专利名称：一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，尤其涉及ー种高灵敏性的应用RCA-PCR技术检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法。
背景技术：
柑橘冬生疫霉褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主范围广，为害柑橘生产严重，分布地域广的特点，且都可以带病果实、组织或无性繁殖材料进行远距离传播。我国柑橘种植区域分布广泛，近年来这些病原菌随着引进优质的种子苗木传人我国的几率越来越大。一旦该病传入，将对我国柑橘产业造成极大危害。柑橘冬生疫霉褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫霉褐腐病害是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的，随后在其他国家和地区也陆续发现。该疫病是侵染柑橘引起的是ー种毁灭性病害，侵染初期，果实表皮出现浅褐色变色，感染部位皮质坚硬，湿度适合时长出白色菌丝体。受害果实味苦、具腐臭味。中国的柑橘种植区域广泛，地理气候多祥，有适合病害发生的地区，故定殖可能性大。近距离传播方式有风雨、工具等传播途径，远距离传播主要以土壤、果实、繁殖材料进行传播。该病害一直持续困扰着意大利、葡萄牙等地的柑橘生产。目前针对疫霉属真菌的系统发育已有部分研究，针对柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的分子检测技术也有PCR检测的报道。2008年，张海峰等比较分析了冬生疫霉和其它疫霉的ITS序列，在此基础上设计了 I对检测冬生疫霉的特异引物751F/752R，该对引物可从冬生疫霉菌中扩增到一条长616 bp的DNA条带，而其它19种疫霉和其它真菌均无扩增条帯。其检测限度可达到每25 UL反应体系只需10 fg基因组DNA的水平，但带菌柑橘样品的扩增条带不特别明显。因此提供ー种更高灵敏性的检测方法，成了本领域内的研究热点。
发明内容
本发明提供了一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，该方法能够快速、灵敏的检测出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌，本发明提供的检测方法相比于传统的利用PCR扩增的检测方法，其灵敏性至少要高出10X49倍。实现本发明上述目的所采用的技术方案为一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，包括以下步骤(1)、在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29 DNA聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；(2)、将离心管用PCR仪在95°C下加热3_5min，然后迅速冰浴10_20min ；(3)、在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA聚合酶，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；(4)、将离心管置于PCR仪中，在30°C的条件下反应10_15h，反应结束后，将离心管在65°C条件下热浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或_20°C下低温保存；(5)、另取ー只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIBl、反义引物PHIB2、RCA反应产物以及TaqDNA聚合酶，然后将反应液离心至管底；(6)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；(7)、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应結果。步骤(I)中所述的phi29 DNA聚合酶缓冲液为10Xphi29 DNA聚合酶缓冲液，所加入的去离子水、phi29 DNA聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA之间的体积比为5. 9 :1 :0. 5 05 :1，其中正义引物PHIBl和反义引物PHIB2的浓度均为IOii M，目标物DNA的浓度为100-200 ng/U I ;步骤(3)中加入的dNTPs混合物、BSA、phi 29 DNA聚合酶与目标物DNA的体积比为0. 5 :0.1 :0. 5 :1，其中dNTPs混合物的浓度为
2.5mM each, BSA的浓度为1%，phi 29 DNA聚合酶的浓度为IOU/y I。步骤(2)中将离心管用PCR仪在95°C下加热3min，然后迅速冰浴15min。步骤(5)中加入的组分为灭菌去离子水、PCR缓冲液、浓度为2. 5mM each的dNTPs混合物、浓度为1011|1的正义引物？11181、浓度为1011|1的反义引物？11182、1^^反应产物以及浓度为5U/U I的TaqD NA聚合酶，各物质之间的体积比为18 :2. 5 1 1 1 1 :0. 5。步骤(6)中扩增的程序为94°C3min,94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循环 32-36次，最后72°C补时5min。本发明提供的检测方法首先对总DNA进行RCA扩增，RCA有着优越的信号放大功能，是PCR技术的ー种补充发展。滚环扩增(RCA)不仅能直接扩增特定的DNA，实现这些靶核酸的信号放大，而且扩增是在恒温下实现的，条件比较温和。利用滚环扩增技术扩增DNA，通过对Pg数量级的微量模板进行滚环扩增，可以得到mg数量级的高质量扩增产物。在单独的PCR扩增中，将多次稀释后的菌丝总DNA作模板，即使以前ー轮PCR产物作为模版连续进行PCR扩增，也不能扩增目的片段，因为模板DNA分子太少，第一次PCR不能获得任何結果。而本发明中，首先进行的RCA扩增为后续的PCR扩增提供了足够数量的DNA模版保证，使得RCA-PCR比单独的PCR更加灵敏。同时在本发明中，由于线性双链DNA分子取代了传统意义上RCA扩增的环状双链DNA分子，因此本研究不是严格意义上的DNA滚环复制，而仅仅是利用了 phi29 DNA聚合酶的超强DNA链替换活性和聚合活性，在室温下完成DNA合成反应。phi29 DNA聚合酶还具有自行修复矫正的功能，因此不会影响DNA序型的保真性。本发明提供的RCA-PCR检测方法操作简便、快速，灵敏度高、重复性好，能够作为ー种病原菌的理想的理想的病原菌检测手段。
图1为本发明的实施例1中的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。本实施例中菌种柑橘冬生疫霉褐腐病原菌(Phytophthora hibernalis Carne)购自美国ATCC菌种保藏中心，编号为32995 ，并严格按照检疫危险性菌种进行操作与使用。使用前经过DNA的PCR扩增、克隆和测序的验证。本实施例中目标物DNA的提取方法如下将100 U I浓度为IO7孢子悬液涂布于铺有灭菌玻璃纸的PDA和V8平板上，18°C下培养7-10天，刮取菌丝冷冻备用。取0. 5g菌丝，置于离心管中，加2ml己预热(65°C)的CTAB提取缓冲液中，将离心管颠倒混匀，65°C水浴5min,轻轻混勻;加入等体积的苯酹:氯仿:异戍醇(25:24:1),混勻，12000r/min离心15min，取上清液于离心管中，再加入等体积氯仿异戊醇(24:1)混匀，12000r/min离心15min，取上清液于离心管中，加入2倍体积的100%こ醇颠倒混匀，12000r/min离心lOmin，倾去上清液，用70%こ醇将沉淀洗涤两次。洗涤结束后将含有DNA的离心管置于37°C温箱中干燥。干燥后加30 Ul TE溶解沉淀，于-20°C保存备用。以下实施例中正义引物PHIBl的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示5’ -TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3’ ；反义引物 PHIB2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示5’ -CTTCCACAACCAATTCCATTATGC-3实施例1本实施例中RCA反应体系的总体积为10 ill。具体检测方法如下(I)在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水5.9iil、10Xphi29 DNA聚合酶缓冲液I yl、浓度为10 y M的正义引物PHIBl体积0. 5 u1、浓度为10 ii M的反义引物PHIB2体积0. 5 以及浓度为200ng/ul的目标物DNA体积I yl，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；(2)、将离心管用PCR仪在95°C下加热3min，然后迅速冰浴15min ；
(3)、在离心管中依次加入浓度为2. 5mM each的dNTPs混合物0. 5 y1、浓度为1%的BSA 0.1 ill及浓度为10 U/ ill的phi29 DNA聚合酶0. 5 y 1，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；(4)、将离心管置于PCR仪中，在30°C的条件下反应llh，反应结束后，将离心管在65°C条件下热浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或_20°C下低温保存；(5)、另取ー只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水18iU、10XPCR缓冲液2. 5 ii1、浓度为2. 5mM each的dNTPs混合物I y1、浓度为10 y M的正义引物PHIBl体积I U1、浓度为10 y M的反义引物PHIB2体积I ii 1.RCA反应产物I y I以及浓度为5U/ U I的TaqDNA聚合酶0. 5 U I，然后将反应液离心至管底；(6)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C下3min，94°C下30S，62°C下30S，72°C下30S，循环36次，最后72°C下补时5min，扩增后得到PCR反应产物；(7)、PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭溶液染色20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应結果，在琼脂糖凝胶上可以观察到仅有一条特异性的DNA片段(407bp)。将IiU RCA反应液进行稀释，经过测试，稀释到416倍后还能扩增明显的DNA条带，具有极高的灵敏性，如图1所示，图1中，泳道1:冬生疫霉菌+水；泳道2-11为逐渐稀释后的RCA反应液+PHIB，泳道11中RCA反应液稀释到416倍后还能扩增明显的DNA条带。实施例2
本实施例中RCA反应体系的总体积为10 ill。具体检测方法如下(I)在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水5.9iil、10Xphi29 DNA聚合酶缓冲液I yl、浓度为10 y M的正义引物PHIBl体积0.5 yl、浓度为1011|1的反义引物？11182体积0.5111以及浓度为110ng/ul的目标物DNA体积I yl，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；(2)、将离心管用PCR仪在95°C下加热5min，然后迅速冰浴18min ；(3)、在离心管中依次加入浓度为2. 5mM each的dNTPs混合物0. 5 y1、浓度为1%的BSA 0.1 ill及浓度为10 U/ ill的phi29 DNA聚合酶0. 5 y 1，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；(4)、将离心管置于PCR仪中，在30°C的条件下反应15h，反应结束后，将离心管在65°C条件下热浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或_20°C下低温保存；(5)、另取ー只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水18iU、10XPCR缓冲液2. 5 ii1、浓度为2. 5 mM each的dNTPs混合物I y1、浓度为10 y M的正义引物PHIBl体积I U1、浓度为10 ii M的反义引物PHIB2体积I ill、RCA反应产物I y I以及浓度为5U/U I的TaqDNA聚合酶0. 5 U I，然后将反应液离心至管底；
(6)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C下3min，94°C下30S，62°C下30S，72°C下30S，循环36次，最后72°C下补时5min，扩增后得到PCR反应产物；(7)、PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭溶液染色13min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果，在琼脂糖凝胶上可以观察到仅有一条特异性的DNA片段(407bp)。将IiU RCA反应液进行稀释，经过测试，稀释到416倍后还能扩增明显的DNA条带，具有极高的灵敏性。
氨基酸序列表
<110>中华人民共和国湖北出入境检验检疫局
<120>:-种高灵敏性捡测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法
<160> 2
<210> 1<211> 22<212> DNA
<213>人工序列<400> 1
tcaggtctiia uctagtagtc tt22
<210> 2<21!> 24<212> DNA
<213>人工序列<400> 2
cttccacaac caattccatt atgc 2权利要求
1.一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)、在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29DNA聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底； (2)、将离心管用PCR仪在95°C下加热3-5min，然后迅速冰浴10_20min； (3)、在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29DNA聚合酶，混合均匀后离心，将反应液离心至管底； (4)、将离心管置于PCR仪中，在30°C的条件下反应10-15h，反应结束后，将离心管在65°C条件下热浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或_20°C下低温保存； (5)、另取ー只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、RCA反应产物以及TaqDNA聚合酶，然后将反应液离心至管底； (6)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物； (7)、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应結果。
2.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于步骤(I)中所述的phi29 DNA聚合酶缓冲液为10Xphi29 DNA聚合酶缓冲液，所加入的去离子水、phi29 DNA聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA之间的体积比为5.9 :1 :0. 5 :.05 :1，其中正义引物PHIBl和反义引物PHIB2的浓度均为10 y M，目标物DNA的浓度为100-200 ng/u I ;步骤(3)中加入的dNTPs混合物、BSA、phi 29 DNA聚合酶与目标物DNA的体积比为0. 5 :0.1 :0. 5 :1，其中dNTPs混合物的浓度为2. 5mM each, BSA的浓度为1%，Phi 29 DNA聚合酶的浓度为IOU/yl。
3.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于步骤(2)中将离心管用PCR仪在95°C下加热3min，然后迅速冰浴15min。
4.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于步骤(5)中加入的组分为灭菌去离子水、PCR缓冲液、浓度为2. 5mM each的dNTPs混合物、浓度为IOuM的正义引物PHIBl、浓度为10 ii M的反义引物PHIB2、RCA反应产物以及浓度为5U/ U I的TaqDNA聚合酶，各物质之间的体积比为18 :2. 5 1 1 1 1 :0. 5。
5.根据权利要求1所述的检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于步骤(6)中扩增的程序为94°C 3min,94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循环 32-36 次，最后 72°C补时5min。
全文摘要
本发明提供了一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，包括以下步骤首先在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；将离心管加热后迅速冰浴；在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA 聚合酶，制得RCA反应产物；另取一只无菌离心管，进行PCR扩增，扩增后得到PCR反应产物；最后检测PCR产物的结果。该方法能够快速、灵敏的检测出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌，本发明提供的检测方法相比于传统的利用PCR扩增的检测方法，其灵敏性至少要高出10×49倍。
文档编号C12Q1/04GK103060448SQ20121058342
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者王振华, 张建坤, 李凤新, 曾宪东 申请人:中华人民共和国湖北出入境检验检疫局