专利名称：提取堆肥宏基因组dna的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。
背景技术：
堆肥本身含有较多的抑制因子，且堆肥过程中产生大量腐植酸，这些物质会对总 DNA(宏基因组DNA)的提取产生强烈的影响，很难提取到可以作为PCR扩增模板的总DNA。反硝化细菌(denitrifying bacteria)，是硝化和反硝化研究中非常重要的一种细菌。传统的反硝化细菌筛选方法是使用培养基进行培养接种，单培养周期就要14天，整个筛选过程一般需要两周以上，耗时太长，且准确性很差。而且环境中的微生物99%是不可培养的，传统的筛选方法大大限制了人们对土壤微生物资源及其基因资源的研究与利用。对反硝化细菌的研究可有助于堆肥过程中反硝化菌的衍替情况进行研究，进一步了解堆肥过程中硝化和反硝化的过程，有助于更深入地了解堆肥发生的机理，从而更好地实现对其技术的控制和优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。本发明提供的提取堆肥宏基因组DNA的方法，包括如下步骤(1)将堆肥样品和DNA提取液置于离心管中进行物理裂解；所述物理裂解包括2-4 次如下步骤液氮处理10-20min (如10_15min或15_20min)，然后63-67°C (如63_65°C或 65-67 0C )水浴融化；(2)在完成步骤(1)的离心管中加入溶菌酶，36-380C (如36-37°C或37-38°C )水浴 25-35min (如 25_30min 或 30_35min)；(3)在完成步骤(2)的离心管中加入蛋白酶K, 36-380C (如36_37°C或37-38°C ) 水浴 25-35min (如 25_30min 或 30_35min)；(4)在完成步骤(3)的离心管中加入18-22g/100ml (如18_20g/100ml或 20-22g/100ml)的 SDS 水溶液，63-67 "C (如 63-65 "C 或 65-67 "C )水浴 100_140min (如 100-120min 或 120_140min)；(5)将完成步骤(4)的离心管 18-22°C (如 18_20°C或20_22°C )、12000_14000g (如 12000-13000g 或 13000-14000g)离心 13_17min (如 13_15min 或 15_17min)，收集上清液；(6)在完成步骤(5)的离心管中加入DNA提取液和18_22g/100ml (如 18-20g/100ml 或 20_22g/100ml)的 SDS 水溶液，63-67 "C (如 63-65 "C 或 65-67 "C ) 水浴 8-12min(如 8-lOmin 或 10_12min)，然后 18-22 "C (如 18-20 "C 或 20-22 "C )、 12000-14000g(如 12000-13000g 或 13000_14000g)离心 13_17min(如 13_15min 或 15-17min)，收集上清液；
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(7)将步骤(5)的上清液和步骤(6)的上清液合并；(8)将步骤(7)的上清液和酚-氯仿-异戊醇混合液等体积混合，混勻后 18-220C (如 18-20°C或 20-22°C )、12000_14000g(如 12000_13000g 或 13000_14000g)离心8-iaiiin (如8-lOmin或10-iaiiin)，收集上清液；所述酚-氯仿-异戊醇混合液是将25 体积份苯酚、M体积份氯仿和1体积份异戊醇混合得到的；(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混勻，18-220C (如18_20°C或20_22°C )沉淀 50-70min(如50-60min或60-70min)，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA ；步骤⑶的上清液和异丙醇的体积比为1 0.5-0.7(1 0.5-0. 6或1 0.6-0.7)。所述步骤(1)中，所述物理裂解可包括3次如下步骤液氮处理15min，然后65°C 水浴融化。所述步骤O)中，所述36-38°C水浴25-35min具体可为37°C水浴30min。所述步骤(3)中，所述36-38°C水浴25-35min具体可为37°C水浴30min。所述步骤中，所述SDS水溶液的浓度具体可为20g/100ml，所述63_67°C水浴 100-140min 具体可为 65°C水浴 120min。所述步骤(5)中，所述18-22 °C、12000-14000g 离心 13_17min 具体可为 20°C、 13000g 离心 15min。所述步骤(6)中，所述SDS水溶液的浓度具体可为20g/100ml，所述63_67°C水浴 8-12min 具体可为 65°C水浴 IOminJjfi^ 18-22°C、12000_14000g 离心 13_17min 具体可为 20°C、13000g 离心 15min。所述步骤(8)中，所述18-22 "C、12000-14000g 离心 8_12min 具体可为 20 °C、 13000g 离心 IOmin0所述步骤(9)中，所述18-22°C沉淀50-70min具体可为20°C沉淀60min，步骤(8) 的上清液和异丙醇的体积比具体可为1 0.6。所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量具体可为4g，所述DNA提取液的体积为 10-15ml。所述步骤⑵中，所述溶菌酶的加入量为1. 6-2. 4mg (如1. 6_2mg或2-2. 4mg)。所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量为0. 8-1. 2mg(如0. 8_lmg或1-1. 2mg)。所述步骤中，所述SDS水溶液的加入量为2-3ml (如2-2. 5ml或2. 5-3ml)。所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量为4_5ml (如4-4. 5ml或4. 5_5ml)，所述SDS水溶液的加入量为0. 3-0. 7ml (如0. 3-0. 5ml或0. 5-0. 7ml)。所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量具体可为4g，所述DNA提取液的体积具体可为 13. 5ml ο所述步骤O)中，所述溶菌酶的加入量具体可为ang。所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量具体可为lmg。所述步骤中，所述SDS水溶液的加入量具体可为2. 5ml。所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量具体可为4. 5ml，所述SDS水溶液的加入量具体可为0. 5ml。所述DNA提取液的具体配方如下含0. IM Tris-HCUO. IM EDTAU. 64g/100ml的 Na3PO4,8. 775g/100ml的NaCl和lg/100ml的CTAB,其余为水。所述DNA提取液的pH具体可为8. 0。本发明提供的方法可以高效提取堆肥样本的宏基因组DNA，且用时较短G小时内)。采用本发明的方法从堆肥样本中提取得到的宏基因组DNA可以作为PCR扩增的模板进行有效扩增。本发明还保护所述方法在鉴定堆肥样本中的反硝化细菌中的应用。本发明同时保护一种鉴定堆肥样本中的反硝化细菌的方法，包括如下步骤以堆肥样本的宏基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序，根据测序结果鉴定堆肥样本中的反硝化细菌；所述堆肥样本的宏基因组DNA是采用上述任一方法提取得到的。每50 μ L 所述 PCR 扩增的反应体系中含有 IO-IOOpmol (10_50pmol 或 50-100pmol) 序列表的序列1所示的DNA片段、IO-IOOpmol (10-50pmol或50_100pmol)序列表的序列2 所示的DNA片段。每50 μ L所述PCR扩增的反应体系具体包括2 μ L所述模板、 IO-IOOpmol (10-50pmol或50_100pmol)序列表的序列1所示的DNA片段、 IO-IOOpmol (10-50pmol 或 50_100pmol)序列表的序列 2 所示的 DNA 片段、4 μ L dNTP、2. 5U Taq 酶、5 μ g BSA，其余为 IXPCR buffer 所述PCR扩增的程序具体可为94°C预变性^iin ；94°C变性30s、52°C退火30s、 72°C延伸90s, 30个循环；72°C延伸IOmin0以上任一所述堆肥可为畜禽粪便堆肥，具体可为鸡粪、猪粪等畜禽粪便与锯末混合发酵得到的堆肥。本发明对于研究不同发酵时间的堆肥样本中的细菌种类(特别是反硝化细菌种类)具有很高的应用价值。本发明为堆肥的研究和应用，以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。
图1为鸡粪堆肥提取的宏基因组DNA的电泳照片。图2为鸡粪堆肥提取的宏基因组DNA纯化回收后的电泳照片。图3为以鸡粪堆肥提取的宏基因组DNA为模板的PCR扩增产物的电泳照片。图4为猪粪堆肥提取的宏基因组DNA的电泳照片。图5为猪粪堆肥提取的宏基因组DNA纯化回收后的电泳照片。图6为以猪粪堆肥提取的宏基因组DNA为模板的PCR扩增产物的电泳照片。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。蛋白酶K=Sigma公司，产品号为P6556。溶菌酶Sigma公司，产品号为L6875。DNA 提取液(100ml 体系)含 0. IM Tris-HCl (pH8. 0),0. IM EDTA(pH8.0)、1. 64g/100ml 的 Na3PO4,8. 775g/100ml 的 NaCl 和 lg/100ml 的 CTAB，其余为水。实施例1、堆肥宏基因组DNA的提取及其在鉴定反硝化细菌中的应用一、鸡粪堆肥的制作将25kg鸡粪、12. 3kg锯末与13kg水混合，该混合物的C/N为25_30、水分含量为 55-60%，将该混合物室温(23°C左右)发酵20天。鸡粪取自中国农业大学鸡场，锯末取自北京市海淀区永丰木器厂，物料性质见表 1。表1堆肥原料的基本性质
权利要求
1.一种提取堆肥宏基因组DNA的方法，包括如下步骤(1)将堆肥样品和DNA提取液置于离心管中进行物理裂解；所述物理裂解包括2-4次如下步骤液氮处理10-20min，然后63_67°C水浴融化；(2)在完成步骤(1)的离心管中加入溶菌酶，36-38°C水浴25-35min；(3)在完成步骤O)的离心管中加入蛋白酶K，36-38°C水浴25-35min;(4)在完成步骤(3)的离心管中加入18-22g/100ml的SDS水溶液，63-67V水浴 100-140min ；(5)将完成步骤(4)的离心管18-22°C、12000-14000g离心13-17min，收集上清液；(6)在完成步骤(5)的离心管中加入DNA提取液和18-22g/100ml的SDS水溶液， 63-67°C水浴 8-12min，然后 18_22°C、12000-14000g 离心 13_17min，收集上清液；(7)将步骤(5)的上清液和步骤(6)的上清液合并；(8)将步骤(7)的上清液和酚-氯仿-异戊醇混合液等体积混合，混勻后18-22°C、 12000-14000g离心8-12min，收集上清液；所述酚-氯仿-异戊醇混合液是将25体积份苯酚、M体积份氯仿和1体积份异戊醇混合得到的；(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混勻，18-22°C沉淀50-70min，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA;步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1 0.5-0.7。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述物理裂解包括3次如下步骤液氮处理15min，然后65°C水浴融化；所述步骤⑵中，所述36-38 °C水浴25-35min为37°C水浴30min ；所述步骤⑶中，所述36-38 °C水浴25-35min为37°C水浴30min ；所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的浓度为20g/100ml，所述63_67°C水浴100-140min 为 65 °C 水浴 120min ；所述步骤(5)中，所述 18-22 °C、12000-14000g 离心 13_17min 为 20°C、13000g 离心 15min ；所述步骤(6)中，所述SDS水溶液的浓度为20g/100ml，所述63_67°C水浴8-12min为 65°C水浴 IOminJjfii 18_22°C、12000_14000g 离心 13_17min 为 20°C、13000g 离心 15min ；所述步骤(8)中，所述 18-22 "C、12000-14000g 离心 8_12min 为 20 °C、13000g 离心 IOmin ；所述步骤(9)中，所述18-22°C沉淀50-70min为20°C沉淀60min，步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1 0.6。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量为4g，所述DNA提取液的体积为10-15ml ；所述步骤O)中，所述溶菌酶的加入量为1. 6-2. 4mg ；所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量为0.8-l.aiig;所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的加入量为2-3ml ；所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量为4-5ml，所述SDS水溶液的加入量为 0. 3-0. 7ml。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量为4g，所述DNA提取液的体积为13. 5ml ； 所述步骤O)中，所述溶菌酶的加入量为2mg ； 所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量为Img ； 所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的加入量为2. 5ml ；所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量为4. 5ml,所述SDS水溶液的加入量为 0. 5ml。
5.权利要求1至4中任一所述方法在鉴定堆肥样本中的反硝化细菌中的应用。
6.一种鉴定堆肥样本中的反硝化细菌的方法，包括如下步骤以权利要求1至4中任一所述方法提取得到的堆肥样本的宏基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序，根据测序结果鉴定堆肥样本中的反硝化细菌。
全文摘要
本发明公开了一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。本发明的方法包括如下步骤(1)将堆肥样品在DNA提取液中进行物理裂解；(2)加入溶菌酶；(3)加入蛋白酶K；(4)加入SDS水溶液；(5)离心收集上清液；(6)在步骤(5)的沉淀中加入DNA提取液和SDS水溶液，离心收集上清液；(7)将步骤(5)和步骤(6)的上清液合并；(8)酚-氯仿-异戊醇抽提；(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA。本发明对于研究不同发酵时间的堆肥样本中的细菌种类(特别是反硝化细菌种类)具有很高的应用价值。本发明为堆肥的研究和应用，以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。
文档编号C12N15/10GK102533736SQ20121005202
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者李季, 陈雅娟, 霍培书 申请人:中国农业大学