。借助适当的常规免疫球蛋白纯化法将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中分离出来，所述分离方法如A蛋白-sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。编码单克隆抗体的DNA易于通过常规方法分离并测序(如通过使用能够特异结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是该类DNA的优选来源。一旦被分离，该DNA可以置于表达载体中，该载体随后被转染到宿主细胞(如E.coli细胞、或不另外产生免疫球蛋白的哺乳动物细胞)中，使单克隆抗体在重组宿主细胞合成。
也可以从噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段，所述抗体库通过McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中所描述的技术产生。其他出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10779-783，1992)生产高亲和力(nM范围)人抗体以及组合感染和体内重组作为策略构建大型噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266，1993)。因此，这些技术是除了传统单克隆抗体杂交瘤技术之外，用于分离抗原特异性单克隆抗体的可行选择。
另一方面，本公开内容提供了重组表达载体，其包含生产去免疫原性的抗CD3抗体所必需的合成的、基因组的或cDNA-来源的核酸片段。根据本公开内容，编码任何去免疫原性抗CD3抗体的核苷酸序列，均可被插入合适的载体中(该载体含有转录及翻译该插入的蛋白质编码序列所必需的元件)。任何合适的宿主细胞载体均可用于表达编码去免疫原性抗CD3抗体的DNA序列。可以采用细菌(如E.coli)及其他微生物系统；也可以采用真核生物(如哺乳动物)宿主细胞表达系统获取本公开内容中的抗体。合适的哺乳动物宿主细胞包括COS细胞以及CHO细胞(BebbingtonC R(1991)Methods 2 136-145)；以及骨髓瘤或杂交瘤细胞系(例如NSO细胞；Bebbington等，Bio Technology，10，169-175.1992)。
去免疫原性抗CD3抗体也可用作独立施用的组合物与治疗剂一起使用。出于诊断的需要，该抗体标记与否均可。不标记的抗体可以与其他标记抗体(第二抗体)组合使用，上述标记抗体能与去免疫原性抗CD3抗体反应，如与免疫球蛋白恒定区特异性抗体反应。或者，也可以直接标记去免疫原性抗体。可以使用很多不同的标记，如放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。可以使用多种类型的免疫测定法，这些方法均为本领域技术人员众所周知。
本发明去免疫原性抗CD3抗体可以以含有可药用载体的组合物施用于患者。可药用载体可以是任何适合向患者递送抗体的相容、无毒物质。载体中可以含有无菌水、醇类、脂肪、蜡质以及惰性固体。药物组合物中还可以含有可药用佐剂(缓冲剂、分散剂)。
抗体组合物可以通过多种途径施用于患者。药物组合物优选经肠胃外途径(如皮下、肌内或静脉内)施用。因此，用于肠胃外施用的组合物可以包括抗体、抗体片段或其混合物溶解于适当的载体(优选水性载体)的溶液。可以使用多种水性载体，如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液均为无菌且通常不含有颗粒物质。可以采用常规、为人熟知的灭菌技术将这些组合物灭菌。这些组合物中也可能含有为接近生理条件所需的可药用的辅助物质，如pH调节及缓冲剂、毒性调节剂之类，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些制剂中抗体或抗体片段浓度可以大不相同，例如以重量计从低于约0.5％，通常为或至少为约1％到多达15％或20％，根据所选的具体施用方式，主要基于液体体积、粘度进行选择。
制备肠胃外施用的组合物的实际方法以及就施用于受试者所必需的修饰，对本领域技术人员而言为公知且显而易见的，并在如《Remington’sPharmaceutical Science》，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa(1985)中有详细介绍，该书此处其以整体引用作为参考。
下列实施例是为了说明本发明，而不是对其进行限制。它们是可能采用的典型方案，也可采用其他本领域技术人员公知的方案。
实施例1去免疫原性、嵌合型抗CD3抗体制备一种去免疫原性、嵌合型抗CD3抗体。选择的可变区来源于已知的鼠抗-人CD3抗体OKT3。该可变区为去免疫原性的并与改造的人恒定区组合，以制备嵌合、去免疫原性抗CD3抗体。用于制备和测试嵌合、去免疫原性抗CD3抗体的方法如下。
鼠OKT3的重链和轻链可变区通过基因合成人工构建，其中使用重叠40mer的寡核苷酸和聚合酶链式反应。该抗体重链和轻链可变区的序列已经事先确定，并保存在GenBank数据库中(登录号分别为A22261和A22259，见图1)。通过PCR在5’端添加包括鼠免疫球蛋白启动子和带内含子的鼠信号序列的序列，在3’端添加含有剪接供体位点的序列，以形成作为Hind III至Bam HI片段的重链和轻链可变区的表达盒(见图2)。该表达盒的整个序列经确认无误。整个鼠OKT3重链和轻链表达盒的DNA及氨基酸序列分别如图3、图4所示。重链恒定区中经改造而含有人IgG2的一部分以及人IgG4的一部分(“HuG2G4恒定区”)。该恒定区制备如下首先，将编码来源于人IgG4的部分(CH2及CH3区的部分)的基因组DNA插入细菌载体质粒pBR322——E.coli类来源的质粒(ATCC 37017；Mandel，M.等，(1970)J.Mol.Biol.53，154)。通过用Hind III和Xho I限制性消化，将IgG4来源的插入物从质粒中释放出来。该插入物通过凝胶纯化、剪切，并经过进一步限制性分析，以确认已发表的人IgG4基因组DNA序列。单独的基因组IgG4插入物(Hind III/SmaI限制性内切片段；SmaI位点位于每一个插入物3’非翻译区中、距翻译终止位点3’端约30bp处)随后通过连接亚克隆入表达盒APEX-1，以形成APEX-1 3F4 VHHuGamma4(见图5)。进行DNA序列分析以确认人IgG4所需区域的正确序列。
以上程序也可以通过使用pBR322细菌质粒来完成，该质粒中带有编码人IgG2 CH1、铰链区和CH2第一部分的基因组DNA，该DNA经PmIII和Bst EII切下，亚克隆进APEX-1 3F4 VH HuGamma4，以替代相应的IgG4来源的序列。所产生的嵌合IgG2/IgG4人恒定区的序列如图6(APEX-1 3F4 VH G2/G4)所示。
修饰的G2G4恒定区的构建按如下修饰HuG2G4恒定区，以插入重链表达载体反应1中，扩增从HuIgG4恒定区(含有5’端BamH1位点的天然HuIgG4 5’内含子序列)的5’端至编码区起始处的序列。反应2中，从APEX-1 3F4 VH G2/G4载体中扩增HuG2G4编码序列(包括内含子)(从CH1起始端至CH3区末端)。反应3中，扩增来自CH3编码区末端的天然HuIgG43’序列的3’端，其中采用设计来导入3’BamH1位点的3’引物(该BamH1位点内含有一个BglII位点，而BglII位点中又含有一个EcoR1位点)。这3步反应的产物(相互重叠)，在4轮使用5’和3’引物的PCR反应进行联合。将联合起来的产物克隆入pUC19的BamH1位点中并确认修饰后的HuG2G4片段的DNA序列。用BglII和BamH1切下G2G4基因，产生5’具有BamH1、3’具有BglII的片段。将这一片段克隆入经BamH1切割的重链表达载体中。选择出具有以正确方向(5’端再形成BamH1位点，3’为杂化BamH1/BglII位点)插入恒定区的克隆(图7)。BamH1至BglII片段的完全序列如图8所示。可以直接以Hind III至BamH1片段克隆抗体可变区。
引物(SEQ ID NO77-83)TTGTGAGCGGATAACAATTTC M13-50反向GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA M13-40正向
CTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCCGTC G2G4-1CCCTTGGTGGAGGCTGCAAGAGAGG G2G4-2GAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGAGTGCC G2G4-3TCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGTG G2G4-4TACCCGGGGATCCAGATCTGAATTCCTCATGTCAC G2G4-6轻链恒定区为人κ链恒定区。其含在如图9所示的表达载体pSV hygHuCk中。
使用肽串线分析(peptide threading)软件(在2002年9月6日公布的WO 02/069232中详述)或其他计算机分析技术分析鼠抗CD3抗体OKT3可变区的氨基酸序列，以寻找其中潜在T细胞表位(MHC II类结合肽)。设计去免疫原性序列以去除潜在的T细胞表位，并尽可能仅作保守性的氨基酸变动。为了测试去除T细胞表位的可选性替代对抗体结合的影响，构建了几种版本去免疫原性的重链和轻链可变区，如图10和11中所示。
通过使用致突变的寡核苷引物(见图12)进行片段重叠PCR诱导突变，以鼠OKT3重链和轻链可变区盒为模板，构建设计的去免疫原性序列。以载体VH-PCR1和Vκ-PCR1(Riechmann等，1988)为模板，导入5’侧翼序列(包括前导信号肽序列、前导内含子和鼠免疫球蛋白增启动子)和3’侧翼序列(包括剪接位点、内含子序列)。合成包括欲改变区域的一系列致突变引物对，以便以一套片段扩增靶DNA序列。
设计邻近的寡核苷，使重叠序列至少为15bp。其数量取决于即将突变的位点数量。
通过以下反应物构建每个引物对的PCR扩增1μL模板DNA1μL(25pmol)正向引物1μL(25pmol)反向引物1μL 10mM dNTP5μL 10×Pfu聚合酶缓冲液0.5μL(1单位)Pfu DNA聚合酶加H2O至50μL除酶以外的所有反应物混合于0.5ml的薄壁PCR管中，并在PCR板上加热至94℃。加入酶后循环开始94℃/2分钟，15-20个循环的94℃/30秒钟、50℃/30秒钟、70℃/1分钟(取决于需要延伸的长度)，最后为75℃/5分钟。退火温度可能低于或高于50℃，视寡核苷的Tm而定。
每一步反应取5μL进行琼脂糖凝胶，以检查PCR是否产生了预期长度的产物。如果不是，将退火温度降低5℃，和/或增加PCR循环数，和/或升高MgCl2浓度至5mM。如果初次PCR产生了多重条带，则经凝胶纯化正确大小的条带。
仅使用第二轮5’和3’引物，在第二次PCR中将产物连接起来。原始模板中并不含有这一序列，因此只有诱变后的DNA才能在这一阶段被扩增。第二轮连接PCR的模板为第一轮中产生的片段。调整量，以加入大约相同的数量。第二轮PCR的反应物为第一轮PCR的产物2μL(50pmol)第二轮5’引物2μL(50pmol)第二轮3’引物1μL 10mM dNTP5μL 10×Pfu聚合酶缓冲液0.5μL(1单位)Pfu DNA聚合酶加H2O至50μL除酶以外的所有反应物混合于0.5ml的薄壁PCR管中，并在PCR板上加热至94℃。加入酶后循环开始94℃/2分钟，15个循环的94℃/30秒钟、50℃/30秒钟、75℃/1分钟(取决于需要延伸的长度)，最后为75℃/5分钟。
每一步反应取5μL进行琼脂糖凝胶，以检查PCR是否产生了预期长度的产物(VH表达盒约820bp，VK表达盒约650bp)。如果不是，将退火温度降低5℃，和/或增加PCR循环数，重复第二轮PCR。
PCR产物的剩余部分，以苯/氯仿抽提、乙醇沉淀，并用要求的酶(对于表达盒，通常为Hind III和BamH1)消化，并上样到1.5％的低熔点琼脂糖凝胶上。切下正确大小的DNA条带被并纯化。
将所产生的去免疫原性VH和Vk表达盒(图2)克隆入pUC19载体，确认每一个去免疫原性VH和Vk的全部DNA序列都是正确的。例如，去免疫原性的OKT3 VH和Vk表达盒OKT3 DIV H V1(版本1)和OKT3DIVK V1(版本1)的DNA及氨基酸序列，分别如图13及14所示。
以Hind III到BamH1表达盒的形似从载体pUC19中切下出去免疫原性的重链和轻链V区基因。这些被转移到表达载体pSVgpt HuG2G4和pSVhyg HuCk(分别如图7和图9)中，其分别含有前述的HuG2G4或人κ链恒定区，且具有在哺乳动物细胞中进行选择的标记。确认表达载体中去免疫原性VH及Vk的DNA序列的正确性。
初始的鼠OKT3重链和轻链可变区盒也转入上述表达载体pSVgptHuG2G4以及pSVhyg HuCk中，以产生具有连接人恒定区G2/G4构建体的鼠可变区基因的嵌合型抗体。因这一嵌合型抗体具有与去免疫原性抗体相同的效应子功能且使用相同的第二检测反应物，其被用作去免疫原性抗体结合试验的同种型匹配的对照。
用于抗体表达的宿主细胞系为NSO，一种不产生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤，得自欧洲动物细胞保藏中心，Porton UK(ECACC No 85110503)。通过电穿孔，将重链和轻链表达载体共转染入NSO细胞。通过以下步骤完成转染将待转染的DNA线性化以提高效率。分别制备约3到6mg的质粒pSVgpt HuG2/G4和pSV hyg HUCK的PvuI消化产物。经乙醇沉淀消化的DNA，溶解于50ml dH2O中。接受者NSO细胞再悬浮自75cm2的半汇合烧瓶(semi-confluent)内再悬浮，经1000rpm离心5分钟后收集。丢弃上清液。细胞再悬浮于0.5ml的DMEM中，并转移到Gene Pulser试管(Bio-Rad)中。轻轻吹吸，将DNA与细胞混匀，并冰浴5分钟。将试管插入Bio-RadGene Pulser的电极间并施加170V、960mF的单脉冲。随后将试管冰浴20分钟。将细胞悬浮液转移到含有20ml DMEM的75cm2烧瓶中并恢复1-2天。收获细胞并将其悬浮于80ml选择性DMEM中，且在96孔板上的每一孔中都加入200μL等分试样。选择性DMEM为Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中补充10％(v/v)胎牛血清、250μg/ml黄嘌呤、0.8μg/ml霉酚酸。在选择开始后10天左右，肉眼可见克隆。每一孔中取20μl培养基，测定其中是否存在人抗体。根据每孔内产生抗体的水平和细胞数目，选择进行扩增的孔。为了从指定孔中重悬浮细胞，用Gilson P200移液器(带黄色头)的头摩擦表面并将培养基转移到含有1.5ml新制的选择性DMEM的24孔组织培养板的孔中。将细胞扩展至25cm2或更大的组织培养烧瓶中，以便放掉液氮存积并提供用于抗体纯化和测试的培养基。
7个去免疫原性重链基因(图10)中的每一个都与2个去免疫原性轻链基因(图11)中的每一个配对，一共将产生14种去免疫原性的OKT3抗体。共转染嵌合型重链和轻链载体，以产生嵌合型抗体。使用选择性DMEM选出表达gpt基因的克隆。利用人IgG ELISA筛选产生人抗体的转染细胞克隆，步骤如下用1∶1000稀释于碳酸/重碳酸包被缓冲液(pH9.6)(Sigma CatC-3041)的绵羊抗人κ抗体(The Binding Site Cat NoAU 015)以每孔100μL包被ELISA平板(Dynatech Immulon2)。4℃下孵育样品过夜。经含有0.05％Tween20(RTM)的PBS溶液洗涤3次后，将转染物置于96孔平板，自每孔中取25μL培养基样品，转移到含每孔75μL PBS/Tween(PBST)溶液的检测板上进行筛选。转染细胞使用24孔板培养，第一孔中将12.5μL加入87.5μL，如此在整个平板上形成倍增稀释系列。所有测定中的空白孔只接受PBST。样品在室温下孵育1小时，用PBS/Tween溶液洗涤3次。按每孔100μL的量加入以1∶1000的比例稀释于PBS/Tween溶液中的第二抗体——过氧化物酶缀合的绵羊抗人IgGγ链特异性试剂(TheBinding Site Cat NoAP004)。再次在室温下孵育样品1小时，并用PBS/Tween溶液洗涤3次。为制备颜色底物，将1片(20mg)OPD(O邻苯二胺)(Sigma Cat NoP-7288)溶解于45ml水+5ml 10×过氧化物酶缓冲液中(用Sigma磷酸、柠檬酸缓冲片(pH5.0，Cat NoP-4809)配制10×过氧化物酶缓冲液)，且在使用前加入10ml 30％(w/w)的过氧化氢(Sigma CatNoH-1109)。每孔中加入100μL底物，并在室温下孵育5分钟或要求的时间。当出现颜色时，加入25μL 12.5％的H2SO4终止反应过程。在492nm处读取结果。所用的标准抗体为人IgG1/κ纯化的骨髓瘤蛋白质(TheBinding Site Cat NoBP078)。
扩增分泌抗体的细胞系，选择其中具有最高产量者。使用Prosep-A(Bioprocessing Ltd，Durham，UK)纯化去免疫原性及嵌合型抗体，步骤如下将产生抗体的NSO转染瘤细胞系生长于含DMEM 5％FCS的Nunc三层烧瓶中，每瓶250ml(总体积1L)，培养10-14天直至接近饱和。收集条件培养基，并在台式离心机中3000rpm离心5分钟以去除细胞。向细胞上清液中加入十分之一量的1M Tris-HCl(pH8)(Sigma CatT3038)，以制备这种0.1M Tris-HCl(pH8)。加入0.5ml Prosep A(Milipore Cat113111824)，并在室温下振荡过夜。通过3000rpm离心5分钟收集ProsepA并装入Biorad Poly-Prep柱(Cat731-1550)。用10ml PBS洗涤该柱，然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)在1ml级分中洗脱。每一级分均被收集入一支含100μL 1M Tris-HCl(pH8)(Sigma，同上)的试管。在280nm测量每一级分的吸收。合并含有抗体的级分并在室温下以PBS透析过夜。该制备物通过0.2微米注射过滤器滤过进行消毒，并测量其A280。经ELISA测定人IgG1κ浓度。
评估去免疫原性抗体与表达CD3的细胞的结合因为去免疫原性的过程中引入的突变可能影响抗体的特异性或亲和力，所以评估每一去免疫原性抗体与T细胞上CD3分子结合的能力。HPB-ALL(人外周血急性淋巴细胞白血病)系细胞可以获自Cell ResourceCenter for Biomedical Research，Tohoku University，Japan。Jurkat和J.RT3细胞系可以获自American Type Tissue Culture(ATCC)，Rockville，MD。这些细胞在37℃下，空气中含有5％CO2的湿化仓中，以2×105-2×106细胞/ml培养在RPMI 1640(Cellgro)，其中含有10％热活化的胎牛血清(Atlas Biologicals)、1％青霉素-链霉素、0.01M HEPES(Sigma)、0.2mM1-谷氨酰胺以及5×10-5M 2-巯基乙醇(Sigma)。HPB-ALL和Jurkat细胞的细胞表面具有高水平的TCR/CD3复合物，而J.RT3细胞是Jurkat系中不表达CD3的变体。通过免疫细胞化学和流式细胞术评估鼠OKT3、嵌合型OKT3和去免疫原性OKT3 G2/G4抗体制品与三种细胞系的结合。简言之，将106个细胞置于96孔板的单独的孔中，与1μg每种检测抗体或合适的人或鼠同种型对照在4℃下反应20分钟。随后用含2％胎牛血清(AtlasBiologicals)的PBS洗涤3次，随后在4℃下与藻红蛋白缀合的第二抗体(R-PE亲和纯F(ab)2山羊抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，Bar Harbor，Maine)反应20分钟，以检测嵌合型和去免疫原性抗体以及G2/G4独特型对照；与R-PE-缀合山羊抗小鼠IgG(Pharmingen)反应，以检测鼠OKT3以及鼠IgG2a同种型对照。如上用PBS-FBS洗涤细胞3次，随后再悬浮于PBS中，以便用流式细胞仪(FACs Calibur，BectonDickenson)分析。
嵌合型OKT3HuG2/G4κ抗体和鼠OKT3抗体与表达CD3的Jurkat和HPB-ALL细胞的结合能力相当，但没有表现与CD3阴性的细胞系J.RT3结合。匹配的鼠和人同种型对照没有显示与这些细胞类型中的任何一种结合(图15)。
也用使用HPB-ALL和J.RT3细胞的流式细胞术结合测定测试表达去免疫原性OKT3抗体的NSO细胞系的条件培养基。使用前述的ELISA操作，以用于人IgG的ELISA测定条件培养基中抗体的浓度。如上述实施免疫细胞化学和流式细胞术程序。组合去免疫原性OKT3轻链版本1的7种去免疫原性重链的结果示于图16。组合去免疫原性OKT3轻链版本2的去免疫原性重链的结果示于图17。已经证实很多去免疫原性OKT3抗体表现出与鼠及嵌合型抗体相当的HPB-ALL细胞结合能力。然而，有几种去免疫原性抗体与HPB-ALL细胞结合的水平显著降低(例如来自克隆24C12、48G3和55B2的抗体)。给定抗体与HPB-ALL细胞的结合能力，与其采用了哪种特定类型的κ轻链并无关系；即两条突变的κ链组合一些(并非全部)突变VH区在测定中显示相当的结能力。
比较鼠、嵌合型及去免疫原性OKT3抗体结合能力的竞争性测定为了获取多种去免疫原性抗体间的更多差别并确定它们相对于OKT3的结合亲和力，进行了竞争性结合测定。由于CD3是细胞表面蛋白质复合物的一部分，无法通过BIACORE分析对其亲和力进行测量，但可以用流式细胞术替代检测。鼠OKT3通过使用来自Perbio Science的EZ-LinkSulfo-NHS-LC生物素(目录号21335)，并依循生产商提供的方案进行生物素化。用逐渐递减量的抗体滴定HPB-ALL细胞，从而确定欲使用的生物素化OKT3的量。确定的合适的亚饱和浓度为每106细胞10ng生物素化抗体。所有实验中均使用这一浓度。第二种检测试剂为抗生物素蛋白FITC，Sigma目录号A2050。测试具有从100pg到1μg的不同稀释度待测(去免疫原性或嵌合型)抗体间的竞争。结果以最大荧光活性(通过缺乏阻断抗体的情况下生物素化鼠OKT3的结合而确定)的抑制百分比来表示，如图18、19、20和21所示。
结果表明，嵌合型OKT3抗体以及六种去免疫原性抗体OKT3DIVHv5至DIVHv7/DIVKv1以及OKT3DIVH5至DIVH7/DIVK2能够以与鼠抗体本身相同的效率或其2-3倍的效率与生物素化鼠OKT3抗体竞争结合。
贯穿本说明书，引用了多种出版物及专利公开文件。其教导及公开内容均在本申请中以整体引用作为参考，以期更完整地描述本发明相关领域的状况。
尽管此处已经说明了本发明的优选及其他实施方案，在不脱离以下权利要求所定义的本发明的范围内，本领域技术人员可以设想更多的实施方案。
权利要求
1.去免疫原性抗CD3抗体。
2.去免疫原性抗CD3抗体重链可变区，其含有选自SEQ.IDNO11、12、13、14、15、16和17的序列。
3.去免疫原性抗CD3抗体轻链可变区，其含有选自SEQ.ID NO19和20的序列。
4.一种方法，包括选择抗CD3抗体；且降低该抗CD3抗体对给定物种的免疫原性。
5.如权利要求4的方法，其中降低抗CD3抗体对给定物种的免疫原性的步骤包括a)确定至少部分的抗体氨基酸序列；b)在此氨基酸序列中鉴定一个或多个潜在的针对T细胞的表位(“T细胞表位”)，所述表位存在于给定物种的内源性蛋白质中；且c)修饰该氨基酸序列，以去除至少一个在步骤(b)中鉴定的T细胞表位，从而降低该抗体或其部分暴露于给定物种的免疫系统时的免疫原性。
6.一种方法，包括步骤(a)构建表达载体，其所含DNA序列包括编码抗CD3抗体的序列，而该抗体至少是部分去免疫原性的；(b)用该载体转染宿主细胞；并(c)培养转染的细胞系，以产生去免疫原性抗CD3抗体分子。
7.药物组合物，其中含有去免疫原性抗CD3抗体和可药用载体。
8.如权利要求7的组合物，其中去免疫原性抗CD3抗体含有包含选自SEQ.ID NO11、12、13、14、15、16和17序列的重链可变区。
9.如权利要求7的组合物，其中去免疫原性抗CD3抗体含有包含选自SEQ.ID NO19和20序列的轻链可变区。
10.包含施用抗CD3抗体的方法，其中抗CD3抗体含有改造的重链恒定区，所述重链恒定区具有来自一种或多种人IgG2抗体的第一部分和来自一种或多种人IgG4抗体的第二部分，且该抗体至少有部分为去免疫原性的。
11.如权利要求10的方法，其中至少抗体的轻链可变区为去免疫原性的。
12.如权利要求10的方法，其中至少抗体的重链可变区为去免疫原性的。
13.如权利要求10的方法，其中抗体的轻链和重链可变区均为去免疫原性的。
14.如权利要求10的方法，其中抗CD3抗体含有包含选自SEQ.IDNO11、12、13、14、15、16和17序列的重链可变区。
15.如权利要求10的方法，其中抗CD3抗体内含有包含选自SEQ.IDNO19和20序列的轻链可变区。
16.如权利要求10的方法，其中至少抗体的一部分为去免疫原性的，去免疫原性的方法包括以下步骤(a)确定该抗体至少部分的氨基酸序列；(b)鉴定氨基酸序列中一个或多个潜在的针对T细胞的表位(“T细胞表位”)，这些表位存在于给定物种的内源性蛋白质中；且(c)修饰氨基酸序列，以去除至少一个在步骤(b)中鉴定的T细胞表位，从而该抗体或其部分暴露于给定物种的免疫系统时的免疫原性，通过步骤(a)、(b)、(c)使抗体(或其一部分)对于给定物种不具备免疫原性，或降低其免疫原性。
17.编码去免疫原性抗CD3抗体的核酸。
18.根据权利要求17的核酸，其编码含有选自SEQ.ID NO11、12、13、14、15、16和17序列的抗体重链可变区。
19.根据权利要求17的核酸，其编码一个抗体重链可变区，含有选自SEQ.ID NO19和20序列的抗体轻链可变区。
20.药物组合物，其含有由权利要求17至19中任一核酸编码的抗CD3抗体和可药用载体。
全文摘要
去除识别或干扰CD3抗原复合物组分产生的抗体或功能性抗体片段的免疫原性。
文档编号C07K16/00GK1822857SQ200480020257
公开日2006年8月23日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年6月2日
发明者R·P·罗特尔, S·法斯－奈特, 邬大洋, F·J·卡尔, A·汉密尔顿 申请人:阿莱克申药物公司