专利名称：重组丝氨酸蛋白酶抑制子、真菌表达载体及其杀虫真菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的丝氨酸蛋白酶抑制子，具体地说涉及含有真菌的分泌型信号肽和昆虫丝氨酸蛋白酶抑制子serpin序列的重组蛋白。
本发明涉及表达上述重组蛋白的真菌表达载体。
本发明还涉及表达上述重组蛋白的杀虫真菌剂。
技术背景
真菌是控制自然界昆虫种群数量的主要因素之一，以其为主要活性成份的生物农药已在我国、欧美及非洲得到广泛应用(冯明光，《植物保护21世纪展望暨第三届全国青年植物保护科技工作者学术研讨会论文集》，1998)。但生物农药，包括细菌、病毒及真菌类杀虫剂均存在击倒害虫时间过长和防效不稳定等缺点，因此如何提高这些生物类杀虫剂的效率，并研究其作用机理已成为该领域的一个研究重点。
在真菌侵染宿主的过程中，昆虫会利用自身的防御系统抵御真菌的侵入。昆虫体壁可以为其提供物理屏障，自身的免疫系统则可识别入侵的病原体，免疫细胞附着在病原体表面，吞噬病原体，形成黑色素。此外免疫系统还会产生大量的抗菌蛋白，抑制真菌的生长。研究者们以果蝇为模式生物，深入研究了昆虫的免疫反应。果蝇的免疫系统包括三个反应，体液免疫，由脂肪体产生一系列的抗菌肽，吞噬及黑化。果蝇受到免疫胁迫时产生的抗菌月太包括 Drosomycin、Metchnikowin、Defensin、Attacin、Cecropin、Drosocin 和 Diptericin,其中Drosomycin、Metchnikowin和Cecropin对真菌有抑制作用。研究表明， 果蚬在受到真菌胁迫时会激活spjitzle/Toll/cactus信号途径(Toll途径)(Schneider DS et al. , Genes Dev, 1991, 5:797-807),其中 spjitzle 是 Toll 的配体，由丝氨酸蛋白酶活化。spjitzle与Toll结合活化该途径,导致I κ B-1ike蛋白和Cactus蛋白的降解和 NF-K B-like、Dorsal和Dif的核转位，从而激活相关基因的表达(Nicolas E et al. , J Biol Chem, 1998，273:10463-10469)。该途径中的 Toll、sp^itzle、Tube 或 Pelle 发生突变，均会导致抗真菌肽Drosomycin的表达降低，昆虫对真菌感染高度敏感(Lemaitre B et al. ,Cell, 1996, 86:973 - 83)。利用烟曲霉/應抱子分别处理 Toll突变体果蝇和野生型果蝇，突变体果蝇在2 - 3天后全部死亡，而野生型果蝇在处理6 天后，仅有1/3死亡。分析显示,在Toll突变体中，抗真菌蛋白Drosomycin的表达显著降低(Lemaitre B et al. ,Cell, 1996，86:973 - 83)。上述研究表明，Toll信号途径是昆虫受到真菌侵染时的主要信号途`径，阻抑该途径会造成昆虫对真菌病原体的抵抗力降低。因此，该途径成为菌株遗传改良的潜在靶标，但目前还没有相应的报道
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的一个目的在于提供一种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，其含有来源于真菌的分泌型信号肽和来源于昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制子，具有抑制昆虫免疫反应和提高杀虫真菌毒力的特性，以解决昆虫病原真菌侵染效率低的问题。
本发明的另一个目的在于提供含有上述核苷酸序列的表达载体。
本发明的再一个目的在于提供产生本发明蛋白的杀虫真菌剂。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，其特征在于，采用分子生物学技术构建一个重组核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌如几丁质酶的信号肽序列与编码果蝇的丝氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
所述重组丝氨酸蛋白酶抑制子的构建方法，包括如下步骤I)果蚬serpin基因的克隆在果蝇的serpin基因中(NM_080112)，有一个内含子，利用PCR互搭的方法去除内含子；分别以P1/P2，P3/P4为引物；引物序列如下Pl: 5’ -GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3’,下划线序列为 EcoRI 位点； P2: 5’ -GGGGTACGAACTTGGCATAGGAAGCTGCCGAGGCC-3’ ；P3: 5’ -GGCCTCGGCAGCTTCCTATGCCAAGTTCGTACCCC-3’ ；P4: 5’ -CCCGGGTTAGACGCTCATGGGCGTGGGAT-3’,下划线序列为 SmaI 位点；果蝇基因组DNA为模版，用Phusion DNA聚合酶(NEB)扩增serpin基因的N端和C端 (以内含子为分割点)；反应体系5 μ L 5XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP,上下游引物各 I μ L( 10 μ m), 0. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,总体积 25PCR 反应参数98°C (2 min) ;30 个循环98°C (20 s)，56°C (30sec), 72 (Imin)， 72°C (5 min)；分别回收N端(1222bp)和C端(139bp)片段，进行无引物组装；反应体系5 μ L 5 XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP, N端片段(50ng), C 端片段(50ng)，O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,总体积 25 μ L ；以上述组装产物为模 版，以Pl和Ρ4为引物扩增全长的serpin cDNA序列，克隆进 pEASY-Blunt载体(全式金产品)；测序正确的载体命名为pEASY-serpin ；2)融合基因的构建设计引物P5-P7,构建Bbsp: serpin的融合基因；引物序列如下P5: 5，-TCTAGAGAGCTCATCGCTTGGCAACG-3，，下划线序列为 XbaI 位点；P6: 5，-AAAAAAGCGGCCGCATGGCTCCTTTTCTTCAAACC-3，，下划线序列为 NotI 位点；P7: 5’ -GGACTAGTGCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’，下划线序列为 SpeI 位点；以球孢白僵菌CZfeawreria Bassiana)基因组为模版，用P6和P7扩增球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchitl的信号肽，克隆进pGEM-T载体(Promega),测序验证，获得载体 pGEM-Bbsp ；以pEASY-serpin为模版，用P4与P5扩增serpin基因的成熟蛋白区域，克隆进 pGEM-T 载体，得 pGEM-serpin ；NotI 与 SpeI 双酶切 pGEM-Bbsp，回收 Bbsp 片段(90bp) ；XbaI 与 SmaI 双酶切 pGEM-serpin,得 serpin 成熟区域片段(1362bp)。
进一步，一种重组蛋白的真菌表达载体，将上述Bbsp (90bp)与serpin (1362bp)共同构建进pUC-Pgpda-TtrpC,得pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC载体，其具有融合蛋白 Bbsp: serpin的表达原件,上游含有一个真菌组成性启动子Pgpda,下游含有一个终止子 TtrpC0
再进一步，本发明还提供一种重组蛋白的杀虫真菌剂，将上述的载体 pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 用 XbaI 单酶切，，得融合蛋白 Bbsp: serpin 的表达原件 Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 片段(4. 4kb),构建进真菌表达载体 pK2_BAR:GFP,得 pK2_BAR:G FP-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC质粒并转入根癌农杆菌LBA4404 ;利用根癌农杆菌介导的遗传转化法得到组成性表达Bbsp: serpin的杀虫真菌转化子。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果本发明中，丝氨酸蛋白酶抑制子serpin参与了 spjitzle/Toll/cactus级联反应的调节。serpin可以抑制降解spjitzle丝氨酸蛋白酶的活性,使spjitzle保持完整,从而阻抑该信号途径。研究表明，在野生型果蝇中，当有病原体侵染时，spatzle被蛋白酶裂解成活性形式，但在丝氨酸蛋白酶抑制子基因serpin (Spn43AC)的突变体中，spjitzle—直处于活化状态，抗真菌肽Drosomycin组成性表达(Levashina EA et al. , Science, 1999, 285:1917 - 1919)。因此，serpin能负调控昆虫的免疫反应，在真菌侵染宿主的过程中产生 serpin则可提闻真菌对抗宿主免疫系统的能力，从而提闻真菌的杀虫效果。
本发明通过在杀虫真菌中表达融合蛋白Bbsp: serpin,使真菌在侵染宿主的过程中分泌产生serpin，抑制宿主的Toll信号通路，从而抑制昆虫的免疫反应，增强真菌的增殖速度，缩短真菌击倒害虫的时间。目前还没有针对宿主免疫反应进行菌株改良的报道，因此本发明取得的成功既可为害虫的防治提供高毒力菌株，也可以为菌株改良提供一个新的思路。
本发明所获得的重组丝氨酸蛋白酶抑制子，可以抑制昆虫的免疫反应，增强真菌在血腔中的增殖速度，从而提闻杀虫真菌毒力的特性，提闻真菌的杀虫效果。
本发明提供的转重组丝氨酸蛋白酶抑制子基因的球孢白僵菌转化菌株；毒力分析结果证明，转化子的毒力较对照有明显的提高；转化子在昆虫血腔中增殖速度较野生型菌株有显者的提闻。
图1是Serpin N端的70个氨基酸序列；其中箭头所示为推测的信号肽酶切割位
图2是本发明融合基因Bbsp: serpin的质粒图谱。
图3是本发明Bbsp: serpin的真菌表达载体图谱。
图4是本发明的Bbsp: serpin的球孢白僵菌转化子PCR验证。
图5是野 生型菌株和转基因菌株在昆虫血腔中的增殖情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
—种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于真菌几丁质酶的分泌型信号肽与来源于昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制子融合而成。所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌iBeauveria bass ana)的几丁质酶信号肽(以下简称Bbsp)与来源于果蚬 {Drosophila )的丝氨酸蛋白酶抑制子(以下简称serpin)融合而成。
进一步，编码本发明重组丝氨酸蛋白酶抑制子的核苷酸序列含有编码来源于真菌的几丁质酶基因的信号肽与编码来源于昆虫丝氨酸蛋白酶抑制子的基因。采用分子生物学技术构建了一个重组核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌iBeauveria bassiema)质酶的信号肽序列与编码果蝇的丝氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
另外，本发明还提供一种杀虫真菌转化菌株，用本发明构建的质粒载体转化杀虫真菌而获得可表达本发明重组蛋白的杀虫真菌转化菌株，其中杀虫真菌可以是球孢白僵菌iBesuveria bassiana)、金龟子绿僵菌(ifetarhizium anisopIiae)、黄绿绿僵菌 (Me tarhi zi um fl avoviride)、布氏白僵菌(.Beauveri a brongni artii )> 玫烟色拟青霉 {Paecilomyces fumosoroseus )、汤普森被毛抱(.Hirsu tella thompsoni )或粉拟青霉 (Paecilomyces farinosus)等。还构建了球孢白僵菌转化菌株。
以下具体实施中，所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
—、丝氨酸蛋白酶抑制子serpin的克隆及真菌表达载体构建。
实施例11.果蚬serpin基因的克隆在果蝇的serpin基因中(NM_080112 )，有一个内含子，利用PCR互搭的方法去除内含子。分别以P1/P2，P3/P4为引物。载体构建过程中的引物序列如下Pl: 5’ -GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3> (下划线序列为 EcoRI 位点)； P2: 5’ -GGGGTACGAACTTGGCATAGGAAGCTGCCGAGGCC-3’ ；P3: 5’ -GGCCTCGGCAGCTTCCTATGCCAAGTTCGTACCCC-3’ ；P4: 5，-CCCGGGTTAGACGCTCATGGGCGTGGGAT-3，(下划线序列为 SmaI 位点)，P5: 5’ -TCTAGAGAGCTCATCGCTTGGCAACG-3，(下划线序列为 XbaI 位点)；P6: 5’ -AAAAAAGCGGCCGCATGGCTCCTTTTCTTCAAACC-3’ (下划线序列为 NotI 位点)；P7: 5’ -GGACTAGTGCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3，(下划线序列为 SpeI 位点)；P8 :5’ -TCCAATTGCTTCCGATCTGG-3’。
果蝇基因组DNA为模版，用Phusion DNA聚合酶(NEB)扩增serpin基因的N端和 C 端(以内含子为分割点)。反应体系5 μ L 5XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L2.5 mM dNTP,上下游引物各 IyL (10 μ m), O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,总体积 25 μ L0 PCR 反应参数98°C (2 min) ;30 个循环98°C (20 s)，56°C (30sec), 72 (Imin) ; 72°C (5 min) 分别回收N端(1222bp)和C端(139bp)片段，进行无引物组装。 反应体系5 μ L 5 XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP, N 端片段 (50ng),C 端片段(50ng), 0. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,总体积 25 μ L。以上述组装产物为模版，以 Pl和P4为引物扩增全长的serpin cDNA序列，克隆进pEASY-Blunt载体(全式金公司产品)。测序正确的载体命名为pEASY-serpin。
2.融合基因的构建设计引物P5-P7,构建Bbsp: serpin的融合基因。以球抱白僵菌iBeauveria Bassiana) 基因组为模版，用P6和P7扩增球孢白僵菌几丁质酶BbchitKGenebank登录号AY145440) 的信号肽，克隆进PGEM-T载体，测序验证，获得载体pGEM-Bbsp ；以pEASY-serpin为模版， 用P4与P5扩增serpin基因的成熟蛋白区域(去除了 N端23个自身信号肽，信号肽的分析见图1)，克隆进 pGEM-T 载体,得 pGEM-serpin; NotI 与 SpeI 双酶切 pGEM-Bbsp,回收 Bbsp 片段(90bp);XbaI 与 SmaI 双酶切 pGEM-serpin,得 serpin 成熟区域片段(1362bp)。将 Bbsp 与 serpin 共同构建进pUC-Pgpda-TtrpC,得pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC载体，如图 2 所不。XbaI 单酶切 pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 载体，回收 Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 片段(4. 4kb),构建进 pK2_BAR:GFP 载体，得 pK2_BAR:GFP-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 质粒并转入根癌农杆菌LBA4404，其质粒图谱见图3。
3.真菌遗传转化及鉴定利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法将上述表达原件转化进球孢白僵菌野生型 Bb0062菌株(球抱白僵菌{Poauvoria bassi ana ) Bb0062分离自感染的菜青虫(/Yeri1S ra/κθ，保存于西南农业大学生物技术中心，也可以从公知途径获得，例如CCTCC AF93297 或从其它途径分离得到)。以引物P8和P4验证球孢白僵菌转化子，反应体系12.5 UL2X Taq mixture, 上下游引物各I μ L (10 μ m)，50ng基因组DNA，加水补至25yI^PCR 反应参数94°C (5 min) ; 32 个循环94°C (30 s)，56°C (30sec), 72 (2min) ; 72°C (5 min),预期片段大小1.9kb。1. 2%琼脂糖电泳检测，结果如图4所示。
M, MBI 公司的 X/Eco911 15 ；C,以 pK2-BAR:GFP-Pgpda_Bbsp: serpin-Ttrp C质粒为模版的阳性对照；WT，以球孢白僵菌野生型菌株DNA为模版；58 67，不同的 Bbsp: serpin转化子。结果显示,58,63,67转化子与阳性对照有相同大小的条带,表明均有目的基因的转入。
二、转化子的毒力测定实施例2O. 05%的无菌Tween-80收集野生型球孢白僵菌和Bbsp: serpin转化子的孢子，润旋，四层擦镜纸过滤，离心，调节孢子终浓度I X IO8 5 X IO6个/mL。将配制好的孢子悬液采用体表接种的方法接种大蜡螟，以O. 05% Tween-80为空白对照。结果表明与野生型菌株相比，在接种后96h，serpin转化子的半致死浓度降低了 3. 5倍，即在该条件下，转化子只需不到野生型菌株1/3的浓度即可达到与野生型相同的杀虫效果；在5X IO6个/mL的孢子浓度下浓度下，半致死时间缩短了 14%。该结果表明，通过在杀虫真菌中超量表达serpin可以显著提高菌株的杀虫效果。
三、真菌在昆虫血腔中的增殖观察实施例3
以O. 85%的NaCl准备野生型菌株和转基因菌株的孢悬液(I X IO7个/ml)，以大蜡螟为试虫，每只虫注射4μ L的孢悬液，置于26°C饲养。每隔12h取血淋巴观察虫菌体的数量。 结果如图5所示，与野生型菌株相比，转基因菌株(serpin菌株)在昆虫血淋巴中的增殖速度得到显著提高。昆虫为家蚕，A，接种O. 85% NaCl ;B，接种I X IO7个/ml球孢白僵菌野生型菌株；C,接种IXlO7个/ml Bbsp: serpin转球孢白僵菌菌株。图示为接种后36h的观察结果。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精 神，这些改变和变形均应属于所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，其特征在于，采用分子生物学技术构建一个重组核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌Uiemvoria bassiana )几丁质酶的信号肽序列与编码果蝇的丝氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述重组丝氨酸蛋白酶抑制子的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 1)果蚬serpin基因的克隆 在果蝇的serpin基因中(NM_080112)，有一个内含子，利用PCR互搭的方法去除内含子；分别以P1/P2，P3/P4为引物；引物序列如下 Pl: 5’ -GAATTCATGGCGAGCAAAGTCTCGATCCTTCTCCTGC-3，,下划线序列为 EcoRI 位点； P2: 5’ -GGGGTACGAACTTGGCATAGGAAGCTGCCGAGGCC-3’ ；P3: 5’ -GGCCTCGGCAGCTTCCTATGCCAAGTTCGTACCCC-3’ ； P4: 5，-CCCGGGTTAGACGCTCATGGGCGTGGGAT-3，(下划线序列为 SmaI 位点)， 果蝇基因组DNA为模版，用Phusion DNA聚合酶(NEB)扩增serpin基因的N端和C端；反应体系5 μ L 5XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP,上下游引物各 Ιμ (ΙΟμπι), O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,总体积 25 μ L ； PCR 反应参数98°C (2 min) ;30 个循环98°C (20 s)，56°C (30sec), 72 (Imin)，72°C (5 min)；分别回收N端(1222bp)和C端(139bp)片段，进行无引物组装；反应体系5 μ L 5 XPhusion Taq polymerase buffer, 2 μ L 2. 5 mM dNTP, N端片段(50ng), C 端片段(50ng)，O. 4 U Phusion Taq DNA polymerase,总体积 25 μ L ； 以上述组装产物为模版，以Pl和Ρ4为引物扩增全长的serpin cDNA序列，克隆进pEASY-Blunt载体(全式金产品)；测序正确的载体命名为pEASY-serpin ； 2)融合基因的构建 设计引物P5-P7,构建Bbsp: serpin的融合基因； 引物序列如下 P5: 5，-TCTAGAGAGCTCATCGCTTGGCAACG-3，，下划线序列为 XbaI 位点； P6: 5’ -AAAAAAGCGGCCGCATGGCTCCTTTTCTTCAAACC-3’,下划线序列为 NotI 位点； P7: 5’ -GGACTAGTGCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’，下划线序列为 SpeI 位点； 以球孢白僵菌CZfeawreria Bassiana)基因组为模版，用P6和P7扩增球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchitl的信号肽，克隆进pGEM-T载体(Promega),测序验证，获得载体pGEM-Bbsp ；以pEASY-serpin为模版，用P4与P5扩增serpin基因的成熟蛋白区域，克隆进pGEM-T 载体，得 pGEM-serpin ； NotI 与 SpeI 双酶切 pGEM-Bbsp，回收 Bbsp 片段(90bp) ；XbaI 与 SmaI 双酶切pGEM-serpin,得 serpin 成熟区域片段(1362bp)。
3.—种重组蛋白的真菌表达载体，其特征在于，将权利要求2所述Bbsp (90bp)与serpin (1362bp)共同构建进 pUC-Pgpda-TtrpC,得 pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 载体，其具有融合蛋白Bbsp:serpin的表达原件,上游含有一个真菌组成性启动子Pgpda,下游含有一个终止子TtrpC。
4.一种重组蛋白的杀虫真菌剂，其特征在于，将权利要求3所述的载体pUC-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 用 XbaI 单酶切，得融合蛋白 Bbsp: serpin 的表达原件Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC 片段(4. 4kb)，构建进真菌表达载体 pK2_BAR:GFP，得 pK2_BAR:GFP-Pgpda-Bbsp: serpin-TtrpC质粒并转入根癌农杆菌LBA4404 ;利用根癌农杆菌介导的遗传转化法得到组成性表达Bbsp: serpin的杀虫真菌转化子。
全文摘要
重组丝氨酸蛋白酶抑制子、真菌表达载体及其杀虫真菌剂。本发明涉及一种重组丝氨酸蛋白酶抑制子，采用分子生物学技术构建一个重组核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌(Beauveriabassiana)几丁质酶的信号肽序列与编码果蝇的丝氨酸蛋白酶抑制子基因，其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本发明所获得的重组丝氨酸蛋白酶抑制子具有可以抑制昆虫的免疫反应，增强真菌在血腔中的增殖速度，从而提高杀虫真菌毒力的特性。
文档编号C12N15/62GK103030692SQ20121058211
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者范艳华, 裴炎, 杨琳芝, 张永军, 金丹, 罗志兵, 李先碧 申请人:西南大学