宏基因组提取方法

专利名称：宏基因组提取方法
技术领域：
本发明涉及提取宏基因组的方法，具体地涉及降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的方法。
背景技术：
宏基因组是出现在某一环境样品中的所有遗传物质，包括许多个体物种的基因组。宏基因组学是指直接从环境样品中获得遗传物质，对宏基因组进行研究的科学。随着高通量DNA测序和生物信息学的发展，宏基因组学的应用价值不断提升。通过分析宏基因组文库，可发现某环境中微生物的群体特征及相互作用规律，探讨微生物与环境的相互影响。对微生物群体DNA的测序，可筛选具有特定功能的基因，获得特殊功能的蛋白。人呼吸道每天接触到大量的病毒和细菌等微生物，对呼吸道宏基因组的研究能有效地了解各微生物群体的特征，从而帮助临床诊断和治疗。在呼吸道宏基因组中，相对于宿主人的基因组含量，病原体基因组含量一般比较小。因此，在呼吸道宏基因组测序中，为达到病原体基因组足够的序列覆盖度，消除宿主基因组的影响是非常重要的。人呼吸道样品中总DNA的质量是宏基因组测序成功与否的关键。对传染病样品，处理DNA污染的方法需要花费比较多的时间，或者收集样品时需要特殊的处理方法。一般提取DNA时，需要利用去垢剂SDS或者溶菌酶、蛋白酶K等裂解细胞，然后利用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀DNA。在提取宏基因组DNA时，由于细胞类型的多样性以及存在宿主DNA的干扰，所以需要更有效的纯化方法用于DNA的提取。人Alu 重复序列属于短散在序列(short interspersed elements, SINEs)家族。每个Alu序列的长度约280bp，具有可变的多聚A(poly-A)尾巴。Alu重复序列超过一百万条，约占人基因组的10%，已经被用于人类某些遗传疾病的分析。Alu重复序列是不同的，可被分为几个亚家族，是极好的标志物，可被用于检测人类基因组。Alu作为特异的探针，使用PCR技术，可以定量人基因组DNA。在人类基因组中，许多新的Alu序列被发现，并且大部分序列在其他灵长类基因组中不存在，因此依据特异Alu重复序列的分析可作为人类DNA鉴定和定量的有利方法。链霉亲和素包被的磁珠，目前已经广泛应用于生物素化核酸、抗体或其他生物素化配体及靶分子分离和处理。直径为2. 8 μ m的超顺磁珠，具有共价连接到表面并另外用BSA封闭的单层重组链霉亲和素。由于具有单层的链霉亲和素，绝大多数生物素结合位点在空间上不仅可以结合游离生物素，而且还可以结合生物素化的配体。它们显示出快速液相反应动力学特性，并且形状确定的特异性表面便于进行高效捕获、分离和下游操作。实时突光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction,简称 Real-timePCR,也被称为 quantitative Real-time polymerase chain reaction,简称 Q-PCR),是基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)的分子生物学技术,该技术可以对目标片段进行扩增的同时对目标DNA分子进行定量分析。实时荧光定量PCR使用特异的探针序列或者引物，随着扩增过程中DNA模板量的增加，释放出的荧光强度也在增加，因此实时荧光定量PCR可以利用较少的样品，动态检测初始目标DNA的含量。

发明内容
本发明目的在于提供一种提取人类宏基因组的方法，该方法利用探针杂交消减法，能够有效降低宿主宏基因组中宿主DNA背景干扰。本发明第一方面，提供了一种宏基因组提取方法，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。根据本发明的实施方式，所述探针与所述宿主基因组DNA样品杂交后与所述磁珠偶联。根据本发明的实施方式，提供了一种宏基因组提取方法，包括步骤
1)将标记有生物素的所述探针与提取的所述宿主宏基因组DNA样品进行杂交；
2)用包被有链霉亲和素的所述磁珠捕获探针与所述宿主DNA的复合体，并用磁力架分离磁珠-探针-目标DNA复合物；
3)将去除所述磁珠-探针-目标DNA复合物的杂交液以及杂交后的磁珠清洗液进行纯化回收DNA。根据本发明的实施方式，所述探针与所述磁珠偶联后与所述宿主基因组的杂交。根据本发明的另一个实施方式，提供了一种宏基因组提取方法，包括步骤
1)利用包被有链霉亲和素的所述磁珠与标记生物素的所述探针偶联；
2)将偶联好的复合物与所述宿主宏基因组DNA样品杂交；
3)去除磁珠-探针-目标DNA复合物，对杂交液和杂交清洗液进行纯化回收DNA。根据本发明的实施方式，所述的宏基因组提取方法中，在偶联温度下使用多种正反向探针。使用多种正反向探针，可扩大探针与宿主DNA杂交时结合的范围，同时可以充分饱和磁珠上的链霉亲和素位点，提高磁珠的利用效率。根据本发明的实施方式，所述的宏基因组提取方法中，在杂交完成之后，对所述磁珠-探针-DNA复合物进行加热或者氢氧化钠法变性，回收偶联有探针的磁珠。回收回收偶联有探针的磁珠，可降低实验成本。根据本发明的实施方式，针对人基因组Alu重复序列家族设计探针，通过这些探针杂交消减，达到减少人体DNA在样品中比例的目的。其中探针以多种Alu重复序列家族以及其两端的保守序列为模板，双向设计探针，探针长度在4(T70nt之间，且5’端修饰有生物素。探针序列可选自序列表SEQ ID NO:1 139的人Alu序列。利用人特异的Alu序列，消除呼吸道样品中宿主人基因组的影响，对高通量宏基因组测序有非常显著的帮助。本发明第四方面提供了呼吸道样品处理方法，针对不同取样方法、样品物理性质，采用稀释液化、离心收集等方法，最大效率富集样品中的细胞。

该方法不仅适用于用于人呼吸道宏基因组学研究，也适用于人体其他部位例如口腔、消化道、皮肤、生殖道宏基因组学研究，可以有效降低人DNA的高背景干扰，从而有效富集微生物DNA，减少宿主DNA背景引起的测序数据浪费，提高有效数据的产出量，更深入的挖掘宏基因组中微生物信息。


图1为支气管及肺泡灌洗液与气道分泌物总DNA凝胶电泳图。图2为质粒标准品绘制的qPCR标准曲线。图3为实施例1中混合样品原液、杂交液回收液以及磁珠清洗液中质粒qPCR绝对定量扩增曲线。3组曲线簇自左至右分别代表模拟混合DNA原样，杂交液BW，清洗液W，横线表示阈值线。
具体实施例方式实验例支气管肺泡灌洗液(BAL)、气道分泌物以及全血总DNA提取 一、支气管肺泡灌洗
对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶(B4或B5)或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行灌洗。首先在要灌洗的肺段经活检孔通过细硅胶管注入2%利多卡因f 2ml，做灌洗肺段局部麻醉；然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入37°C灭菌生理盐水。每次25 50ml，总量10(T250ml，一般不超过300ml ;立即用5(Tl00mmHg负压吸引回收灌洗液，通常回收率为40%飞0% ;将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液，并记录总量；装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附)，置于含有冰块的保温瓶中。二、气道分泌物吸引
选择合适的吸痰管，吸痰管的外径不应超过气管导管内径1/2 ;检查吸痰装置是否完好，吸引负压应不超过-50mmHg ;清洁口腔之后进行纯氧膨肺，气道灌洗。阻断吸痰管负压，将吸痰管插入气管导管作，吸痰后吸净口咽部分泌物。，达到气管导管末端时上提O. 5cm开放负压，旋转上提；吸痰动作轻柔、迅速，每次吸痰时间不超过15秒；严格无菌操作。三、仪器与试 剂准备
ABI 7500 实时突光定量 PCR 仪(Applied Biosystems, Life Technologies 公司)。Qubit 2· O 突光定量仪(Invitrogen, Life Technologies 公司)。蛋白酶K :将100 mg蛋白酶K溶于5 mL双蒸水,配制成20 mg/ml的溶液，-20°C保存。IL PBS 缓冲液(ρΗ7· 4)
磷酸二氢钾(KH2PO4)(购自北京化工厂)，0.27g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)(购自西陇化工)，1. 42g 氯化钠(NaCl)(购自西陇化工)，8g 氯化钾(KCl)(购自北京化工厂)，0.2g
加去离子水约800 mL充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调pH至7. 4,最后定容到1L,高
温高压灭菌后室温保存。DNA 提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN，货号 51306)。四、提取步骤
1、取灌洗液收集l 5ml，13000rpm离心浓缩10分钟，弃上清，加入等体积PBS稀释，辅助溶解分散，对于粘稠的气道分泌物，需要先用2 3倍体积PBS进行稀释，轻柔混匀进行匀质化；
2、准备若干1.5ml离心管，每管加入50μ I蛋白酶K于管中；3、每管加入500μ I稀释分散后的呼吸道分泌物样品，不足500 μ I用PBS补足；
4、每管加入500 μ I buffer AL (QIAamp DNA Mini Kit)，轻柔混匀 15 秒后置于 56°C水浴锅中，孵育10分钟；
5、取出后,快速离心,将管壁与管盖上的液滴收集回管内，加入500μ I无水乙醇,涡旋混匀15秒，快速离心后，将管内全部混合物转移至离心柱中(可分两次进行)，SOOOrpm离心I分钟，转移离心柱至新离心管中；
6、加入500μ I buffer AW1，8000rpm离心I分钟，弃掉管内液体;
7、加入500μ I buffer AW2，14000rpm离心3分钟，弃掉管内液体后，空甩I分钟；
8、转移离心柱至1.5ml新离心管中，加入30 μ I双蒸水，室温放置2分钟后，8000rpm离心一分钟。提取出的总DNA，经过琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1，M DL2000,条带由大到小为2000bp, IOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp0泳道I和泳道2为气道分泌物提取获得的DNA，浓度分别为72ng/ μ 1，15ng/ μ I ;泳道3和泳道4为支气管肺泡灌洗液提取获得的DNA，浓度均为2Ing/μ I。从图1可看出基因组DNA条带完整。 图2为质粒标准品绘制的qPCR标准曲线。标准品采用BAP质粒(2. 6 kbp)5倍梯度稀释成5个浓度梯度的样品，由标准品浓度以及Ct值绘制标准曲线，用于定量分析样品中质粒含量。图中横坐标Log CO表示模板浓度，纵坐标Ct表示样品的Ct值，每个方形点表示标准样品。由此进行模拟实验中杂交前后样品中质粒的定量。

灌洗液与全血参照上述步骤进行总DNA提取。实施例杂交消减降低宏基因组DNA中宿主DNA背景
本发明利用Alu序列在人DNA中出现频率高的特点，针对Alu家族序列以及两端保守区域设计探针，5’端用生物素标记，并将不同序列的多种探针配合使用，通过联袂亲和素包被的磁珠，将杂交复合DNA捕获出来，从而减少宿主DNA在宏基因组中的背景干扰。所需试剂及母液配制
20X SSPE :称取210. 6g NaCl (购自西陇化工)，27. 6g NaH2PO4H2O (购自北京化工厂)，
5.845g EDTA(购自西陇化工)，去离子水溶解，调整pH至7. 7，定容至1L，过滤除菌分装，4°C保存。100XDenhardtJ s regent 溶液称取 2g 聚鹿糖(Ficoll,400 型，购自 Sigma), 2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，购自Sigma，P_3004)，2g BSA (购自索宝来生物科技)，加水至总体积为100ml。过滤除菌，分装成小份，_20°C贮存。20 X SSC :称取88. 2g柠檬酸钠(购自西陇化工)，175. 3g NaCl，加900ml水溶解，用NaOH (购自北京化工厂)调节pH至7.0，去离子水定容至1L，过滤除菌。 10%SDS溶液取IOgSDS (购自北京全新拓达科技),去离子水溶解,定容至100ml。IM Tris-HCl ;称取72. 66gTris_base (购自北京全新拓达科技),加入500ml去离子水，用HCl (购自北京化工厂)调节pH至7. 5，定容至600ml。50mM EDTA溶液称取1. 86gEDTA溶于IOOml去离子水。4M NaCl溶液称取23. 376gNa0H溶于IOOml去离子水。以上母液均用过滤法除菌。杂交液50ml2 X B&ff buffer 取 O. 5ml IM Tris-HCl (pH 7. 5)，Iml 50mMEDTA, 25ml 4M NaCl，加水至 50ml。50ml 2X 杂交液 HYB buffer :取 25ml 20X SSPE 溶液，5ml 100XDenhardtJ s 溶液，IOml 50mM EDTA, Iml 10% SDS，加水至 50ml。50ml 磁珠清洗液 wash buffer :取 2. 5ml 20 X SSC, 0. 5ml 10%SDS,加水至 50ml探针变性磁珠回收液(0. 15M NaOH):称取O. 6gNa0H，溶于IOOml去离子水中，分装保存。实施例1对模拟混合样品进行探针杂交消减(先杂交后偶联)
1、模拟混合DNA取20μ l (按人全血DNA与2815bp质粒按照纳克量9 1混合，总量约100ng/μ l)于200 μ I管中，置于PCR仪中95°C预热5分钟，65°C 5分钟；取27 μ l 2X杂交液HYB置于PCR仪中65°C预热5分钟；
2、取序列号为SEQID NO Γ70的探针各O.1 μ 1，约70pmol，65°C预热2分钟；
3、混合上述体系共54μ1，65°C，杂交1小时；
4、取磁珠M-280 (invitrogen) 30 μ l,用 2XB&W buffer 清洗 2 次，弃上清，用 54 μ l2XB&W重悬；
5、将杂交体系(54μ l)加入磁珠中，混匀，室温下(20°C 25°C)孵育15分钟，期间轻弹
管壁，混匀；
6、磁珠结合过程结束之后，将1.5ml离心管置于磁力架上，室温放置广2分钟，待磁珠吸附到管壁之后，吸取上清保留，标记为BW ；
7、用100μ lwash buffer，轻轻吹打清洗磁珠，然后置于磁力架上静止，上清吸出保留标记为W，再重复2次；
8、用ΙΟΟμΙwash buffer,轻轻吹打清洗磁珠,然后置于磁力架上静止,上清吸出保留标记为W，再重复2次；将回收回来的杂交液BW与wash buffer清洗之后的回收液W用Qiagen PCR 纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit，QIAGEN，货号 28106)柱回收DNA，5μl洗脱0嫩。磁珠可按如下的方法保存20μ I O. 15Μ NaOH溶液重悬磁珠，室温下孵育10分钟，置于磁力架上广2分钟后去除上清，加30μ I 1 X B&ff buffer溶液，4 °C保存磁珠。磁珠用50 μ l1 X SSC溶液清洗之后，加入50 μ L 1 X SSC重悬磁珠，95°C孵育5分钟，置于磁力架上静置广2分钟后，移除上清，加入30 μ L 1XB&W溶液保存。实施例2对呼吸道灌洗液样品总DNA进行探针杂交消减(先杂交后偶联)
除了在实施例1步骤I中，选用人呼吸道灌洗液样品DNA、取2Χ杂交液HYB 32μ1、步
骤2中取序列号为SEQ ID NO Γ4的探针各3 μ I(约120pmol )、步骤4中用64 μ I 2 XB&ff重悬以外，以与实施例1中相同的方法和条件进行先杂交后偶联探针杂交消减。实施例3对模拟混合样品进行探针杂交消减(先偶联后杂交)
1、取磁珠M_280(invitrogen)30 μ I,用 2XB&W buffer 清洗 2 次，弃上清，加入 15 μ I2 X B&ff buffer重悬磁珠；
2、向重悬的磁珠中加入序列号为SEQID NO 7Γ139的探针各O.1 μ I (约70pmol)以及8 μ I ddH20，室温下孵育15分钟，期间轻旋混匀；置于磁力架室温放置f 2分钟，去上清；
3、模拟混合DNA取20μ I (按人全血DNA与约2. 6kbp质粒按照纳克量9 I混合，总量约IOOng/μ I)于200 μ IPCR管中，置于PCR仪95°C预热5分钟，65°C 5分钟；取26μ I
2X杂交液HYB置于PCR仪中65°C预热5分钟；4、将混合DNA和杂交液加入磁珠中，混匀，置于PCR仪中65°C，杂交I小时，期间间隔混
匀；
5、杂交结束之后步骤参照实施例1的步骤6-8。实施例4对呼吸道灌洗液样品总DNA进行探针杂交消减(先偶联后杂交)
除了步骤2中加入12种序列号为SEQ ID NO :1 12的探针各1μ l(120pmol)以及3μ I水、步骤3中取人呼吸道灌洗液样品DNA样品20 μ I外，以与实施例3中相同的方法和条件进行先偶联后杂交探针杂交消减。检测例I测定杂交消减前后宿主DNA的降低
利用实时荧光定量PCR进行绝对定量分析，测定杂交消减前后混合样品中质粒DNA的含量差异，以及人DNA与质粒DNA的比例差异。实时荧光定量PCR试剂采用THUNDERBIRDProbe qPCR Mix(Toyobo)，选取质粒上特定序列设计的序列号为SEQ ID NO :142和SEQ IDNO :143的引物和序列号为SEQ ID NO :144的探针，探针的5’端标记FAM荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭集团。依照THUNDERBIRD Probe qPCR Mix说明书进行Realtime-PCR实验。通过标准样对杂交前后质粒DNA的含量进行绝对定量，每个样品3个重复样。Q-bit荧光定量测定DNA样品的总DNA含量之后，用总量减去质粒DNA量，即为人DNA含量，测定以ng为单位，结果见表I。图3为实施例1中混合样品 原液、杂交液回收液以及磁珠清洗液中质粒qPCR绝对定量扩增曲线。3组曲线簇自左至右分别代表模拟混合DNA原样，杂交液BW，清洗液W。绿色横线表示阈值线，阈值线与扩增曲线相交处对应的循环数即为Ct值，通过Ct值可以比较计算初始DNA模板量。Ct值越小，初始模板浓度越大，结合DNA溶液体积即可计算初始模板总量。经过实时荧光定量PCR对混合DNA原液和杂交回收液中的质粒进行绝对定量分析，合并BW和W纯化回收之后得到的质粒量。实施例1中，质粒回收效率约为初始混合DNA中质粒的91%，杂交之后人与质粒DNA量(ng)比例约为1:1 ;实施例3中，质粒回收效率约为初始混合DNA中质粒的83. 5%，杂交之后人与质粒DNA量(ng)比例约为O. 92 1，能够有效减少人DNA的含量，结果见表I。表I定量分析实施例1和3中杂交前后的质粒DNA和人DNA含量及比例。
权利要求
1.一种宏基因组提取方法，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。
2.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针与所述宿主基因组DNA样品杂交后与所述磁珠偶联。
3.根据权利要求2所述的宏基因组提取方法，其特征在于包括步骤 1)将标记有生物素的所述探针与提取的所述宿主宏基因组DNA样品进行杂交； 2)用包被有链霉亲和素的所述磁珠捕获探针与所述宿主DNA的复合体，并用磁力架分离磁珠-探针-目标DNA复合物； 3)将去除所述磁珠-探针-目标DNA复合物的杂交液以及杂交后的磁珠清洗液进行纯化回收DNA。
4.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针与所述磁珠偶联后与所述宿主基因组的杂交。
5.根据权利要求4所述的宏基因组提取方法，其特征在于包括步骤 1)利用包被有链霉亲和素的所述磁珠与标记生物素的所述探针偶联； 2)将偶联好的复合物与所述宿主宏基因组DNA样品杂交； 3)去除磁珠-探针-目标DNA复合物，对杂交液和杂交清洗液进行纯化回收DNA。
6.根据权利要求1飞的任一项所述的宏基因组提取方法，其特征在于在偶联温度下使用多种正反向探针。
7.根据权利要求3或5所述的宏基因组提取方法，其特征在于杂交完成之后，对所述磁珠-探针-DNA复合物进行加热或者氢氧化钠法变性，回收偶联有探针的磁珠。
8.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针选自序列表中的序列 SEQ ID NO 1 至序列 SEQ ID NO :139。
9.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述宿主宏基因组DNA样品取自人呼吸道、口腔、消化道、皮肤或生殖道。
全文摘要
本发明公开了宏基因组提取方法，所述方法利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA。所述方法利用宿主DNA中的重复序列Alu序列及其两端保守序列作为模板，设计单向或者双向探针，其中每条探针的5’端以生物素修饰，使用包被有链霉亲和素的磁珠捕获与探针杂交的宿主DNA，以达到减弱宏基因组中宿主DNA背景、提高测序数据有效率的目的。
文档编号C12N15/10GK103060309SQ20121058061
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年9月25日
发明者任鲁风, 王绪敏, 楚亚男, 高静, 谷岚, 隋硕, 康禹, 徐力, 袁丽娜, 张奕杰, 高占成, 于军 申请人:中国科学院北京基因组研究所, 北京大学人民医院