专利名称：四种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gal I inarum)的三重实时突光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
沙门氏菌(Salmonella)属肠杆菌科，是人类重要的肠道致病菌，也可在动物肠道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙门氏菌有2500多个血清型，我国发现了 200多个血清型。沙门氏菌所致的疾病主要有两大类。一类是伤寒和副伤寒，由伤寒或副伤寒沙门氏菌引起，偶见由其他沙门氏菌引起伤寒样的感染，如猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gal I inarum)是鸡的重要致病菌,主要引起鸡伤寒(fowl typhoid)。食品中沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法，该方法需选择性增菌培养、生化鉴定、血清分型，通常要5-6天才能得出检测结果，不利于及时诊断、查找病源，控制病情的蔓延。沙门氏菌的传统方法鉴定需要经过病原的初步分离、生化鉴定并结合血清学分型，然后不同血清型之间发生的交叉反应会干扰血清学诊断的准确性。如肠炎沙门氏菌菌毛蛋白在沙门氏菌D群血清 型中仍有编码。用该菌毛蛋白进行的凝集试验常与鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等发生交叉凝集，即使是应用SEF14菌毛抗原制成的纯化单克隆抗体进行胶乳凝集试验，仍与都柏林沙门氏菌发生交叉反应，从而使传统的检测方法中存在一定比例的假阳性等问题。随着分子生物学技术的发展，已有针对irwA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEF14、sefA、sdf、ssaQ、fimY 等为目标基因，用普通 PCR 或实时突光PCR检测沙门氏菌的报道，但以上述序列作为目的片段的PCR法，只能检测到一部分Sa血清型或其毒力基因，不能同时得出所检测沙门氏菌属的血清型、毒素分泌类型等。目前也有商业化的杜邦公司生产的Bax系统，该系统利用荧光PCR技术从属的水平上检测沙门氏菌，具有较高的特异性，但不能对沙门氏菌进行分型。为目的基因设计引物，建立了多重PCR检测沙门氏菌(Salmonella spp)、SE (Enteritidis)、伤寒Sa (Typhi)、ST (Typhimurium)的方法,应用于鸡肉中的沙门氏菌检测，KIM等也根据鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的特异序列设计多对弓丨物，建立了多重PCR检测鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的方法，均得到较好的效果，但上述方法需通过凝胶电泳判定结果，操作较为繁琐。EdelO’Regan等用flic、sefA、sdf、acek基因设计引物探针，用多重荧光PCR方法检测 Enteritidis, Gallinarum, Typhimurium, Kentucky 和 Dublin 沙门氏菌，但 sefA 为目的基因无法准确区分Enteritidis, Gallinarum和Dublin, flic为目的片段则无法区分Typhimurium和Kentucky，DavidFde等用普通PCR和应该光PCR来检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，但该研究也未对荧光PCR扩增体系的扩增效率等进行系统的评价。因此，建立快速检测猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌的方法，对于食品中沙门氏菌的检测、预防与控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、可靠、灵敏度高、特异性强的猪霍乱沙门氏菌(SC)、丙型副伤寒沙门氏菌(SP)、伤寒沙门氏菌(ST)、鸡伤寒沙门氏菌(SG)三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次实时荧光PCR扩增就能判断样品是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。本发明用猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列(GenBank AE017220.1)、伤寒沙门氏菌的特异序列(GenBank NC_016832.1 )、鸡伤寒沙门氏菌的特异序列(GenBank:HQ703462)、猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列(GenBank CP000857)分别设计检测引物和检测探针，猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列用于检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测伤寒沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测鸡伤寒沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列用于区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，利用基于Taqman探针的三重实时荧光PCR方法，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一实时荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，达到简便、快速、可靠、灵敏度高和特异性强的目的，从而实现了本发明的目的。本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测弓I物如下所示针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列SCF 5' -GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ;(如 SEQ ID NO.1 所示)SCR 5' -GG TGCAGATAACTCCAACAGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 2 所示) 针对伤寒沙门氏菌特异序列STF 5' -GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)STR 5' -CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列SGF :5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)SGR :5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3'。(如 SEQ ID NO. 6 所示)针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列SPF 5' -AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)SPR 5' -TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ；(如 SEQ ID NO. 8 所示)。本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针SCP 5' -AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)伤寒沙门氏菌特异序列的探针STP 5' -ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ;(如 SEQ ID NO. 10 所示)
鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针SGP 5' -ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ;(如 SEQ ID NO. 11 所示)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针SPP 5' -AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ;(如 SEQ ID NO. 12 所示)探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，四个探针的5'端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。所述的荧光报告基因优选为FAM、HEX、TET或R0X，所述的荧光淬灭基团优选为TAMARA 或 BHQI。本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光PCR反应液、UNG酶、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括四对(I)针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列SCF 5' -GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ;(如 SEQ ID NO.1 所示)SCR 5' -GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)(2 )伤寒沙门氏菌特异序列STF 5' -GTGG CTATGCAGTGAAAATGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)STR 5' -CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)(3 )鸡伤寒沙门氏菌特异序列SGF :5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)SGR :5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3'。(如 SEQ ID NO. 6 所示)(4)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列SPF 5' -AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)SPR 5' -TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ；(如 SEQ ID NO. 8 所示)所述的检测探针包括(I)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针SCP 5' -AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)(2 )伤寒沙门氏菌特异序列的探针STP 5' -ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ;(如 SEQ ID NO. 10 所示)(3 )鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针SGP 5' -ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ;(如 SEQ ID NO. 11 所示)(4)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针SPP 5' -AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ;(如 SEQ ID NO. 12 所示)探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，四个探针的5'端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。本发明的非疾病的诊断和治疗目的的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；(2)使用上述针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列、伤寒沙门氏菌特异序列和鸡伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物及检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)；(4)根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，判断样品中是否含有猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌；(5)上述步骤(4)得出的样品检测结果中如果扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，则以步骤(I)所提取的增菌液中菌体的基因组DNA作为模板，使用上述针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测引物和检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行单一实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)，根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，区分样品中的猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。所述的样品优选为食品。所述的步骤(2)的扩增反应体系优选为模版DNA3 U L，IOXTaqMan缓冲液4 yl，5mmol/LMgCl22u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，三种 20 y mol/L 检测探针 SCP，STP 和 SGP 各Iil 1，共 1，六条 20iimol/L 检测引物 SCF、SCR、STF、STR、SGF 和 SGR 各 I y 1，共 6 y 1，0.55U UNG 酶 0.2 ii 1,2. 5U/U I Taq 聚合酶 3 ii 1，去离子水 5.1。所述步骤(3)的进行实时荧光PCR反应，其反应参数优选为95°C 30s、95°C 5s、60°C 34s、40个循环。结果判断标准以荧光PCR检测扩增曲线指数期明显，且Ct〈37为阳件判定原则，如果扩增曲线指数期明显且Ct〈35可直接判定为阳性，如果Ct值在35 37之间判断为可疑，需要加大模板量进行重复实验，若出现指数期明显的扩增曲线方可判定为阳性，否则为阴性。所述步骤(5)的扩增反应体系优选为模版DNAlii L，10 X TaqMan缓冲液4 iil，5mmol/LMgCl22u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，20 y mol/L针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测探针SPP和检测引物SPF、SPR各liil，0. 55U UNG酶0. 2iU，
2.5U/ U I Taq聚合酶3 U I,去离子水13. 8 U I。所述步骤(5)的进行单一实时荧光PCR反应，其反应参数优选为95°C 30s、95°C 5s,60°C 34s、40个循环。结果判断标准以荧光PCR检测扩增曲线指数期明显，且Ct〈37为阳件判定原则，如果扩增曲线指数期明显且Ct〈35可直接判定为阳性，如果Ct值在35 37之间判断为可疑，需要加大模板量进行重复实验，若出现指数期明显的扩增曲线方可判定为阳性，否则为阴性。本发明根据猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列(GenBank: AEO17220.1 )、伤寒沙门氏菌的特异序列(GenBank: NC_016832.1)、鸡伤寒沙门氏菌的特异序列(GenBank: HQ703462 )、霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列(GenBank:CP000857)分别设计检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，用猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤 寒沙门氏菌，用伤寒沙门氏菌的特异序列检测伤寒沙门氏菌，用鸡伤寒沙门氏菌的特异序列检测鸡伤寒沙门氏菌，在一次实时荧光PCR扩增反应中完成对猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的检测，再通过单一实时荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，从而简便、快速、可靠地判断样品是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的污染。以本发明的检测引物及检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，检测快速，可在31h完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为沙门氏菌进行流行病学调查提供了有利工具。适用于食品的检验检疫，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。
图1是猪霍乱沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；图2是丙型副伤寒沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；图3是伤寒沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；图4是鸡伤寒沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；图5是区别丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌荧光PCR扩增图；图6是猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释三重荧光PCR扩增图，其中，红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX ；图7是丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释三重荧光PCR扩增图，其中，红色为FAM，绿色为H EX，蓝色为TET ；图8是添加猪霍乱沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；图9是添加丙型副伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；图10是添加伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；图11是添加鸡伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；图12是添加猪霍乱沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；图13是添加丙型副伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；图14是添加伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；图15是添加鸡伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；图16是添加猪霍乱沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；图17是添加丙型副伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；图18是添加伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；图19是添加鸡伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；图20是污染了猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX ；图21是污染了猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX ；图22是污染了猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX ；图23是污染了丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX ；
图24是污染了丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX ；图25是污染了丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1菌株的选取及检测引物、检测探针的设计选取34种不同血清型沙门氏菌共142株，包括丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株I株(IQCC10527 )、丙型副伤寒沙门氏菌分离株21株(SP1-SP21)、猪霍乱沙门氏菌标准菌株I株(IQCC10502)、猪霍乱沙门氏菌分离株24株(SC1-SC24)、伤寒沙门氏菌标准菌株I株(CMCC50071)、伤寒沙门氏菌分离株30株(ST1-ST30 )、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株I株(CMCC50770)、鸡伤寒沙门氏菌分离株33株(SG1-SG33)、30株其他血清型沙门氏菌，除此之外选取变形杆菌等21株非沙门氏菌，菌株信息如表I所示。上述菌株均经API20E试剂条和血清学试验进行确证。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、广东省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、广东出入境检验检疫局技术中心。
表I实验用菌株信息表
权利要求
1.一种猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示 针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列SCF 5'-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ；SCR 5'-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ； 针对伤寒沙门氏菌特异序列STF 5'-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；STR 5'-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ； 针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列SGF 5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；SGR 5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3' ； 针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列SPF 5'-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3,；SPR 5'-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3'。
2.一种猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示 猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针SCP 5'-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ； 伤寒沙门氏菌特异序列的探针STP 5'-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ； 鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针SGP 5'-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ； 猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针 SPP 5'-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ； 探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，四个探针的5'端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基因为FAM、HEX、TET或ROX，所述的荧光淬灭基团为TAMARA或BHQl。
4.一种猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光PCR反应液、UNG酶、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括四对 (1)针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列SCF 5'-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ；SCR 5'-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ； (2)伤寒沙门氏菌特异序列STF 5'-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；STR 5'-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ； (3)鸡伤寒沙门氏菌特异序列SGF 5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；SGR 5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3' ； (4)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列SPF 5'-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；SPR 5'-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ； 所述的检测探针包括 (I)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针SCP 5'-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ； (2 )伤寒沙门氏菌特异序列的探针STP 5'-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ； (3 )鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针SGP 5'-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ； (4)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针SPP 5'-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ； 探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，三探针的5'端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
5.一种非疾病的诊断和治疗目的的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板； (2)使用权利要求1所述的针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列、伤寒沙门氏菌特异序列和鸡伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物及权利要求2所述的检测探针SCP、STP、SGP，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系； (3)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)； (4)根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，判断样品中是否含有猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌； (5)上述步骤(4)得出的样品检测结果中如果扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，则以步骤(I)所提取的增菌液中菌体的基因组DNA作为模板，使用权利要求1所述的针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测引物和权利要求2所述的检测探针SPP，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行单一实时荧光PCR反应，反应结束后,根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)，根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，区分样品中的猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。
6.根据权利要求5所述的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的样品为食品。
7.根据权利要求5所述的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的扩增反应体系为模版0嫩31^，10\1&9]\&111缓冲液411 l,5mmol/L MgCl22 u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，三种20iimol/L权利要求2所述的检测探针SCP，STP和SGP各lyl，共3^1，六条20iimol/L权利要求1所述的检测引物SCF、SCR、STF、STR、SGF和SGR各I yl，共6 yl，0. 55U UNG酶0. 2u 1,2. 5U/u I Taq 聚合酶 3 ii 1，去离子水 5. 8yl。
8.根据权利要求5所述的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的进行实时荧光PCR反应,其反应参数为95°C 30s,95°C 5s,60°C 34s,40个循环。
9.根据权利要求5所述的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)的扩增反应体系为模版DNAl ii L，10XTaqMan 缓冲液4 ii l,5mmol/L MgCl22 u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u l,20umol/L权利要求2所述的检测探针SPPl u I，权利要求1所述的检测引物SPF、SPR各I iil，0. 55UUNG 酶 0.2 ii 1,2. 5U/u I Taq 聚合酶 3 ii 1，去离子水 13.8ii I。
10.根据权利要求5所述的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)的进行单一实时荧光PCR反应，其反应参数为95°C 30s,95°C 5s,60°C 34s,40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明利用三重实时荧光PCR方法，将猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌共有序列用于检测猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测伤寒沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测鸡伤寒沙门氏菌，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，检测快速，可在31h完成从制备样品到出具检测结果的过程，结果可靠，且灵敏度高、特异性强。
文档编号C12N15/11GK103060447SQ201210581310
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者许龙岩, 袁慕云, 曹际娟, 柯碧霞, 相大鹏, 柯昌文 申请人:许龙岩, 袁慕云, 曹际娟, 柯碧霞, 相大鹏, 柯昌文